El aislamiento y enriquecimiento de hígado progenitoras subconjuntos identificados por una combinación de marcadores de superficie Novel

Resumen

lesiones hepáticas están acompañados por la expansión de células progenitoras que representa una población heterogénea de células. clasificación Novel de este compartimento celular permite la distinción de varios subconjuntos. El método descrito aquí ilustra el flujo de análisis de citometría de alto aislamiento y pureza de varios subconjuntos que se pueden utilizar para más ensayos.

Resumen

Durante lesiones crónicas del hígado, las células progenitoras se expanden en un proceso denominado reacción ductular, que también implica la aparición de infiltrado celular inflamatorio y la activación de las células epiteliales. La población de células progenitoras durante tales reacciones inflamatorias principalmente se ha investigado el uso de marcadores de superficie individuales, ya sea por análisis histológico o por técnicas basadas en citometría de flujo. Sin embargo, nuevos marcadores de superficie identificaron varios subconjuntos funcionalmente distintos dentro de la progenitora de hígado compartimento celular / vástago. El método presentado aquí describe el aislamiento y flujo detallado análisis de citometría de subconjuntos progenitoras utilizando combinaciones de marcadores de superficie novedoso. Por otra parte, se demuestra cómo los diferentes subconjuntos de células progenitoras pueden aislarse con los métodos basados ​​en la clasificación de alta pureza utilizando automatizado magnético y FACS. Es importante destacar que, novedosos y enzimática simplificada disociación del hígado permite el aislamiento de estas poblaciones de células raras con una alta viabilidadque es superior en comparación con otros métodos existentes. Esto es especialmente relevante para el estudio de más células progenitoras in vitro o para el aislamiento de ARN de alta calidad para analizar el perfil de expresión génica.

Introducción

La regeneración hepática se asocia sobre todo con la capacidad de auto-renovación de los hepatocitos. Sin embargo, las lesiones crónicas del hígado se producen con la activación de células progenitoras y de expansión, que se han asociado con su capacidad de diferenciarse en hepatocitos y cholangiocytes ^{1, 2, 3, 4.} Esto es especialmente relevante porque, durante las lesiones crónicas, la proliferación de hepatocitos no es eficaz. A pesar de múltiples estudios de rastreo genético dirigidas a células progenitoras, su papel en la regeneración del hígado sigue siendo controvertido ^{5, 6, 7, 8.} Por otra parte, la activación de las células progenitoras se ha relacionado con una mayor respuesta fibrótica en el hígado, lo que plantea dudas sobre su papel exacto en lesiones ⁹, ^10.

La naturaleza heterogénea del compartimento de células progenitoras durante mucho tiempo ha sido sugerido por estudios de expresión génica que aislaron células progenitoras que expresan un solo marcador de la superficie celular mediante microdisección o métodos basados en la clasificación ^{1, 11.} De hecho, recientemente, una nueva combinación de marcadores de superficie utilizando GP38 (podoplanin) inequívocamente vinculada marcadores individuales anteriores de células progenitoras a diversos subconjuntos ^12. Es importante destacar que estos subconjuntos no sólo diferían en su expresión de marcadores de superficie, pero también mostraron alteraciones funcionales durante ¹² lesiones.

Múltiples modelos animales se han utilizado para investigar la activación de células progenitoras y la regeneración del hígado. Parece que los distintos tipos de lesiones promueven la activación de diferentes subconjuntos de células progenitoras ^12. Esto podría explicar la phenotypic divergencia de la reacción ductular observada en humanos ^4. Por lo tanto, los complejos análisis fenotípicos y funcionales de las células progenitoras son fundamentales para entender su papel en las lesiones y el verdadero significado de la reacción ductular en las enfermedades hepáticas.

Además de combinaciones de marcadores de superficie, las diferencias cruciales en protocolos de aislamiento de células complican aún más las conclusiones basadas en estudios anteriores ^2. Una cantidad sustancial de estudios abordaron el papel de las células progenitoras que difieren mucho en su protocolo de aislamiento (por ejemplo, la disociación de hígado (combinación de enzimas y la duración del proceso), de densidad media, y la velocidad de centrifugación) ^2. Una técnica de aislamiento optimizado, proporcionando una mejor viabilidad de las poblaciones de células raras y reflexiva de la composición subconjunto, se ha desarrollado y publicado recientemente ^12. El objetivo de este artículo es proporcionar una más detprotocolo ailed de este procedimiento de aislamiento de células del hígado y el análisis de subconjunto para permitir la reproducción correcta de la técnica. Además, el protocolo incluye una comparación con el método de aislamiento anterior para demostrar las diferencias en comparación con el nuevo protocolo.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo con la aprobación de los comités de ética y cuidado de los animales de la Universidad de Homburg Medical Center.

1. Preparación de Materiales y búferes

1. Recién preparar todos los tampones necesarios para la digestión del hígado utilizando componentes estériles y una campana laminar para evitar la contaminación bacteriana.
2. Preparar el tampón de colección (CB) mediante la mezcla de 49,5 ml de medio RPMI y 0,5 ml de suero bovino fetal (FBS; baja endotoxina, inactivado por calor) para lograr una solución al 1% (v / v). Almacenar la solución en hielo hasta su uso posterior.
   NOTA: Aproximadamente 25 ml de CB es necesaria para digerir un hígado entero.
3. Preparar el tampón de digestión (DB) utilizando los siguientes ingredientes: medio RPMI, 1% (v / v) de FBS (baja endotoxina, inactivado por calor), colagenasa P (0,2 mg / ml), DNasa I (0,1 mg / ml) y dispasa (0,8 mg / ml).
   NOTA: Aproximadamente 25 ml de DB es necesario para digerir un hígado conjunto. Pre-calentar el PP en tque 37 ° C baño de agua antes de su uso.
4. Reconstituir las enzimas a la llegada en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS; collagense P y dispasa) o en DNasa I buffer (50% (v / v) de glicerol, 1 mM MgCl _2, y Tris-HCl 20 mM; pH 7,5) , alícuotas, y almacenarlo a -20 ° C. Almacenar la DNasa I buffer a 4 ° C y usarla dentro de dos meses.

2. Preparación de hígado sola suspensión celular

1. La eutanasia a los ratones de tipo salvaje no tratados por dislocación cervical, de acuerdo con la ética locales y los comités de cuidado animal.
2. Coloque los ratones en una tabla de disección y humedecer la piel con el 70% de etanol. Con unas tijeras, abrir el abdomen con una incisión en la línea media de la piel, seguido de un Y-incisión hacia las extremidades. Abrir el peritoneo hasta el esternón con las tijeras. Con el fin de descubrir el hígado, el intestino desplazar suavemente hacia el lado derecho con un bastoncillo de algodón.
3. Con la ayuda de tijeras y pinzas, retire los lóbulos del hígado,dejando la vesícula biliar atrás, y evitar la contaminación con el tejido conectivo. Pesar el hígado y colocarlo sobre hielo en una placa de Petri que contiene HBSS.
4. Coloque los lóbulos del hígado en un plato Petri secar y cortar el tejido hepático en cubos homogéneos aproximadamente 2 mm de un lado usando un bisturí. Transferir las piezas en un tubo de centrífuga cónico de 15 ml.
5. Añadir 2,5 ml de DB al tubo cónico de centrífuga de 15 ml que contenía las piezas del hígado y lo coloca en un baño de agua a 37 ° C para iniciar el proceso de digestión (un hígado sano tarda 60-70 minutos y un hígado cirrótico tarda 80-90 minutos ).
   NOTA: Si uno toda hígado son digeridos, el hígado debe ser separado en dos tubos de 15 ml de centrífuga cónico para asegurar una buena viabilidad de las células.
6. Preparar un nuevo tubo de centrífuga cónico de 15 ml para recoger las células del hígado liberados. Colocar una poliamida 100-m de malla de filtro en la parte superior del tubo y mojar la malla con 800 l de CB. Se coloca el tubo de centrífuga cónico en hielo.
7. Mezclar el samples en el baño de agua a 37 ° C después de 5 y 10 minutos con el fin de apoyar el proceso de digestión agitando el tubo de centrífuga cónico de 15 ml que contenía las piezas del hígado.
8. 15 minutos después de comenzar la digestión, mezclar suavemente los pedazos de hígado usando una pipeta de 1.000 l con una punta de corte que permite a los pedazos de hígado para pasar a través fácilmente. Colocar los tubos de nuevo en el baño de agua y permitir que las piezas se asienten durante 2 min.
9. Eliminar el sobrenadante que contiene las células diseminadas (típicamente 2x 700 l) y añadirlo al tubo preparado en la etapa 2.6. Vuelva a colocar el sobrenadante se retiró con DB (2x 700 l) y colocarlo de nuevo en el 37 ° C baño de agua.
10. Repetir el procedimiento descrito en el paso 2.8 (típicamente a 30, 40, 50, 55, y 60 min) hasta que aproximadamente 60 a 70 min han pasado desde el inicio de la digestión. De 40 min en adelante, las piezas restantes del hígado deben ser lo suficientemente pequeños para pasar a través de una punta de pipeta de 1000-l sin cortar.
    NOTA: hígado sano es digested totalmente dentro de 60 a 70 min, mientras que el hígado fibrótico necesita típicamente 80 a 90 min. En este punto del tiempo, el tejido hepático no debe ser visible en el tubo de centrífuga cónico de 15 ml que contenía las piezas del hígado, y todas las células liberadas debe ser transferido en el tubo preparado en la etapa 2.6.
11. Al final del proceso de digestión, recoger las células y centrifugar ellos durante 8 minutos a 180 xg y 4 ° C (usando reducida aceleración / 4 y desaceleración / 2).
12. Resuspender el sedimento celular en 1 ml de cloruro de amonio-potasio (ACK) de tampón de lisis y se incuba durante 1 min a temperatura ambiente con el fin de lisar las células rojas de la sangre. Se detiene la reacción mediante la adición de 5 ml de CB, y centrifugar las células durante 8 minutos a 180 x g y 4 ° C (con reducción de la aceleración / deceleración 4 y / 2). Resuspender las células en 4 ml de CB y almacenarlos en el hielo. Contar las células, como se describe en el paso 3.
    NOTA: El sedimento celular se suelta, y por lo tanto el sobrenadante se pipetea de distancia en vez de ser decantado.

3. Determinación del recuento de células mediante citometría de flujo

NOTA: para determinar los recuentos de células, un contador de células automatizado o, idealmente, el flujo de la cuantificación de células basado citometría-se describe a continuación se sugiere en lugar del método basado en cámara de Neubauer clásica. La suspensión de hígado de una sola célula se describe en el paso 2 contiene células parenquimatosas y no parenquimatosas (APN) con diferentes tamaños y en gran medida los niveles de detalle. La exclusión adecuada de los desechos celulares junto con el sobre-gating dispersión frontal, dispersión lateral (FSC-SSC) característico de CPN cuando usando citometría de flujo asegura el éxito del protocolo descrito ^12.

1. Preparar una alícuota de la suspensión de células del hígado (20 l) y añadir 174 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y 6 l de yoduro de propidio (PI; concentración final 0,375 mg / ml). Añadir contar bolas que permiten la cuantificación de las células.
2. Puerta de SSC-A-FSC-A para evitar escombros y excluir aún más dobletes utilizando FSC-H y FCS-A.
   NOTA: Es importante seguir la estrategia de compuerta representado en la figura 2.
3. Puerta de las células muertas PI-positivo, miden 30 l a partir de sus muestras, y registrar los eventos. Siga directriz del fabricante para calcular el recuento de células.
   NOTA: Siga los pasos 4 para citometría de flujo de medición, los pasos 5 y 6 para el aislamiento de células progenitoras con base magnética, y los pasos 7 para citometría de flujo especie de sub-poblaciones progenitoras.

4. La tinción de la sola suspensión celular de hígado para el análisis de citometría de Fow Progenitor subconjuntos

Anticuerpo	Clon	Anfitrión / isotipo	De la Concentración [mg / ml]	Dilución
CD64	X54-5 / 7.1	IgG1 de ratón, κ	0,5	1: 100
CD16 / 32	93	Rat IgG2a, λ	0,5	1: 100
CD45	30-F11	IgG2b de rata, κ	0,2	1: 200
CD31	MEC13.3	Rat IgG2a, κ	0,5	1: 200
ASGPR1		Policlonal IgG de cabra	0,2	1: 100
podoplanin	1/8/2001	Hámster sirio IgG	0,2	1: 1.400
podoplanin	1/8/2001	Hámster sirio IgG	0,5	1: 1.400
CD133	Mb9-3G8	IgG1 de rata	0.03	3 l
CD133	315-2C11	Rat IgG2a, λ	0,5	1: 100
CD34	RAM34	Rat IgG2a, κ	0,5	1: 100
CD90.2	53-2,1	Rat IgG2, κ	0,5	1: 800
CD157	BP-3	IgG2b de ratón, κ	0,2	1: 600
EpCAM	G8.8	Rat IgG2a, κ	0,2	1: 100
Sca-1	D7	Rat IgG2a, κ	0.03	10 l
IgG2b de ratón, κ	MPC-11		0,2
IgG1 de rata	RTK2071		0,2
IgG2b de rata, κ	RTK4530		0,2
Rat IgG2a, κ	RTK2758		0,5
Rat IgG2a, κ	RTK2758		0,2
Hámster sirio IgG	SHG-1		0,2
Hámster sirio IgG	SHG-1		0,5
Normales de control de IgG de cabra		Policlonal IgG de cabra	1
Burro anti-IgG de cabra		burro IgG	2	1: 800
estreptavidina			1	1: 400

Tabla 1.

Anticuerpo	1	2	3	4	5
CD45 APC / Cy7	IgG2b de rata, κ 0,5 l	+	+	+	+
CD31 biotina	+	Rat IgG2a, κ 0,5 l	+	+	+
ASGPR1 purificado	+	+	Normales de control de IgG de cabra 0.2 l	+	+
podoplanin APC	+	+	+	Hámster sirio IgG 1 l de una dilución 1:14	+
CD133 PE	+	+	+	+	IgG1 de rata 0,45 l
Burro anti-cabra Alexa Fluor 488	+	+	+	+	+
estreptavidina Alexa Fluor 405	+	+	+	+	+

Tabla 2.

1. Colocar una alícuota de la suspensión celular de la etapa 2.11 en un tubo de reacción (1,5 ml) que contiene 2,5 x 10 ⁵ células, determinadas como se describe en el paso 3.
2. Centrifugar las células durante 3 minutos a 300 xg y 4 ° C utilizando una microcentrífuga.
   NOTA: En este punto, una bomba de vacío se puede utilizar para eliminar cuidadosamente el sobrenadante.
3. Resuspender el sedimento celular en la mezcla de Fc-bloque y se incuba durante 5 minutos en hielo. Preparar la mezcla Fc-bloque con un volumen total de 50 l por mancha. Añadir 10 l de reactivo de FcR-bloqueo, 1 l de purificado anti-CD64 (1: 100; 0,5 mg / mancha), y 40 l de tampón de tinción (tampón ST: HBSS, 1% (v / v) FBS, y 0,01% azida de sodio) por mancha.
   NOTA: La azida de sodio es altamente tóxico. Utilice equipo de protección personal adecuado, como guantes de nitrilo, una bata de laboratorio, y una mascarilla.
4. Añadir 50 l de la tinción de la mezcla a las células (el volumen total de las células es ahora 100 l) e incubar las células con la mezcla de anticuerpos, protegido de la luz y de 20 min en hielo.
5. Preparar la mezcla de anticuerpo con un volumen total de 50 l por mancha. Por 50 l de ST tampón, añadir los siguientes anticuerpos conjugados para la tinción básica: CD45 (0,5 mu l; 1: 200; 0,1 mg / mancha), CD31 (0,5 mu l; 1: 200; 0,25 mg / mancha), ASGPR1 (1 l ; 1: 100; 0,2 mg / mancha), podoplanin (1 l de una dilución 1:14; dilución 1: 1.400 extremo; 0,014 g / mancha) y CD133 (3 l; 0,09 mg / mancha).
   NOTA: La tabla1 resume los clones de anticuerpos y diluciones utilizadas para las manchas de base y para los marcadores de superficie adicionales de los distintos subconjuntos. Preparar suspensiones de células adicionales para la mezcla de anticuerpos que contiene los controles de isotipo correspondientes y / o de fluorescencia menos uno controles (FMOs), como se muestra en la Tabla 2.
6. Añadir 400 l de tampón de ST a cada muestra y centrifugar las células durante 4 min a 300 xg y 4 ° C.Discard el sobrenadante y resuspender las células en 100 l de mezcla de anticuerpo secundario que contiene 0.125 l de burro anti-IgG de cabra (1: 800; 0,25 mg / mancha) y 0,25 l de estreptavidina fluorescente conjugado (1: 400; 0,25 mg / mancha) en 100 l de tampón de ST.
7. Se incuban las células mientras que está protegido de la luz y con la mezcla de anticuerpos durante 20 min en hielo. Añadir 400 l de tampón de ST a cada muestra y centrifugar las células durante 4 min a 300 xg y 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 300 l de ST aficionadoer que contiene 0,25 mg / ml PI.
   NOTA: La viabilidad celular de las células progenitoras disminuye con el tiempo; por lo tanto, se sugiere para medir muestras frescas tan pronto como sea posible.

5. magnética enriquecimiento por Microbead de Células Progenitoras

1. Transferir una alícuota de la suspensión del hígado de una sola célula que contiene 1,5-2 x 10 ⁶ células, basados en el recuento de células determinado como se describe en el paso 3, en un nuevo tubo de centrífuga cónico de 15 ml.
2. Centrifugar las células durante 8 min a 180 xg y 4 ° C (usando reducida aceleración / 4 y desaceleración / 2).
   NOTA: Por lo general, tendrá que ser separada en tres tubo de centrífuga cónico de 15 ml uno C57Bl / 6 de hígado de ratón sano (o 1 g de tejido de hígado).
3. Resuspender las células en 400 l de HBSS 0,5% (v / v) de albúmina de suero bovino (BSA) y añadir 40 l de microperlas anti-CD31-y 30 l de microperlas anti-CD45. Se incuban las células durante 15 min a 4 ° C.
   NOTA: No exceda tque el tiempo de incubación, ya que la pureza de la separación se reduce de manera significativa.
4. Añadir 5 ml de HBSS 0,5% (v / v) de BSA a las células y centrifugar ellos durante 8 minutos a 180 xg y 4 ° C (usando reducida aceleración / 4 y desaceleración / 2).
5. Resuspender el sedimento celular en 100 l de perlas de eliminación de células muertas y se incuba a temperatura ambiente durante 15 min. Mientras tanto, preparar una columna de separación LS y calibrarlo con 3 ml de HBSS 0,5% (v / v) de BSA.
   NOTA: No exceda el tiempo de incubación, ya que la pureza de la separación se reducirá significativamente.
6. Añadir 900 l de HBSS 0,5% (v / v) de BSA a las células, filtrar utilizando 100-m de malla de filtro de poliamida, y cargarlos en la columna de separación LS.
   NOTA: Cargar un hígado entero en una sola columna de separación LS.
7. Lavar la columna tres veces con 3 ml de HBSS 0,5% (v / v) BSA y recoger el flujo a través.
8. Centrifugar el flujo a través de 8 min a 180 xg y 4 ° C (usando reducida acceleration / 4 y desaceleración / 2).
9. Resuspender el sedimento celular o bien en tampón (RB) (PBS y 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)) que contienen 0,5% (v / v) BSA o tampón ST, dependiendo del procedimiento experimental adicional de aclarado.

La purificación a base de Microbead 6. magnético automático de células progenitoras de los subconjuntos de células combinado a partir de hígados Múltiples

NOTA: Dado que los subconjuntos de células progenitoras representan las poblaciones de células raras, a menudo es necesaria la combinación de células de varios hígados para conseguir el número de células suficientes para experimentos adicionales. Como un ejemplo, CD133 ⁺ y ⁺ GP38 separación de células se describe a continuación.

1. El aislamiento de progenitores ⁺ CD133
   1. Después del paso 5.9, contar las células, tal como se describe en el paso 3, y volver a suspender hasta 10 ⁶ células (típicamente 4-6 puesta en común de muestras de hígado sanos) en 100 l de RB.
   2. Añadir anti-CD64 1: 100 y anti-CD16 / 32 1: 100 a las células y incublos comió en hielo durante 5 min. Añadir 1: 100 anti-CD133 anticuerpo biotinilado a las células y se incuba en hielo durante otros 10 min.
   3. Añadir 5 ml de RB y centrifugar durante 8 minutos a 180 x g y 4 ° C (con reducción de la aceleración / deceleración 4 y / 2).
   4. Resuspender las células en 400 l de RB y añadir 10 l de microperlas anti-biotina. Incubar la muestra durante 15 min a 4 ° C. No exceda el tiempo de incubación, ya que esto reduce la pureza de las muestras.
   5. Añadir 5 ml de RB y centrifugar durante 8 minutos a 180 x g y 4 ° C (con reducción de la aceleración / deceleración 4 y / 2). Resuspender el precipitado en 1 ml de RB.
2. Aislamiento de GP38 ⁺ progenitores
   1. Después del paso 5.9, contar las células, tal como se describe en el paso 3, y volver a suspender hasta 10 ⁶ células (típicamente 4-6 puesta en común de muestras de hígado sanos) en 100 l de RB.
   2. Añadir anti-CD64 1: 100 y anti-CD16 / 32 1: 100 a las células y se incuba en hielo durante 5 min. A continuación, añadir al menos 1:100 anti-GP38 biotinilado anticuerpo a las células y se incuba en hielo durante otros 10 min.
   3. Añadir 5 ml de RB y centrifugar durante 8 minutos a 180 x g y 4 ° C (con reducción de la aceleración / deceleración 4 y / 2).
   4. Resuspender las células en 400 l de RB y añadir 5 l de microperlas anti-biotina. Incubar la muestra durante 15 min a 4 ° C. No exceda el tiempo de incubación, ya que esto reduce la pureza de las muestras.
   5. Añadir 5 ml de RB y centrifugar durante 8 minutos a 180 x g y 4 ° C (con reducción de la aceleración / deceleración 4 y / 2).
   6. Resuspender el sedimento celular en 1 ml de RB.
3. Pasos comunes después de la etapa 6.1 o 6.2
   1. Se coloca el tubo de centrífuga cónico de 15 ml que contiene las suspensiones de células marcadas magnéticamente en un enfriamiento del bastidor 5 con dos tubos vacíos adicionales para la recogida de las fracciones positivas y negativas. Coloque la parrilla frío en la plataforma de separación del separador.
   2. Utilice el programa de selección positiva(Possel_d2) con una extensa etapa de lavado entre cada muestra (opción de enjuague).
      NOTA: El uso de la columna basado en la separación manual de células en lugar del separador automático reducirá la pureza de la muestra.
   3. Recoger la fracción positiva y centrifugar durante 8 min a 180 xg y 4 ° C (usando reducida aceleración / 4 y desaceleración / 2).
   4. Resuspender el sedimento celular ya sea en RB o tampón ST, dependiendo del procedimiento experimental.
   5. Para un control de pureza, tomar una alícuota de las células y manchar como se describe en el paso 4.

7. clasificación de células Citometría de Flujo

NOTA: A de alta pureza tipo de cualquier subconjunto de células progenitoras se puede lograr con el protocolo descrito a continuación. El rendimiento global de las células es mucho menor que el que se describe en el paso 6 y es mejor para el análisis de la expresión génica.

Parámetro	Ajuste
Boquilla Tamaño	85 micras
Frecuencia	46.00 - 46.20
Amplitud	38.30 - 55.20
Fase	0
retardo	28.68 - 28.84
Atenuación	Apagado
primer ensayo	284-297
objetivo Gap	9.-14
Presión	45 psi

Tabla 3.

1. Adquirir células del enriquecimiento basado en magnética (descrito en la etapa 5); contarlos, como se describe en el paso 3; y teñirlos de marcadores progenitoras (CD133, GP38), CD31, CD45 y ASGPR1, tal como se explica en el paso 4.
2. Para preparar el medio de clasificación (SM): libre de rojo fenol DulbecModificado Medio co de Eagle (DMEM) que contiene 0,5% (v / v) de BSA y 0,01% (v / v) de azida de sodio. Resuspender las células teñidas en SM, transferirlos a un tubo de fondo redondo de polipropileno, y colocarlos en hielo.
   NOTA: La azida de sodio es altamente tóxico. Utilice equipo de protección personal adecuado, como guantes de nitrilo, una bata de laboratorio, y una mascarilla. No utilice azida de sodio si se utilizan las células clasificadas para los ensayos funcionales.
3. Utilice el software apropiado para el tipo de clasificador utilizado para el aislamiento de células. Abra el software y siga las instrucciones del fabricante para configurar los parámetros de clasificación y especificaciones de la máquina.
   NOTA: Las especificaciones de la máquina se resumen en la Tabla 3. Mientras especificaciones de la máquina podría ser diferente en diversas instituciones, es importante señalar que la reducción de la presión de clasificación y un tamaño de boquilla más grande es necesario (45 psi y la boquilla 85-micras) para aumentar la viabilidad de la célula progenitora population y la calidad del ARN preparado a partir de las células clasificadas. Es importante utilizar las células progenitoras del hígado enriquecido para el establecimiento de la compensación. Otras poblaciones de hígado o leucocitos tienen diferentes autofluorescencia y conducir a una solución subóptima de la población del estroma y en una estrategia falsa compuerta.
4. Calibrar la máquina y colocar un tubo de fondo redondo de 5 ml de polipropileno que contiene 350 l de SM en el dispositivo de recogida de tipo. Iniciar la adquisición de la muestra y tipo. Suma 1.000 eventos de la subpoblación y detener el flujo de la muestra.
5. Tome el tubo del dispositivo de clasificación y medir las células clasificadas en el citómetro de flujo. Identificar el porcentaje de la población celular clasificada presente entre las células vivas. Este porcentaje da la pureza de las células clasificadas.
6. Si la pureza especie supera el 95%, colocar un tubo de fondo redondo de 5 ml de polipropileno que contiene 350 l de tampón de lisis RLT en el dispositivo de recogida de tipo.
7. Comience la clase y recoger 7,000-10.000 eventos por subpoblación del estroma.
8. Transferir el tampón de lisis RLT que contiene las células clasificadas en un tubo de reacción y DNasa libre de RNasa y almacenar las muestras a -80 ° C hasta su posterior análisis.

Resultados

El procedimiento que aquí se presenta para la digestión del hígado usando una nueva mezcla de los resultados de las enzimas en una suspensión de una sola célula que contiene parénquima y células hepáticas no parenquimatosas (Figuras 1 y 2a). Después de la lisis ACK-de las células rojas de la sangre, el flujo directo análisis de citometría de la suspensión de célula única es posible (Figuras 1 y 2). La estr...

Discusión

Inflamación del hígado y lesiones de diferentes orígenes desencadenan procesos regenerativos en el hígado que se acompañan de la expansión de células progenitoras y la activación ^{2, 3.} Estas células progenitoras del hígado poseen características de las células madre y probablemente juegan un papel importante en el mecanismo patológico de varias enfermedades del hígado.

La heterogeneidad de las células progenitoras hep?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Life Technologies	21875-034
phenol red free DMEM	Life Technologies	31053-028
FBS	Life Technologies	10270-106
Collagenase P	Sigma-Aldrich	11249002001
DNAse-I	Sigma-Aldrich	10104159001
Dispase	Life Technologies	17105041
ACK Lysing Buffer	Life Technologies	A10492-01
HBSS	Life Technologies	14025-050
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002	Prepare 1% stock solution
10% BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	add 0.5% (v/v) BSA and store on ice
Phenol-red free DMEM	Sigma-Aldrich	D1145
counting Beads Count Bright	Life Technologies	C36950
PI	Miltenyi Biotec	130-093-233
FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575
anti-CD31 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-097-418
anti-CD45 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-301
Dead Cell Removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101
anti-Biotin MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-485
CD64 Purified	BioLegend	139302	Dilution: 1:100
CD16/32 Purified	BioLegend	101302	Dilution: 1:100
CD45 APC/Cy7	BioLegend	103116	Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells
CD31 Biotin	BioLegend	102504	Dilution: 1:200, marks endothelial cells
ASGPR1 Purified	Bio-Techne	AF2755-SP	Dilution: 1:100, marks hepatocytes
Podoplanin APC	BioLegend	127410	Dilution: 1:1,400, marks progenior cells
Podoplanin Biotin	BioLegend	127404	Dilution: 1:1,400
CD133 PE	Miltenyi Biotec	130-102-210	use 3 µL, marks progenitor cells
CD133 Biotin	BioLegend	141206	Dilution: 1:100
CD34 Biotin	eBioScience	13-0341-81	Dilution: 1:100
CD90.2 Pacific Blue	BioLegend	140306	Dilution: 1:800
CD157 PE	BioLegend	140203	Dilution: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421	BioLegend	118225	Dilution: 1:100
Sca-1 Biotin	Miltenyi Biotec	130-101-885	use 10 µL
Mouse IgG2b, κ PE	BioLegend	400311
Rat IgG1 PE	BioLegend	400407
Rat IgG2b, κ APC/Cy7	BioLegend	400624
Rat IgG2a, κ Biotin	BioLegend	400504
Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421	BioLegend	400535
Syrian Hamster IgG APC	BioLegend	402012
Syrian Hamster IgG Biotin	BioLegend	402004
Normal Goat IgG Control Purified	Bio-Techne	AB-108-C
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11055	Dilution: 1:800
Streptavidin Alexa Fluor 405	Life Technologies	S32351	Dilution: 1:400
100 µm Filter mesh	A. Hartenstein	PAS3
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACS separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACSQuant Analyzer 10	Miltenyi Biotec	130-096-343
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
FACS AriaTMIII	BD Biosciences
FACSDiva sofware	BD Biosciences
Polypropylene Round bottom tube	Falcon	352063
Rneasy plus mini kit	Qiagen	74134	RLT lysis buffer is included