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Method Article
肝臓損傷は、不均一な細胞集団を表し、前駆細胞の増殖を伴います。この細胞区画の新規分類は、複数のサブセットの区別を可能にします。ここで説明する方法は、分析し、さらなるアッセイのために使用することができる種々のサブセットの高純度分離、フローサイトメトリーを示します。
慢性肝臓傷害の間、前駆細胞は、炎症性細胞浸潤および上皮細胞の活性化の出現を伴う小管反応と呼ばれるプロセスで展開します。そのような炎症反応中に前駆細胞集団は、大部分の組織学的分析によって、またはフローサイトメトリーベースの技術のいずれかによって、単一の表面マーカーを使用して研究されています。しかしながら、新規な表面マーカーは、細胞コンパートメント幹/肝前駆細胞内の種々の機能的に異なるサブセットを同定しました。ここで紹介する方法は、新規の表面マーカーの組み合わせを使用して、前駆細胞サブセットの分析サイトメトリー分離と詳細な流れを説明しています。また、種々の前駆細胞のサブセットは、自動磁気及びFACSソーティングに基づく方法を用いて高純度で単離することができる方法を示します。重要なことは、小説や肝臓の単純化された酵素的解離は高い生存率これらの希少な細胞集団の単離を可能にしますそれは、他の既存の方法に比べて優れています。これは、さらに、インビトロで前駆細胞を研究するため、または遺伝子発現プロファイルを分析するために、高品質のRNAを単離するために特に適切です。
肝臓再生は、主に肝細胞の自己再生能と関連しています。それにもかかわらず、慢性肝損傷は、肝細胞及び胆管1、2、3、4に分化する能力と関連している前駆細胞の活性化および拡大で起こります。慢性傷害の間、肝細胞増殖が有効でない場合、これは特に重要です。前駆細胞を標的とする多数の遺伝的追跡研究にもかかわらず、肝臓再生におけるそれらの役割は、5、6、7、8議論の余地。また、前駆細胞の活性化は、負傷9の間にそれらの正確な役割について疑問を提起肝臓で増加した線維化反応、にリンクされています、10。
前駆細胞コンパートメントの不均一な性質は、長い顕微解剖または細胞選別に基づく方法1、11を使用して単一の表面マーカーを発現する前駆細胞を単離し、遺伝子発現研究によって示唆されています。実際、最近、GP38(ポドプラニン)を使用して、新規な表面マーカーの組み合わせは明確種々のサブセット12に前駆細胞の前の単一のマーカーを結合されました。重要なことは、これらのサブセットは、それらの表面マーカー発現が異なるだけでなく、怪我12の間に機能的変化を示しただけではなく。
多数の動物モデルは、前駆細胞の活性化及び肝再生を研究するために利用されています。様々な損傷の種類は、前駆細胞12の異なるサブセットの活性化を促進すると思われます。これは、pHを説明するかもしれません人間4で観察された小管反応のenotypic発散。このように、前駆細胞の複雑な表現型および機能解析は、怪我や肝疾患における小管反応の真の意義における役割を理解することが極めて重要です。
表面マーカーの組み合わせの他に、細胞単離プロトコールにおける重要な違いは、さらに、以前の研究2に基づいて結論を複雑にします。研究のかなりの量が大きく、それらの単離プロトコルが異なる前駆細胞( 例えば、肝臓解離(酵素の組み合わせと処理の持続時間)、密度媒体、及び遠心分離スピード)の役割に対処2。希少な細胞集団とサブセットの組成物の反射のためのより良い生存可能性を提供する最適化された分離技術は、開発され、最近12公開されています。この記事の目的は、より多くのDETを提供することです技術の適切な再現を可能にするために、この肝細胞の単離手順およびサブセット解析のプロトコルをailed。さらに、プロトコルは、新しいプロトコルと比較して違いを示すために、以前の分離法との比較を含んでいます。
全ての実験手順は、ホンブルク大学医療センターの倫理や動物管理委員会の承認を得て行きました。
材料およびバッファの作製
肝臓単一細胞懸濁液の調製
フローサイトメトリーを用いた細胞数の3決意
注:細胞数を決定するために、自動細胞カウンターまたは、理想的には、以下に説明するフローサイトメトリーに基づく細胞の定量化は、代わりに、古典的ノイバウアー室ベースの方法を提案しています。ステップ2で説明した肝臓単一細胞懸濁液を大幅に異なるサイズや粒度で実質および非実質細胞(NPC)が含まれています。フローサイトメトリーを用いたNPCのゲーティングオン前方散乱、側方散乱(FSC-SSC)特性と共に、細胞破片の適切な除外が記載されているプロトコル12の成功を保証します。
前駆サブセットのFOWサイトメトリー分析のために肝臓の単一細胞懸濁液の4染色
抗体 | クローン | ホスト/アイソタイプ | ストック濃度[mg / mlで] | 希釈 |
CD64 | X54-5 / 7.1 | マウスのIgG1、κ | 0.5 | 1:100 |
CD16 / 32 | 93 | ラットIgG2aで、λ | 0.5 | 1:100 |
CD45 | 30-F11 | ラットのIgG2b、κ | 0.2 | 1:200 |
CD31 | MEC13.3 | ラットIgG2aで、κ | 0.5 | 1:200 |
ASGPR1 | ポリクローナルヤギのIgG | 0.2 | 1:100 | |
ポドプラニン | 2001年1月8日 | シリアのハムスターのIgG | 0.2 | 1:1400 |
ポドプラニン | 2001年1月8日 | シリアのハムスターのIgG | 0.5 | 1:1400 |
CD133 | Mb9-3G8 | ラットIgG1 | 0.03 | 3μL |
CD133 | 315-2C11 | ラットIgG2A、λ | 0.5 | 1:100 |
CD34 | RAM34 | ラットIgG2aで、κ | 0.5 | 1:100 |
CD90.2 | 53-2,1 | ラットのIgG2、κ | 0.5 | 1:800 |
CD157 | BP-3 | マウスのIgG2b、κ | 0.2 | 1:600 |
EpCAMの | G8.8 | ラットIgG2aで、κ | 0.2 | 1:100 |
SCA-1 | D7 | ラットIgG2aで、κ | 0.03 | 10μL |
マウスのIgG2b、κ | MPC-11 | 0.2 | ||
ラットIgG1 | RTK2071 | 0.2 | ||
ラットのIgG2b、κ | RTK4530 | 0.2 | ||
ラットIgG2aで、κ | RTK2758 | 0.5 | ||
ラットIgG2aで、κ | RTK2758 | 0.2 | ||
シリアのハムスターのIgG | SHG-1 | 0.2 | ||
シリアのハムスターのIgG | SHG-1 | 0.5 | ||
正常ヤギIgGをコントロール | ポリクローナルヤギのIgG | 1 | ||
ロバ抗ヤギIgG | ロバのIgG | 2 | 1:800 | |
ストレプトアビジン | 1 | 1:400 |
表1。
抗体 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
CD45 APC / Cy7の | ラットのIgG2b、κ 0.5μL | + | + | + | + |
CD31ビオチン | + | ラットIgG2aで、κ 0.5μL | + | + | + |
ASGPR1精製 | + | + | 正常ヤギIgGをコントロール 0.2μL | + | + |
ポドプラニンAPC | + | + | + | シリアのハムスターのIgG 1時14希釈の1μL | + |
CD133 PE | + | + | + | + | ラットIgG1 0.45μL |
ロバ抗ヤギ アレクサフルオロ488 | + | + | + | + | + |
ストレプトアビジン アレクサフルオロ405 | + | + | + | + | + |
表2。
前駆細胞の5磁気マイクロビーズベースの濃縮
複数の肝臓からの結合前駆細胞サブセットの6磁気マイクロビーズベースの自動細胞精製
注:前駆細胞のサブセットは、希少細胞集団を表しているので、複数の肝臓から細胞を結合することは、多くの場合、さらなる実験のために十分な細胞数を達成するために必要とされます。一例として、CD133 +及びGP38 +細胞の分離について説明します。
7.フローサイトメトリー細胞選別
注:任意の前駆細胞サブセットの高純度のソートは、以下に記載のプロトコルを用いて達成することができます。細胞の全体的な収率は、ステップ6に記載されたものよりもはるかに低く、遺伝子発現解析に最適です。
パラメーター | 設定 |
ノズルサイズ | 85ミクロン |
周波数 | 46.00から46.20 |
振幅 | 38.30から55.20 |
段階 | 0 |
ドロップディレイ | 28.68から28.84 |
減衰 | オフ |
最初のドロップ | 284から297 |
ターゲットギャップ | 9.-14 |
圧力 | 45 psiの |
表3。
実質及び非実質肝細胞( 図1および図2A)を含む単一細胞懸濁液中の酵素の結果の新規な混合物を使用して、肝臓の消化のためにここに提示手順。赤血球のACK-溶解後、単一細胞懸濁液の分析サイトメトリー直接流れが( 図1及び2)が可能です。ゲーティング戦略はダブレットと死細胞( 図2a)の排除を伴?...
肝臓の炎症と異なる起源の損傷は、前駆細胞の増殖および活性化2、3を伴う肝臓での再生プロセスをトリガーします。これらの肝前駆細胞は、細胞性幹有し、おそらく、様々な肝疾患の病理学的機序において重要な役割を果たす。
肝臓前駆細胞の不均一性は、長い間示唆されています。異なる表面マーカーを運ぶサブセットを?...
著者には、競合する金融利害関係を持っていません。
この作品は、VLKにアレクサンダー・フォン・フンボルト財団Sofja Kovalevskaja賞によってサポートされていました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1% stock solution |
10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5% (v/v) BSA and store on ice |
Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1,400, marks progenior cells |
Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1,400 |
CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µL, marks progenitor cells |
CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µL |
Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
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