Выделение и Обогащение печени подмножествах идентифицированных-предшественников маркером Комбинация Novel поверхности

Резюме

травмы печени сопровождаются расширением клеток-предшественников, что представляет собой гетерогенную популяцию клеток. Новые классификация этого клеточный компартмент позволяет различении нескольких подмножеств. Описанный здесь метод иллюстрирует поток цитометрии и высокой чистоты изоляции различных подмножеств, которые могут быть использованы для дальнейшего анализа.

Аннотация

Во время хронических повреждений печени, клетки-предшественники расширяться в процессе, называемом протоками, реакция, которая также влечет за собой возникновение воспалительного клеточного инфильтрата и активации эпителиальных клеток. Популяция клеток-предшественников во время таких воспалительных реакций в основном были исследованы с использованием одиночных поверхностных маркеров, либо с помощью гистологического анализа или с помощью проточной цитометрии методов на основе. Тем не менее, новые поверхностные маркеры идентифицировали различные функционально различных подмножеств в пределах прародителя клеток печени отделение / стволовых. Изложенный здесь метод описывает выделение и детальный анализ проточной цитометрии подмножеств предшественников с использованием комбинаций маркеров романа поверхности. Кроме того, он показывает, как различные прогениторных клеток подмножества могут быть выделены с помощью методов высокой чистоты с использованием автоматизированной магнитной и FACS сортировки на основе. Важно отметить, что новые и упрощенную ферментативная диссоциация печени позволяет изоляции этих популяций редких клеток с высокой жизнеспособностьючто превосходит по сравнению с другими существующими методами. Это особенно актуально для дальнейшего изучения клеток - предшественников в пробирке или для изоляции высокого качества РНК для анализа профиля экспрессии генов.

Введение

регенерации печени чаще всего ассоциируется с самообновлению мощностью гепатоцитов. Тем не менее, хронические повреждения печени возникают при активации клеток - предшественников и расширения, которые были связаны с их способностью дифференцироваться в гепатоциты и холангиоцитах ^{1, 2, 3, 4.} Это особенно актуально, так как, во время хронических травм, пролиферации гепатоцитов не является эффективным. Несмотря на многочисленные исследования генетической трассировки , ориентированных на клетки - предшественники, их роль в регенерации печени остается спорным ^{5, 6, 7, 8.} Кроме того, активация клеток - предшественников , было связано с увеличением фиброзной реакции в печени, что вызывает вопросы об их точной роли во время травмы ⁹, ^10.

Гетерогенный характер клеток - предшественников купе уже давно было предложено экспрессии генов исследований, изолированных клеток - предшественников , выражающие одну поверхностный маркер с помощью микродиссекции или клетки методов сортировки на основе ^{1, 11.} Действительно, в последнее время , новая комбинация маркер поверхности с помощью gp38 (podoplanin) однозначно связаны предыдущие одиночные маркеры клеток - предшественников различных подмножеств ^12. Важно отметить, что эти подмножества не только отличались по экспрессии поверхностных маркеров , но также демонстрируют функциональные изменения во время травм ^12.

Несколько моделей на животных были использованы для исследования активации клеток-предшественников и регенерации печени. Кажется , что различные виды травм способствуют активации отличаясь подмножеств клеток - предшественников ^12. Это могло бы объяснить фотenotypic дивергенция протоками реакции , наблюдаемой у человека ^4. Таким образом, сложные фенотипические и функциональный анализ клеток-предшественников являются ключевыми для понимания их роли в травмах и истинное значение протоками реакции при заболеваниях печени.

Кроме комбинаций поверхностных маркеров, решающие различия в протоколах выделения клеток еще больше осложнить выводы , основанные на предыдущих исследованиях ^2. Значительное количество исследований было посвящено роли клеток - предшественников , которые значительно различаются по их протоколу изоляции (например, диссоциации печени (комбинацией ферментов и длительность процесса), средней плотности и скорости центрифугирования) ^2. Оптимизированный метод выделения, обеспечивая лучшую жизнеспособность популяций редких клеток и отражает подмножество состава, была разработана и опубликована недавно ^12. Цель данной статьи состоит в том, чтобы обеспечить более йеболело протокол этой процедуры выделения клеток печени и анализа подмножества для обеспечения надлежащего воспроизведения техники. Кроме того, протокол включает в себя сравнение с предыдущим методом изоляции, чтобы продемонстрировать различия по сравнению с новым протоколом.

протокол

Все экспериментальные процедуры были проведены с одобрения комитетов по этике и по уходу за животными в Хомбург University Medical Center.

1. Подготовка материалов и буферами

1. Свеже подготовить все буферы, необходимые для переваривания печени с использованием стерильных компонентов и ламинарный капюшон, чтобы избежать бактериального загрязнения.
2. Приготовьте сбор буфера (CB) путем смешивания 49,5 мл RPMI среды и 0,5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS; низкая эндотоксин, инактивированной нагреванием) для достижения раствора 1% (об / об). Хранить раствор на льду до дальнейшего использования.
   Примечание: Приблизительно 25 мл CB необходимо переварить одну целую печень.
3. Готовят переваривании буфера (DB) с использованием следующих ингредиентов: RPMI среду, 1% (об / об) FBS (низкий эндотоксин, инактивированной нагреванием), коллагеназы P (0,2 мг / мл), ДНКазы I (0,1 мг / мл) и диспаза (0,8 мг / мл).
   Примечание: Примерно 25 мл БД необходимо усвоить одну целую печень. Предварительно нагрейте DB в тон 37 ° C на водяной бане перед использованием.
4. Развести ферменты по прибытии в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS; collagense P и диспаза) или в ДНКазы I - буфера (50% (об / об) глицерина, 1 мМ MgCl _2, и 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5) , аликвоту его и хранить его при температуре -20 ° C. Хранить ДНКазы I буфер при температуре 4 ° С и использовать его в течение двух месяцев.

2. Подготовка печени одноклеточные Подвеска

1. Эвтаназии необработанных мышей дикого типа путем цервикальной дислокации в соответствии с местными комитетов по этике и по уходу за животными.
2. Поместите мышей на рассечение борту и влажный мех с 70% этанола. С помощью ножниц, откройте живот с срединный разрез кожи, а затем с помощью Y-разрез в направлении конечностей. Откройте брюшины до грудины с помощью ножниц. Для того, чтобы раскрыть печень, вытесняют кишечник мягко с правой стороны с помощью ватного тампона.
3. С помощью ножниц и щипцов, удалить мочки печени,оставляя позади желчного пузыря, а также во избежание загрязнения соединительной тканью. Взвесьте печень и поместить его на льду в чашке Петри, содержащей HBSS.
4. Поместите печень на мочки сухой чашке Петри и разрезают ткани печени на однородные кубики размером примерно 2 мм полутуши с помощью скальпеля. Передача части в 15-мл коническую центрифужную пробирку.
5. Добавить 2,5 мл БД в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую кусочки печени и поместить его в водяной бане при 37 ° C, чтобы начать процесс пищеварения (здоровая печень занимает 60-70 мин и цирроза печени занимает 80-90 мин ).
   Примечание: Если одна целая печень переваривается, печень должна быть разделена на две 15-мл коническую центрифужные пробирки, чтобы обеспечить хорошую жизнеспособность клеток.
6. Подготовьте новый 15-мл коническую центрифужную пробирку для сбора высвобожденные клетки печени. Поместите полиамид 100 мкм сетчатый фильтр на верхней части трубки и смачивать сетку с 800 мкл СВ. Поместите коническую центрифужную пробирку на льду.
7. Смешайте СэмуПлес в водяной бане 37 ° C после 5 и 10 мин для того, чтобы поддержать процесс пищеварения путем встряхивания 15 мл коническую центрифужную пробирку, содержащую кусочки печени.
8. Через 15 мин после начала переваривания, осторожно перемешать кусочки печени с помощью пипетки 1000 мкл, с наконечником, который позволяет вырезать кусочки печени пройти легко. Поместите трубки обратно в ванну с водой и позволяют куски урегулировать в течение 2 мин.
9. Удалить супернатант, содержащий распространяемой клетки (как правило, 2x 700 мкл) и добавить его к трубе, полученного на стадии 2.6. Заменить удаленный супернатанта с БД (2x 700 мкл) и поместить его обратно в водяную баню на 37 ° C.
10. Повторите процедуру, описанную в пункте 2.8 (как правило, на 30, 40, 50, 55 и 60 мин) до примерно 60-70 мин прошло с момента начала пищеварения. С 40 мин и далее, остальные кусочки печени должны быть достаточно малы, чтобы пройти через неподрезанные 1000 мкл кончика пипетки.
    Примечание: Здоровая печень DigeSTED полностью в течение 60-70 мин, в то время как фиброзная печени обычно требуется 80-90 мин. К этому моменту времени, ткани печени, не должна быть видна в коническую 15-мл центрифужную пробирку, содержащую кусочки печени, и все высвобожденные клетки должны быть переданы в трубку, полученного на стадии 2.6.
11. В конце процесса пищеварения, сбора клеток и их центрифугировать в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (с использованием уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
12. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл-аммоний хлорид-калия (ACK) буфера для лизиса и инкубируйте в течение 1 мин при комнатной температуре, чтобы лизировать красные кровяные клетки. Остановить реакцию добавлением 5 мл CB, а затем центрифугировать клетки в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2). Ресуспендируют клеток в 4 мл СВ и хранить их на льду. Граф клеток, как описано в шаге 3.
    Примечание: Клеточный осадок рыхлый, и, следовательно, супернатант пипеткой прочь вместо того, чтобы быть декантируют.

3. Определение клеточного графа с использованием проточной цитометрии

Примечание: Для определения количества клеток, автоматизированный счетчик клеток или, в идеале, поток клеток Количественное цитометрии на основе описанной ниже предлагается вместо классического метода Нойбауэра камеры на основе. Подвеска печени одноклеточного описано в шаге 2 содержит паренхимы и не паренхимных клеток (NPC) с сильно различающимися размерами и гранулярности. Надлежащее исключение клеточных остатков вместе с литниковой-на рассеяния вперед, боковое рассеивание (FSC-SSC) характеристики РНУ при использовании проточной цитометрии обеспечивает успех описанного протокола ^12.

1. Готовят аликвоту клеток печени суспензии (20 мкл) и добавляют 174 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) и 6 мкл пропидиума йода (PI; конечная концентрация 0,375 мкг / мл). Добавить подсчета шарики, которые позволяют для количественной оценки клеток.
2. Ворота на SSC-A-FSC-A, чтобы избежать мусора и далее исключить дублеты с использованием FSC-H и FCS-A.
   Примечание: Важно следовать стратегии стробирования , изображенную на рисунке 2.
3. Ворота из PI-положительные мертвые клетки, измеряют 30 мкл из ваших образцов, а также записывать события. Следуйте руководство изготовителя для расчета количества клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги с 4 по проточной цитометрии измерения, шаги 5 и 6 для изоляции на основе магнитных клеток-предшественников, а также шаги 7 для проточной цитометрии рода субпопуляции клеток-предшественников.

4. Окрашивание одноклеточные подвески печени для FoW цитометрии анализа прародителя подмножествах

антитело	клон	Host / Изотип	Фото Концентрация [мг / мл]	разбавление
CD64	X54-5 / 7.1	Мышь IgG1, κ	0,5	1: 100
CD16 / 32	93	Крыса IgG2a, λ	0,5	1: 100
CD45	30-F11	Крыса IgG2b, κ	0,2	1: 200
CD31	MEC13.3	Крыса IgG2a, κ	0,5	1: 200
ASGPR1		Поликлональные Коза IgG	0,2	1: 100
Podoplanin	1/8/2001	Сирийский хомяк IgG	0,2	1: 1 400
Podoplanin	1/8/2001	Сирийский хомяк IgG	0,5	1: 1 400
CD133	Mb9-3G8	Крыса IgG1	0.03	3 мкл
CD133	315-2C11	Крыса IgG2a, λ	0,5	1: 100
CD34	RAM34	Крыса IgG2a, κ	0,5	1: 100
CD90.2	53-2,1	Крыса IgG2, κ	0,5	1: 800
CD157	BP-3	Мышь IgG2b, κ	0,2	1: 600
EpCAM	G8.8	Крыса IgG2a, κ	0,2	1: 100
Sca-1	D7	Крыса IgG2a, κ	0.03	10 мкл
Мышь IgG2b, κ	MPC-11		0,2
Крыса IgG1	RTK2071		0,2
Крыса IgG2b, κ	RTK4530		0,2
Крыса IgG2a, κ	RTK2758		0,5
Крыса IgG2a, κ	RTK2758		0,2
Сирийский хомяк IgG	SHG-1		0,2
Сирийский хомяк IgG	SHG-1		0,5
Нормальный контроль Коза IgG		Поликлональные Коза IgG	1
Осел анти-IgG Коза		Осел IgG	2	1: 800
стрептавидином			1	1: 400

Таблица 1.

антитело	1	2	3	4	5
CD45 APC / Cy7	Крыса IgG2b, κ 0,5 мкл	+	+	+	+
CD31 Биотин	+	Крыса IgG2a, κ 0,5 мкл	+	+	+
ASGPR1 очищают	+	+	Нормальный контроль Коза IgG 0,2 мкл	+	+
Podoplanin APC	+	+	+	Сирийский хомяк IgG 1 мкл 1:14 Разбавление	+
CD133 PE	+	+	+	+	Крыса IgG1 0,45 мкл
Осел анти-Коза Alexa Fluor 488	+	+	+	+	+
стрептавидином Alexa Fluor 405	+	+	+	+	+

Таблица 2.

1. Поместите аликвоты клеточной суспензии с шага 2,11 в реакционную трубку (1,5 мл) , содержащей 2,5 × 10 ⁵ клеток, определяют , как описано в шаге 3.
2. Центрифуга клетки в течение 3 мин при 300 х г и 4 ° С с использованием микроцентрифуге.
   Примечание: На этом этапе вакуумный насос может быть использован, чтобы тщательно удалить супернатант.
3. Ресуспендируют осадок клеток в Fc-блоке смеси и инкубировать ее в течение 5 минут на льду. Подготовьте Fc-блок смесь с общим объемом 50 мкл на пятно. Добавьте 10 мкл FcR-блокирующего реагента, 1 мкл очищенного анти-CD64 (1: 100; 0,5 мкг / пятно), и 40 мкл окрашивающего буфера (ST буфер: HBSS, 1% (об / об) FBS, и 0,01% азид натрия) на пятно.
   Примечание: азид натрия очень токсичен. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, такие как нитрил перчатки, лабораторный халат, а также маски для лица.
4. Добавить 50 мкл окрашивания смеси с клетками (общий объем клеток в настоящее время 100 мкл) и инкубируют клетки со смесью антител, защищенном от света и в течение 20 мин на льду.
5. Готовят смесь антител с общим объемом 50 мкл на пятно. Для 50 мкл ST буфера, добавьте следующие конъюгированные антитела для основного окрашивания: CD45 (0,5 мкл; 1: 200; 0,1 мкг / пятно), CD31 (0,5 мкл; 1: 200; 0,25 мкг / пятно), ASGPR1 (1 мкл ; 1: 100; 0,2 мкг / пятно), podoplanin (1 мкл 1:14 разведения; 1: 1 400 конечного разведения; 0,014 мкг / пятно) и CD133 (3 мкл; 0,09 мкг / пятно).
   Примечание: Таблица1 приведены антитела клонов и разведения использованы для основных пятен и дополнительных поверхностных маркеров различных подмножеств. Подготовьте дополнительные клеточные суспензии для смеси антител , содержащего соответствующие элементы управления изотипа и / или флуоресценции минус один контроль (лесозаготовительных предприятий), как показано в таблице 2.
6. Добавить 400 мкл буфера для ST для каждого образца и центрифугировать клетки в течение 4 мин при 300 х г и 4 ° C.Discard супернатант и клетки вновь суспендируют в 100 мкл вторичного антитела смеси, содержащей 0,125 мкл осла против IgG козьего (1: 800; 0,25 мкг / краситель) и 0,25 мкл флуоресцентного-конъюгированный стрептавидин (1: 400; 0,25 мкг / пятно) в 100 мкл буфера для ST.
7. Инкубируйте клетки в то время как в защищенном от света и со смесью антител в течение 20 мин на льду. Добавить 400 мкл буфера ST для каждого образца и центрифугировать клетки в течение 4 мин при 300 х г и 4 ° С. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 300 мкл ST нагишомэр, содержащий 0,25 мкг / мл PI.
   ПРИМЕЧАНИЕ: жизнеспособность клеток из клеток-предшественников уменьшается со временем; Поэтому, предлагается измерить свежие образцы как можно скорее.

5. Магнитный Microbead на основе Обогащение клеток-предшественников

1. Передача аликвоты печени одной клеточной суспензии , содержащей 1,5-2 × 10 ⁶ клеток, на основе подсчета клеток определяли , как описано в шаге 3, в новый 15-мл коническую центрифужную пробирку.
2. Центрифуга клеток в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
   Примечание: Как правило, один здоровый C57BL / 6 мышей печени (или 1 г ткани печени), должны быть разделены на три 15-мл коническую центрифужную пробирку.
3. Ресуспендируют клеток в 400 мкл HBSS 0,5% (об / об) бычьего сывороточного альбумина (БСА) и добавляют 40 мкл анти-CD31 микросфер и 30 мкл анти-CD45 микрогранул. Инкубируйте клетки в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
   Примечание: Не следует превышать тон инкубацией время, поскольку чистота разделения будет значительно уменьшена.
4. Добавить 5 мл HBSS 0,5% (об / об) БСА к клеткам и отцентрифугированы в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
5. Ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл мертвых бусин удаления клеток и инкубировать их при комнатной температуре в течение 15 мин. В то же время, подготовить разделительную колонку LS и калибровать его с 3 мл HBSS 0,5% (об / об) БСА.
   Примечание: Не превышайте время инкубации, так как чистота разделения будет значительно сокращен.
6. Добавить 900 мкл HBSS 0,5% (об / об) БСА к клеткам, фильтровать их с использованием 100-мкм сетчатый фильтр из полиамида, и загрузить их на разделительную колонку LS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузите один всю печень на одну разделительную колонну LS.
7. Промыть колонку три раза с 3 мл HBSS 0,5% (об / об) БСА и собирать проточные.
8. Центрифуга проточный в течение 8 мин при 180 мкг и 4 ° С (с использованием пониженной ACCEleration / 4 и замедление / 2).
9. Ресуспендируют осадок клеток либо в ополаскивание буфере (RB) (PBS и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)), содержащего 0,5% (об / об) БСА или ST буфера, в зависимости от дальнейшей экспериментальной процедуры.

6. Магнитный Microbead на основе Автоматизированная Cell Очистка прогениторных клеток подмножествах В сочетании с нескольких Печени

ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку клеток-предшественников подмножества представляют популяции редких клеток, сочетающие в себе клетки из нескольких печени часто требуется для достижения достаточного количества клеток для дальнейших экспериментов. В качестве примера, CD133 ⁺ и gp38 ⁺ разделение клеток описана ниже.

1. Выделение CD133 ⁺ клеток - предшественников
   1. После шага 5.9, подсчет клеток, как описано в шаге 3, и ресуспендируют до 10 ⁶ клеток ( как правило , 4-6 пулинговой здоровых образцов печени) в 100 мкл РБ.
   2. Добавить анти-CD64 1: 100 и анти-CD16 / 32 1: 100 к клеткам и incubели их на льду в течение 5 мин. Добавить 1: 100 анти-CD133 биотинилированных антител к клеткам и инкубировать их на льду в течение еще 10 мин.
   3. Добавьте 5 мл РБ и центрифуга в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
   4. Ресуспендируют клеток в 400 мкл РБ и добавляют 10 мкл анти-биотин микрогранул. Инкубируйте образца в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Не превышать времени инкубации, так как это снижает чистоту образцов.
   5. Добавьте 5 мл РБ и центрифуга в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2). Ресуспендируют осадок в 1 мл РБ.
2. Выделение gp38 ⁺ клеток - предшественников
   1. После шага 5.9, подсчет клеток, как описано в шаге 3, и ресуспендируют до 10 ⁶ клеток ( как правило , 4-6 пулинговой здоровых образцов печени) в 100 мкл РБ.
   2. Добавить анти-CD64 1: 100 и анти-CD16 / 32 1: 100 к клеткам и инкубировать их на льду в течение 5 мин. Затем добавьте 1:100 анти-gp38 биотинилированных антител к клеткам и инкубировать их на льду в течение еще 10 мин.
   3. Добавьте 5 мл РБ и центрифуга в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
   4. Ресуспендируют клеток в 400 мкл РБ и добавляют 5 мкл анти-биотин микрогранул. Инкубируйте образца в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Не превышать времени инкубации, так как это снижает чистоту образцов.
   5. Добавьте 5 мл РБ и центрифуга в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
   6. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл РБ.
3. Общие шаги после шага 6.1 или 6.2
   1. Поместите 15-мл коническую центрифужную пробирку, содержащую магнитно-меченных клеточные суспензии на охлаждающем 5 стойку с двумя дополнительными пустыми трубами для сбора положительных и отрицательных фракций. Поместите чилл стойку на платформе разделения сепаратора.
   2. Используйте позитивную программу выбора(Possel_d2) с обширной стадии промывки между каждой пробы (опция ополаскивания).
      Примечание: Использование колонки на основе ручное разделение клеток вместо автоматического сепаратора уменьшит чистоту образца.
   3. Сбор положительную фракцию и центрифуге в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (с использованием уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
   4. Ресуспендируют осадок клеток либо в РБ или ST буфер, в зависимости от дальнейшей экспериментальной процедуры.
   5. Для проверки чистоты, возьмите аликвоты клеток и окрашивать их, как описано в шаге 4.

7. проточной цитометрии сортировки клеток

Примечание: Высокий сорт чистота любого подмножества клеток-предшественников может быть достигнуто с протоколом, описанным ниже. Общий выход клеток значительно ниже, чем это описано в шаге 6, и лучше всего для анализа экспрессии генов.

параметр	настройка
Размер сопла	85 мкм
частота	46.00 - 46.20
амплитудное	38.30 - 55.20
фаза	0
Задержка выпадения	28.68 - 28.84
ослабление	выключено
Первое падение	284 - 297
Целевой показатель Gap	9.-14
давление	45 фунтов на квадратный дюйм

Таблица 3.

1. Acquire клетки от магнитного на основе обогащения (описанной на стадии 5); считать их, как описано в шаге 3; и окрашивают их для маркеров-предшественников (CD133, gp38), CD31, CD45 и ASGPR1, как описано в шаге 4.
2. Подготовка сортировки среды (SM): фенол-красный свободный DulbecК.О. Модифицированный орла Средний (DMEM), содержащей 0,5% (об / об) БСА и 0,01% (об / об) азида натрия. Ресуспендируют окрашенных клеток в SM, передавать их в полипропиленовую с круглым дном трубы, и поместите их на лед.
   Примечание: азид натрия очень токсичен. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, такие как нитрил перчатки, лабораторный халат, а также маски для лица. Не следует использовать азид натрия, если отсортированной клетки используются для функциональных анализов.
3. С помощью соответствующего программного обеспечения для типа сортировщика, используемого для выделения клеток. Откройте программу и следуйте инструкциям производителя, чтобы настроить параметры сортировки и технические характеристики машины.
   Примечание: Технические характеристики машины приведены в таблице 3. В то время как технические характеристики машин может быть различным в различных учреждениях, важно отметить, что снижение сортировочного давления и больший размер сопла необходимо (45 фунтов на квадратный дюйм, и сопло 85 мкм) для повышения жизнеспособности клеток-предшественников populatионов и качество РНК, полученной из отсортированных клеток. Важно использовать обогащенные клетки-предшественники печени для установки компенсации. Другие популяции печени или лейкоциты имеют различную автофлуоресценции и результат в неоптимальным разрешением населения стромы и в ложной стратегии стробирования.
4. Откалибруйте машину и поместить в 5 мл полипропилена с круглым дном пробирки, содержащей 350 мкл SM в устройстве сбора сортировки. Начать сбор образцов и сортировки. Соберите 1000 событий субпопуляции и остановить поток пробы.
5. Возьмем трубку из устройства сортировки и измерения отсортированных клеток на проточном цитометре. Определить процент отсортированного популяции клеток присутствует среди живых клеток. Этот процент дает чистоту отсортированных клеток.
6. Если чистота сорт превышает 95%, место 5-мл полипропиленовую с круглым дном пробирки, содержащей 350 мкл RLT буфера для лизиса в устройстве сбора сортировки.
7. Начните сортировку и собирать 7000-10000 событий в стромальных субпопуляции.
8. Перенесите RLT буфер для лизиса, содержащую отсортированные клетки в реакционной трубке DNase- и не содержащей РНКазы, и хранить образцы при -80 ° C до дальнейшего анализа.

Результаты

Процедура , представленная здесь для переваривания печени с использованием новой смеси ферментов приводит к одноклеточной суспензии , содержащей паренхиматозные и не-паренхиматозные клетки печени (рис 1 и 2а). После ACK-лизису эритроцитов, прямой прот...

Обсуждение

Воспаление печени и травмы различного происхождения вызывают регенеративные процессы в печени, сопровождающихся расширением клеток - предшественников и активации ^{2, 3.} Эти клетки-предшественники печени обладают стволовые клеточные характеристики и, ве...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Life Technologies	21875-034
phenol red free DMEM	Life Technologies	31053-028
FBS	Life Technologies	10270-106
Collagenase P	Sigma-Aldrich	11249002001
DNAse-I	Sigma-Aldrich	10104159001
Dispase	Life Technologies	17105041
ACK Lysing Buffer	Life Technologies	A10492-01
HBSS	Life Technologies	14025-050
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002	Prepare 1% stock solution
10% BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	add 0.5% (v/v) BSA and store on ice
Phenol-red free DMEM	Sigma-Aldrich	D1145
counting Beads Count Bright	Life Technologies	C36950
PI	Miltenyi Biotec	130-093-233
FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575
anti-CD31 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-097-418
anti-CD45 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-301
Dead Cell Removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101
anti-Biotin MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-485
CD64 Purified	BioLegend	139302	Dilution: 1:100
CD16/32 Purified	BioLegend	101302	Dilution: 1:100
CD45 APC/Cy7	BioLegend	103116	Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells
CD31 Biotin	BioLegend	102504	Dilution: 1:200, marks endothelial cells
ASGPR1 Purified	Bio-Techne	AF2755-SP	Dilution: 1:100, marks hepatocytes
Podoplanin APC	BioLegend	127410	Dilution: 1:1,400, marks progenior cells
Podoplanin Biotin	BioLegend	127404	Dilution: 1:1,400
CD133 PE	Miltenyi Biotec	130-102-210	use 3 µL, marks progenitor cells
CD133 Biotin	BioLegend	141206	Dilution: 1:100
CD34 Biotin	eBioScience	13-0341-81	Dilution: 1:100
CD90.2 Pacific Blue	BioLegend	140306	Dilution: 1:800
CD157 PE	BioLegend	140203	Dilution: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421	BioLegend	118225	Dilution: 1:100
Sca-1 Biotin	Miltenyi Biotec	130-101-885	use 10 µL
Mouse IgG2b, κ PE	BioLegend	400311
Rat IgG1 PE	BioLegend	400407
Rat IgG2b, κ APC/Cy7	BioLegend	400624
Rat IgG2a, κ Biotin	BioLegend	400504
Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421	BioLegend	400535
Syrian Hamster IgG APC	BioLegend	402012
Syrian Hamster IgG Biotin	BioLegend	402004
Normal Goat IgG Control Purified	Bio-Techne	AB-108-C
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11055	Dilution: 1:800
Streptavidin Alexa Fluor 405	Life Technologies	S32351	Dilution: 1:400
100 µm Filter mesh	A. Hartenstein	PAS3
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACS separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACSQuant Analyzer 10	Miltenyi Biotec	130-096-343
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
FACS AriaTMIII	BD Biosciences
FACSDiva sofware	BD Biosciences
Polypropylene Round bottom tube	Falcon	352063
Rneasy plus mini kit	Qiagen	74134	RLT lysis buffer is included