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Method Article
간 손상은 이종 세포 인구를 나타내는 전구 세포의 확장을 동반한다. 이 세포 구획의 소설 분류는 여러 부분 집합의 구별이 가능합니다. 여기에 설명 된 방법은 추가 분석 및 분석에 사용될 수있는 다양한 서브 세트의 고순도 분리 계측법 흐름을 도시한다.
만성 간 손상 동안 전구 세포는 염증 세포의 침윤과 상피 세포 활성화의 모양을 수반 ductular 반응이라는 프로세스에 확장. 이러한 염증 반응 동안 전구 세포 인구는 대부분 조직 학적 분석이나 유동 세포 계측법 기반 기술에 의해 하나, 하나의 표면 마커를 사용하여 조사되었다. 그러나, 새로운 표면 마커가 간 전구 내에서 다양한 기능적으로 별개의 하위 집합을 식별 / 셀 구획 줄기. 여기에 제시된 방법은 분리 및 신규 표면 마커의 조합을 사용하여 선조 세포 계측법 분석 서브 세트의 상세한 흐름을 설명한다. 또한, 다양한 전구 세포 서브셋 고순도 자기 자동화 사용하여 FACS 정렬 기반의 방법으로 분리 될 수 있는지 보여준다. 중요한 간 새롭고 단순화 분해 효소는 높은 생존력 이러한 희귀 세포군의 분리를 허용즉 기존의 방법에 비해 우수하다. 이는 시험관 내에서 상기 전구 세포 연구 또는 유전자 발현 프로파일을 분석하는 고품질의 RNA를 분리하는 데 특히 적합하다.
간 재생 주로 간세포의자가 재생산 능력과 관련된다. 그럼에도 불구하고, 만성 간 손상은 간세포 및 담관 1, 2, 3, 4로 분화 할 수있는 능력과 관련이있는 전구 세포 활성화 및 확장으로 발생한다. 만성 상처 중에 간세포 증식 효과가없는 경우가 있기 때문 특히 적합하다. 전구 세포를 표적 다중 유전자 추적 연구에도 불구하고, 간 재생에서의 역할은 5, 6, 7, 8 논란이 남아있다. 또한, 전구 세포의 활성화는 부상 9시 자신의 정확한 역할에 대한 질문을 제기 간에서 증가 섬유 성 반응에 연결되어 있습니다10.
선조 세포 구획의 이질적인 성질 긴 미세 절제 또는 세포 분류 기반의 방법 (1) (11)를 사용하여 단일 표면 마커를 발현하는 전구 세포를 격리 유전자 발현의 연구에 의해 제안되고있다. 실제로, 최근 새로운 표면 마커 조합하여 gp38 (podoplanin)는 명백하게 다양한 서브 세트들 (12) 선조 세포의 이전 단일 마커 링크. 중요한 것은, 이러한 서브 세트는 그들의 표면 마커의 발현에 차이가없는 아니라 부상 12시 기능적 변화를 나타냈다.
여러 동물 모델은 전구 세포의 활성화, 간 재생을 조사하기 위해 사용되어왔다. 다양한 부상 유형은 전구 세포 (12)의 하위 집합을 서로 다른의 활성화를 촉진 것으로 보인다. 이는 pH를 설명 할 수있을인간 4에서 관찰 ductular 반응 enotypic 발산. 따라서, 전구 세포의 표현형 복잡한 기능적 분석은 부상 역할 및 간 질환의 ductular 반응의 참된 의미를 이해하는 피봇된다.
표면 마커 조합 외에, 세포 격리 프로토콜의 중요한 차이는 또한 이전의 연구 (2)에 기초하여 결론을 복잡. 연구의 상당한 양을 크게들이 분리 프로토콜 상이한 전구 세포 (예, 간 분리 (효소 결합 프로세스의 기간), 밀도, 매질 및 원심 분리 속도)의 역할이 해결. 최적화 된 분리 기술, 희귀 세포 집단에 대한 더 나은 가능성을 제공하고 일부 조성물의 반사가 개발하고 최근 12 게시되었습니다. 이 문서의 목적은 더 DET을 제공하는 것입니다이 간세포 분리 절차 및 일부 분석 ailed 프로토콜 기술의 적절한 재생을 허용한다. 또한, 프로토콜은 새로운 프로토콜과 비교하여 차이를 설명하기 이전의 분리 방법과의 비교를 포함한다.
모든 실험 절차 부르크 대학 의료 센터의 윤리와 동물 관리위원회의 승인을 실시 하였다.
재료 및 버퍼의 1. 준비
간 단일 세포 현탁액 2. 준비
유동 세포 계측법을 사용하여 세포 수의 3 결정
참고 : 이상적으로, 아래에서 설명하는 유동 세포 계측법 기반의 셀 정량화 대신 고전 노이 바 우어 챔버 기반 방법을 제안 셀 수, 자동 세포 계수기 또는를 결정하십시오. 2 단계에서 설명한 간 단일 세포 현탁액이 크게 다른 크기와 입도와 실질과 비 실질 세포 (NPC)가 포함되어 있습니다. 유동 세포 계측법 사용의 NPC의 게이팅 기능은 앞으로 산란, 측면 산란 (FSC-SSC) 특성과 함께 세포 파편의 적절한 배제는 설명 프로토콜 (12)의 성공을 보장합니다.
전구 하위 집합의 FOW 세포 계측법 분석에 대한 간 단일 세포 현탁액 4. 염색
항독소 | 복제 | 호스트 / 이소 | 주식 농도 [㎎ / ㎖] | 노동 희석 |
CD64 | X54-5 / 7.1 | 마우스의 IgG1, κ | 0.5 | 1 : 100 |
CD16 / 32 | 93 | 쥐의 IgG2a, λ | 0.5 | 1 : 100 |
CD45 | 30-F11 | 쥐의 IgG2b, κ | 0.2 | 1 : 200 |
CD31 | MEC13.3 | 쥐의 IgG2a, κ | 0.5 | 1 : 200 |
ASGPR1 | 클론 염소 IgG를 | 0.2 | 1 : 100 | |
Podoplanin | 2001년 1월 8일 | 시리아 햄스터의 IgG | 0.2 | 1 : 1,400 |
Podoplanin | 2001년 1월 8일 | 시리아 햄스터의 IgG | 0.5 | 1 : 1,400 |
CD133 | Mb9-3G8 | 쥐의 IgG1 | 0.03 | 3 μL |
CD133 | 315-2C11 | 쥐 IGG2A, λ | 0.5 | 1 : 100 |
CD34 | RAM34 | 쥐의 IgG2a, κ | 0.5 | 1 : 100 |
CD90.2 | 53-2,1 | 쥐 IgG2, κ | 0.5 | 1 : 800 |
CD157 | BP-3 | 마우스의 IgG2b, κ | 0.2 | 1 : 600 |
는 EpCAM | G8.8 | 쥐의 IgG2a, κ | 0.2 | 1 : 100 |
무서-1 | D7 | 쥐의 IgG2a, κ | 0.03 | 10 μL |
마우스의 IgG2b, κ | MPC-11 | 0.2 | ||
쥐의 IgG1 | RTK2071 | 0.2 | ||
쥐의 IgG2b, κ | RTK4530 | 0.2 | ||
쥐의 IgG2a, κ | RTK2758 | 0.5 | ||
쥐의 IgG2a, κ | RTK2758 | 0.2 | ||
시리아 햄스터의 IgG | SHG-1 | 0.2 | ||
시리아 햄스터의 IgG | SHG-1 | 0.5 | ||
보통 염소 IgG를 제어 | 클론 염소 IgG를 | 1 | ||
당나귀 방지 염소 IgG의 | 당나귀의 IgG | 이 | 1 : 800 | |
스트렙 타비 딘 | 1 | 1 : 400 |
1 번 테이블.
항독소 | 1 | 이 | 삼 | 4 | (5) |
CD45 APC / Cy7 | 쥐의 IgG2b, κ 0.5 μL | + | + | + | + |
CD31 비오틴 | + | 쥐의 IgG2a, κ 0.5 μL | + | + | + |
ASGPR1 정제 | + | + | 보통 염소 IgG를 제어 0.2 μL | + | + |
Podoplanin APC | + | + | + | 시리아 햄스터의 IgG 1:14 희석 1 μL | + |
CD133 PE | + | + | + | + | 쥐의 IgG1 0.45 μL |
당나귀 방지 염소 알렉사 플 루어 488 | + | + | + | + | + |
스트렙 타비 딘 알렉사 플 루어 (405) | + | + | + | + | + |
표 2.
전구 세포의 5. 자기 마이크로 비드 기반 심화
여러 간을에서 결합 전구 세포 하위 집합 6. 자기 마이크로 비드 기반의 자동화 된 세포 정화
주 : 전구 세포 서브셋 희귀 세포 집단을 대표하므로, 다중 조합 간에서 세포는 종종 추가 실험을 위해 충분한 세포 수를 달성하기 위해 필요하다. 예를 들어, gp38 및 CD133 + + 세포 분리 같이 설명한다.
7. 유동 세포 계측법 셀 정렬
주 : 전구 세포 서브셋 고순도 정렬은 후술되는 프로토콜에 의해 달성 될 수있다. 셀의 전체 수율은 단계 6에 기재된 유전자 발현 분석을위한 가장 좋은 것보다 훨씬 낮다.
매개 변수 | 환경 |
노즐 크기 | 85 μm의 |
회수 | 46.00-46.20 |
진폭 | 38.30-55.20 |
단계 | 0 |
드롭 지연 | 28.68-28.84 |
감쇠 | 떨어져서 |
첫 번째 드롭 | 284-297 |
대상 갭 | (9) - (14) |
압력 | 45 PSI |
표 3.
실질 비 실질 간세포 (도 1 및도 2a)를 포함하는 단일 세포 현탁액 효소 결과의 신규 한 혼합물을 사용하여 간 소화 여기 제시된 방법. 적혈구의 ACK-용균 후, 단일 세포 현탁액 계측법 분석 직접적인 유동이 가능 (도 1 및 2)이다. 게이팅 전략은 이중선과 죽은 세포 (그림 2a)의 배제를 포함한다. CD45, CD31, 및 ASGPR1 ?...
간 염증과 다른 기원의 부상 전구 세포 확장 및 활성화 2, 3을 동반하는 간에서 재생 프로세스를 트리거합니다. 이러한 간 전구 세포는 세포의 특성을 가지고 줄기 가능성 각종 간 질환의 pathomechanism에서 중요한 역할을한다.
간 전구 세포의 이질성 오랫동안 제안되어왔다. 다른 표면 마커를 운반 서브 세트를 식별하고 간 손상
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.
이 작품은 VLK에 알렉산더 폰 훔볼트 재단 Sofja Kovalevskaja 수상에 의해 지원되었다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1% stock solution |
10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5% (v/v) BSA and store on ice |
Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1,400, marks progenior cells |
Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1,400 |
CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µL, marks progenitor cells |
CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µL |
Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
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