JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פציעות כבדות מלוות הרחבת תא ובתאים מייצגים אוכלוסייה הטרוגנית תא. סיווג רומן של תא הסלולר זה מאפשר הבחנה של תת מרובים. השיטה המתוארת כאן ממחישה את הזרימה cytometry ניתוח ובידוד טוהר גבוה של תת שונים שיכול לשמש מבחנים נוספים.

Abstract

במהלך פציעות כבדות כרוניות, ובתאים להרחיב בתהליך הנקרא תגובת ductular, אשר כרוך גם ההופעה חודר לתוך הסלולר דלקתי הפעלה תא אפיתל. אוכלוסיית התאים ובתאים במהלך תגובות דלקתיות כגון בעיקר נחקרה באמצעות סמני משטח אחד, בין אם על ידי ניתוח היסטולוגית או על ידי זרימת טכניקות cytometry מבוסס. עם זאת, סמני משטח רומן זיהו שונה תת ברורים מבחינה תפקודית בתוך ובתאים הכבדים / גזע תא תא. השיטה המוצגת כאן מתארת ​​את הבידוד זרימת מפורט cytometry ניתוח של תת ובתאים באמצעות שילובים סמן משטח הרומן. יתר על כן, הוא מדגים כיצד תת תאים ובתאים השונים יכול להיות מבודד עם טוהר גבוה באמצעות אוטומטיות מגנט FACS שיטות מיון מבוסס. חשוב לציין, הרומן דיסוציאציה האנזימטית פשוטה של ​​הכבד מאפשר בידוד של אוכלוסיות תאים נדירות אלה עם כדאיות גבוההכי עדיף בהשוואה לשיטות קיימות אחרות. זה רלוונטי במיוחד ללימוד נוסף ובתאים במבחנה או לבידוד RNA באיכות גבוהה לנתח את פרופיל ביטוי גנים.

Introduction

התחדשות כבדה מזוהית בעיקר עם קיבולת החידוש העצמי של hepatocytes. עם זאת, פציעות כבדות כרוניות להתרחש עם הפעלת תא אב והתרחבות, אשר נקשרו עם יכולת להתמיין hepatocytes ו cholangiocytes 1, 2, 3, 4. זה רלוונטי במיוחד כי, במהלך פציעות כרוניות, התפשטות hepatocyte אינה יעילה. למרות מחקרי מעקב גנטי מיקוד מרובים ובתאים, תפקידם ההתחדשות כבדה נשאר שנוי במחלוקת 5, 6, 7, 8. יתר על כן, ההפעלה ובתאים נקשרה בתגובת fibrotic גדלה בכבד, מה שמעלה שאלות לגבי תפקידם המדויק במהלך פציעות 9, 10.

האופי ההטרוגני של תא תא האב הוצע ארוך על ידי מחקרי התבטאות גנים מבודדים ובתאים להביע סמן משטח יחיד באמצעות microdissection או מיון תא מבוסס שיטות 1, 11. ואכן, לאחרונה, שילוב סמן משטח רומן באמצעות gp38 (podoplanin) מקושר באופן חד משמע סמנים יחידים קודמים של ובתאים כדי תת שונה 12. חשוב לציין, תת אלה לא היו שונים רק הביטוי סמן פני השטח שלהם, אלא גם הציג שינויים תפקודיים במהלך פציעות 12.

במודלים של בעלי חיים מרובים כבר נוצל כדי לחקור הפעלת תא אב והתחדשות כבדה. נראה כי סוגי הפציעה השונים לקדם את ההפעלה שונה תת קבוצות של ובתאים 12. זה עשוי להסביר את phהבדלי enotypic תגובת ductular שנצפתה אצל בני אדם 4. לפיכך, פנוטיפי מורכבים והניתוחים תפקודיים של ובתאים הם מרכזיים להבין את תפקידם פציעות ואת המשמעות האמיתית של תגובת ductular במחלות כבדות.

מלבד שילובים סמן משטח, ההבדלים המכריעים פרוטוקולי בידוד תא לסבך עוד יותר את המסקנות בהתבסס על מחקרים קודמים 2. חלק גדול ממאגרי נפט המחקרים התייחסו התפקיד של ובתאים כי שונים מאוד בפרוטוקול בידודם (למשל, דיסוציאציה הכבד (שילוב אנזים ומשך התהליך), בינוני צפיפות, ומהירות צנטריפוגה) 2. טכניקת בידוד אופטימיזציה, מתן כדאיות טובה יותר עבור אוכלוסיות תאים נדירות ומהורהרת של רכב משנה, פותחה ופורסמה 12 לאחרונה. מטרת מאמר זה היא לספק יותר detפרוטוקול שמציק של הליך בידוד תא הכבד הזה ואת ניתוח המשנה כדי לאפשר הרבייה הנכונה של הטכניקה. בנוסף, הפרוטוקול כולל השוואה עם שיטת הבידוד הקודמת המצביעים על ההבדלים לעומת הפרוטוקול החדש.

Protocol

כל הפרוצדורות בוצעו באישור של אתיקה ועדות לטיפול בבעלי חיים של המרכז הרפואי האוניברסיטאי Homburg.

1. הכנת חומרים חוצצים

  1. טרי להכין את כל המאגרים הנדרש לעיכול כבד באמצעות רכיבים סטרילית במנדף למינרית כדי למנוע זיהום חיידקים.
  2. הכן את החיץ אוסף (CB) על ידי ערבוב 49.5 מ"ל של מדיום RPMI ו -0.5 מ"ל של סרום שור העובר (FBS; רעלן פנימי נמוך, חום מומת) כדי להשיג פתרון 1% (v / v). אחסן את הפתרון על הקרח עד לשימוש נוסף.
    הערה: כ 25 מיליליטר של CB יש צורך לעכל כבד אחת שלם.
  3. הכן את החיץ העיכול (DB) באמצעות המרכיבים הבאים: בינוני RPMI, 1% (v / v) FBS (רעלן פנימי נמוך, חום מומת), P collagenase (0.2 מ"ג / מ"ל), DNase-I (0.1 מ"ג / מ"ל) , ו dispase (0.8 מ"ג / מ"ל).
    הערה: כ 25 מיליליטר של DB יש צורך לעכל כבד אחת שלם. טרום לחמם את DB ב tהוא באמבט מים 37 ° C לפני השימוש.
  4. לשקם את האנזימים עם הגעתם תמיסת מלח מאוזנת "הנקס (HBSS; collagense P ו dispase) או ב DNase-לי חיץ (50% (v / v) גליצרול, 1 מ"מ MgCl 2, ו -20 מ"מ טריס-HCl; pH 7.5) , aliquot אותו, ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס. אחסן את DNase-לי חיץ על 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בו בתוך חודשיים.

2. הכנת השעית תא בודד כבדה

  1. להרדים עכברי-בר מטופל על ידי נקע בצוואר רחם בהתאם האתיקה המקומית ועדות לטיפול בבעלי החיים.
  2. מניחים את העכברים על קרש החיתוך להרטיב את הפרווה עם אתנול 70%. בעזרת מספריים, לפתוח את הבטן עם חתך קו האמצע של העור, ואחריו חתך Y-לקראת הגפיים. פתח את הצפק עד עצם החזה באמצעות מספריים. על מנת לחשוף את הכבד, לעקור את המעי בעדינות לצד ימין באמצעות מקלון צמר גפן.
  3. בעזרת מספרי מלקחיים, להסיר את האונה של הכבד,עוזב את כיס המרה מאחור, למנוע זיהום עם רקמת חיבור. לשקול את הכבד ומניחים אותו על קרח בצלחת פטרי המכילות HBSS.
  4. מניח את האונה של הכבד על צלחת פטרי יבשה וחתך את רקמת הכבד לקוביות הומוגנית כ -2 מ"מ צד באמצעות אזמל. מעבירים את חתיכות לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל קונית.
  5. להוסיף 2.5 מיליליטר של DB אל צינור צנטריפוגות חרוטי 15 מיליליטר המכיל את החתיכות הכבדות ומניח אותו באמבט מים 37 ° C כדי להתחיל את תהליך העיכול (כבד בריא לוקח 60-70 דקות כבדות שחמת לוקח 80-90 דקות ).
    הערה: אם הכבד כולו אחד הוא מתעכל, הכבד צריך להיות מופרד לשני 15 מיליליטר חרוטי צינורות צנטריפוגות כדי להבטיח כדאיויות תא טובות.
  6. הכין צינור צנטריפוגות חרוטים חדש 15 מיליליטר לאסוף תאים כבדים שוחררו. מניח רשת מסנן 100 מיקרומטר פוליאמיד על החלק העליון של הצינור להרטיב את הרשת עם 800 μL של CB. מניח את צינור צנטריפוגות חרוטים על קרח.
  7. מערבבים את סםPles באמבט מים 37 ° C לאחר 5 ו -10 דקות כדי לתמוך בתהליך העיכול על ידי טלטול צינור צנטריפוגות חרוטי 15 מ"ל המכיל את חתיכות הכבד.
  8. 15 דקות לאחר תחילת העיכול, לערבב בעדינות את החתיכות הכבדות בעזרת פיפטה 1,000 μL עם קצה לחתוך המאפשר חתיכות הכבדות לעבור בקלות. מניחים את הצינורות בחזרה לתוך אמבט מים ולאפשר את החלקים להסתפק 2 דקות.
  9. הסר את supernatant המכיל את התאים המופץ (בדרך כלל 2x 700 μL) ולהוסיף אותו אל הצינור מוכן בשלב 2.6. החזר את supernatant להסיר עם DB (2x 700 μL) ולמקם אותו בחזרה לתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  10. חזור על התהליך מתואר בשלב 2.8 (בדרך כלל 30, 40, 50, 55, ו -60 דקות) עד כ 60-70 דקות חלפו מאז תחילת העיכול. מ 40 דק 'ואילך, החתיכות הכבדות הנותרים צריכות להיות קטנות מספיק כדי לעבור דרך קצה פיפטה נימול 1,000-μL.
    הערה: כבד בריא הוא DIGEsted מלא בתוך 60-70 דקות, בעוד כבד fibrotic בדרך כלל צריך 80-90 דקות. לפי זה נקודת זמן, רקמת הכבד לא צריכה להיות גלויה בצינור 15 מיליליטר צנטריפוגות החרוטים המכילים את החתיכות הכבדות, וכל התאים שוחררו יועברו לתוך הצינור המוכן בשלב 2.6.
  11. בסוף תהליך העיכול, לאסוף את התאים צנטריפוגות עליהן במשך 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות מופחת האצה / 4 האטה / 2).
  12. Resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל של אשלגן אמוניום כלוריד (ACK) תמוגה חיץ דגירה זה עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר כדי lyse את כדוריות הדם האדומות. עצור את התגובה על ידי הוספת 5 מ"ל של CB, ולאחר מכן צנטריפוגות התאים למשך 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות מופחת האצה / 4 האטה / 2). Resuspend התאים 4 מ"ל של CB ולאחסן אותם על הקרח. ספירת התאים, כמתואר בשלב 3.
    הערה: תא גלולה רופף, ולכן supernatant הוא pipetted משם במקום להיות יצק.

3. קביעה של ספירת כדוריות שימוש cytometry הזרימה

הערה: לקביעת ספירת התאי, דלפק תא אוטומטי או, באופן אידיאלי, זרימת cytometry מבוססת כימות התא המתואר להלן הוא הציעה במקום השיטה הקאמרית מבוסס נויבאואר הקלסית. השעית התא בודד כבד כמתואר בשלב 2 מכילה parenchymal ותאי הלא parenchymal (NPC) עם בגדלים שונים באופן משמעותי רמות פירוט. ההדרה התקינה של פסולת הסלולר יחד עם gating-על פיזור קדימה, פיזור צד (FSC-SSC) המאפיין של NPCs בעת שימוש cytometry זרימה מבטיחה את ההצלחה של הפרוטוקול המתואר 12.

  1. הכן aliquot של השעיה תא הכבד (20 μL) ולהוסיף 174 μL של בופר פוספט (PBS) ו -6 μL של יוד propidium (PI; ריכוז בסוף 0.375 מיקרוגרם / מ"ל). להוסיף חרוזים לספור המאפשרים כימות של תאים.
  2. שער על SSC-A-FSC-A כדי למנוע פסולת נוספת לכלול כפילויות באמצעות FSC-H ו FCS-A.
    הערה: חשוב לעקוב אחרי האסטרטגיה gating מתואר באיור 2.
  3. שער את התאים המתים PI-חיובי, למדוד 30 μL ממדגמים שלך, ולהקליט את האירועים. פעל על פי ההנחיות של היצרן כדי לחשב את ספירת תאי.
    הערה: בצע את שלבי 4 עבור זרימת cytometry מדידה, שלבי 5 ו -6 עבור בידוד תא מגנטי מבוסס אב, ודורך 7 עבור זרימת cytometry מעין תת-אוכלוסיות אב.

4. מכתים של ההשעיה תא בודד הכבד לניתוח Cytometry Fow של קבוצות משנה ובתאים

נוֹגְדָן Clone מארח / אלוטיפ ריכוז המניות [מ"ג / מ"ל] מְהִילָה
CD64 X54-5 / 7.1 עכבר IgG1, κ 0.5 1: 100
CD16 / 32 93 עכברוש IgG2a, λ 0.5 1: 100
CD45 30-F11 עכברוש IgG2b, κ 0.2 1: 200
CD31 MEC13.3 עכברוש IgG2a, κ 0.5 1: 200
ASGPR1 Polyclonal עיזים IgG 0.2 1: 100
Podoplanin 2001/01/08 אוגר סורי IgG 0.2 1: 1,400
Podoplanin 2001/01/08 אוגר סורי IgG 0.5 1: 1,400
CD133 Mb9-3G8 IgG1 עכברוש 0.03 3 μL
CD133 315-2C11 איג עכברושG2a, λ 0.5 1: 100
CD34 RAM34 עכברוש IgG2a, κ 0.5 1: 100
CD90.2 53-2,1 עכברוש IgG2, κ 0.5 1: 800
CD157 BP-3 עכבר IgG2b, κ 0.2 1: 600
EpCAM G8.8 עכברוש IgG2a, κ 0.2 1: 100
SCA-1 D7 עכברוש IgG2a, κ 0.03 10 μL
עכבר IgG2b, κ MPC-11 0.2
IgG1 עכברוש RTK2071 0.2
עכברוש IgG2b, κ RTK4530 0.2
עכברוש IgG2a, κ RTK2758 0.5
עכברוש IgG2a, κ RTK2758 0.2
אוגר סורי IgG SHG-1 0.2
אוגר סורי IgG SHG-1 0.5
בקרת עיזים IgG רגילה Polyclonal עיזים IgG 1
IgG אנטי עיזים וחמורים דונקי IgG 2 1: 800
streptavidin 1 1: 400

שולחן 1.

נוֹגְדָן 1 2 3 4 5
CD45 APC / Cy7 עכברוש IgG2b, κ
0.5 μL 		+ + + +
CD31 ביוטין + עכברוש IgG2a, κ
0.5 μL 		+ + +
ASGPR1 מטוהרים + + בקרת עיזים IgG רגילה
0.2 μL 		+ +
Podoplanin APC + + + אוגר סורי IgG
1 μL של דילול 01:14 		+
PE CD133 + + + + IgG1 עכברוש
0.45 μL
אנטי-עיזים וחמורים
אלקסה פלואוריד 488 		+ + + + +
streptavidin
אלקסה פלואוריד 405 		+ + + + +

שולחן 2.

  1. הוסף aliquot של השעיה התא משלב 2.11 לתוך צינור התגובה (1.5 מ"ל) המכיל 2.5 x 10 5 תאים, נקבע כמתואר בשלב 3.
  2. צנטריפוגה התאים 3 דקות ב 300 XG ו -4 מעלות צלזיוס באמצעות microcentrifuge.
    הערה: בשלב זה, משאבת ואקום יכולה להיות מנוצלת כדי להסיר את supernatant בזהירות.
  3. Resuspend התא גלולה בתמהיל Fc-בלוק דגירה זה במשך 5 דקות על הקרח. הכינו תערובת Fc-בלוק בהיקף כולל של 50 μL לכל כתם. הוסף 10 μL של מגיב FCR-חסימה, 1 μL של אנטי CD64 מטוהרים (1: 100; 0.5 מיקרוגרם / כתם), ו -40 μL של חיץ מכתים (חיץ ST: HBSS, 1% (v / v) FBS, ו 0.01% אזיד הנתרן) לכל כתם.
    הערה: אזיד הנתרן היא רעילה ביותר. יש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים, כגון כפפות ניטריל, מעיל מעבדה, מסיכת פנים.
  4. הוסף 50 μL של מכתים לערבב לתאים (הנפח הכולל של התאים הוא כעת 100 μL) ו דגירה התאים עם תערובת נוגדנים, מוגן מפני אור במשך 20 דקות על הקרח.
  5. מכינים את תערובת נוגדנים בהיקף כולל של 50 μL לכל כתם. במשך 50 μL של ST חיץ, מוסיפים את נוגדנים מצומדות הבאים מכתים בסיסיים: CD45 (0.5 μL; 1: 200; 0.1 מיקרוגרם / כתם), CD31 (0.5 μL; 1: 200; 0.25 מיקרוגרם / כתם), ASGPR1 (1 μL ; 1: 100; 0.2 מיקרוגרם / כתם), podoplanin (1 μL של דילול 1:14; 1: דילול סוף 1400; 0.014 מיקרוגרם / כתם), ו CD133 (3 μL; 0.09 מיקרוגרם / כתם).
    הערה: טבלה1 מסכם את שיבוטי דילולי נוגדן מנוצלים עבור כתמים בסיסיים עבור סמני משטח נוספים של תת השונה. כן השעיות תא נוספים עבור לערבב נוגדן המכיל בקרות אלוטיפ המקביל ו / או קרינה מינוס אחד שולט (FMOs), כפי שהוא מתואר בטבלה 2.
  6. להוסיף 400 μL של ST חיץ לדגום כל בצנטריפוגה תאים עבור 4 דקות ב 300 XG ו -4 ° C.Discard supernatant ו resuspend התאים 100 μL של תערובת נוגדנים משני המכיל 0.125 μL של IgG נגד עז חמור (1: 800; 0.25 מיקרוגרם / כתם) ו -0.25 μL של streptavidin ניאון מצומדות (1: 400; 0.25 מיקרוגרם / כתם) ב 100 μL של חיץ ST.
  7. דגירת התאים בעוד מוגן מפני אור ועם תמהיל הנוגדן עבור 20 דקות על קרח. להוסיף 400 μL של ST חיץ לדגום כל בצנטריפוגה תאים עבור 4 דקות ב 300 XG ו -4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant ו resuspend התאים 300 μL של חובב STאה המכיל 0.25 מיקרוגרם / מ"ל ​​לצרכן.
    הערה: כדאיות התא של ובתאים פוחתת עם הזמן; ולכן, הוא הציע למדוד דגימות טריות בהקדם האפשרי.

5. עשרת Microbead מבוסס מגנטיים של ובתאים

  1. העבר aliquot של השעית תא בודד כבד המכיל 1.5-2 x 10 6 תאים, המבוססים על ספירת התאים נקבעה כמתואר בשלב 3, לתוך צינור צנטריפוגות חרוטים חדש של 15 מיליליטר.
  2. צנטריפוגה התאים במשך 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות מופחת האצה / 4 האטה / 2).
    הערה: בדרך כלל, C57Bl בריא אחד / 6 כבד עכבר (או 1 גרם של רקמת כבד) יהיה צורך לחלק לשלושה צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר קונית.
  3. Resuspend התאים 400 μL של 0.5% HBSS (v / v) אלבומין בסרום שור (BSA) ולהוסיף 40 μL של microbeads אנטי CD31 ו -30 μL של microbeads אנטי CD45. דגירת התאים במשך 15 דקות ב 4 ° C.
    הערה: אין לעבור tהוא זמן הדגירה, כמו טוהר ההפרדה יופחת באופן משמעותי.
  4. הוסף 5 מ"ל של HBSS 0.5% (v / v) BSA אל התאים צנטריפוגות עליהן במשך 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות מופחת האצה / 4 האטה / 2).
  5. Resuspend התא גלולה ב 100 μL של חרוזים להסרת תאים מתים דגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. בינתיים, להכין עמודה ההפרדה LS ולכייל אותו עם 3 מ"ל של 0.5% HBSS (v / v) BSA.
    הערה: אין לעבור על זמן הדגירה, כמו טוהר ההפרדה יופחת באופן משמעותי.
  6. להוסיף 900 ​​μL של HBSS 0.5% (v / v) BSA לתאים, לסנן אותם באמצעות רשת מסנן פוליאמיד 100 מיקרומטר, ומעלה אותם על עמודת הפרדת LS.
    הערה: טען אחד הכבד כולו על עמודת הפרדת LS אחד.
  7. לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 3 מ"ל של HBSS 0.5% (v / v) BSA לאסוף את הזרימה דרך.
  8. צנטריפוגה זרימה דרך עבור 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות acce מופחתleration / 4 האטה / 2).
  9. Resuspend התא גלולה או בשטיפת חיץ (RB) (PBS ו 2 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA)) המכיל 0.5% (v / v) BSA או חיץ ST, בהתאם ההליך ניסויים נוספים.

6. מגנטי טיהור Cell Microbead מבוסס האוטומטית של קבוצות משנה תא אב בשילוב מ כבדי מרובים

הערה: מאחר תת תא האב מייצגים אוכלוסיות תאים נדירות, תאים משלבים בין כבד מרובים נדרש לעתים קרובות כדי להשיג מספרים סלולריים מספיקים עבור ניסויים נוספים. כדוגמא, CD133 + ו- gp38 + הפרדת תא מתואר להלן.

  1. בידוד של אבות CD133 +
    1. לאחר שלב 5.9, לספור את התאים, כמתואר בשלב 3, ו resuspend עד 10 6 תאים (בדרך כלל איגום 4-6 דגימות כבדות בריאות) ב 100 μL של RB.
    2. להוסיף אנטי CD64 1: 100 ואנטי-CD16 / 32 1: 100 אל התאים incubאכלו אותם על קרח למשך 5 דקות. הוסף 1: 100 נוגדן biotinylated אנטי-CD133 לתאים דגירה אותם על קרח למשך 10 דקות נוספות.
    3. הוסף 5 מ"ל של RB צנטריפוגות במשך 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות מופחת האצה / 4 האטה / 2).
    4. Resuspend התאים 400 μL של RB ולהוסיף 10 μL של microbeads אנטי ביוטין. דגירה המדגם במשך 15 דקות ב 4 ° C.. אין לעבור על זמן הדגירה, כמו זה מקטין את הטוהר של הדגימות.
    5. הוסף 5 מ"ל של RB צנטריפוגות במשך 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות מופחת האצה / 4 האטה / 2). Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של RB.
  2. בידוד של gp38 + אבות
    1. לאחר שלב 5.9, לספור את התאים, כמתואר בשלב 3, ו resuspend עד 10 6 תאים (בדרך כלל איגום 4-6 דגימות כבדות בריאות) ב 100 μL של RB.
    2. להוסיף אנטי CD64 1: 100 ואנטי-CD16 / 32 1: 100 על תאי דגירה אותם על קרח למשך 5 דקות. לאחר מכן, להוסיף 1:100 אנטי-gp38 biotinylated נוגדנים לתאי דגירה אותם על קרח למשך 10 דקות נוספות.
    3. הוסף 5 מ"ל של RB צנטריפוגות במשך 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות מופחת האצה / 4 האטה / 2).
    4. Resuspend התאים 400 μL של RB ולהוסיף 5 μL של microbeads אנטי ביוטין. דגירה המדגם במשך 15 דקות ב 4 ° C.. אין לעבור על זמן הדגירה, כמו זה מקטין את הטוהר של הדגימות.
    5. הוסף 5 מ"ל של RB צנטריפוגות במשך 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות מופחת האצה / 4 האטה / 2).
    6. Resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל של RB.
  3. צעדים משותפים אחרי צעד 6.1 או 6.2
    1. מניח את צינור צנטריפוגות חרוטי 15 מיליליטר המכיל השעיות התא המתויגות המגנטי על מדף צמרמורת 5 עם שני צינורות ריקים נוספים לאיסוף שברים החיוביים ושליליים. מניח את מתלת הצמרמורת בפלטפורמת הפרדת המפריד.
    2. השתמש בתכנית הסלקציה החיובית(Possel_d2) עם צעד כביסה נרחב בין כל (אפשרות שטיפה) מדגם.
      הערה: שימוש הפרדה ידנית מבוסס עמודה של תאים במקום המפריד אוטומטית יפחית את הטוהר של המדגם.
    3. אסוף את שבריר צנטריפוגות החיובי עבור 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות מופחת אצה / 4 האטה / 2).
    4. Resuspend התא גלולה או ב RB או חיץ ST, בהתאם ההליך ניסויים נוספים.
    5. לבדיקה טוהר, לקחת aliquot של תאים להכתים אותם כמתואר בשלב 4.

7. מיון תא cytometry הזרימה

הערה: מין טוהר גבוה של כל תת-קבוצה של תאי אב יכולה להיות מושג עם הפרוטוקול המתואר להלן. התשואה הכוללת של תאים היא נמוכה בהרבה מזה שמתואר בשלב 6 והוא טוב ביותר עבור ניתוח ביטוי גנים.

פָּרָמֶטֶר הגדרה
גודל נחיר 85 מיקרומטר
תדירות 46.00 - 46.20
אמפליטודה 38,30 - 55,20
שלב 0
זרוק עיכוב 28,68 - 28.84
הַדלָלָה כבוי
ירידה ראשונה 284 - 297
גאפ יעד 9.-14
לַחַץ 45 psi

טבלה 3.

  1. רוכשת תאים מן העשרה המגנטי מבוסס (כמתואר בשלב 5); לספור אותם, כמתואר בשלב 3; ו להכתים אותם סמנים אב (CD133, gp38), CD31, ASGPR1 ו CD45, כמוסבר בשלב 4.
  2. כן בינוני מיון (SM): אדום-פנול חינם Dulbecהנשר שונה של שיתוף של בינוני (DMEM) המכיל 0.5% (v / v) BSA ו 0.01% (v / v) אזיד הנתרן. Resuspend התאים מוכתם ב SM, ולהעביר אותם לתוך צינור פוליפרופילן מסביב לתחתית, ומניחים אותם על הקרח.
    הערה: אזיד הנתרן היא רעילה ביותר. יש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים, כגון כפפות ניטריל, מעיל מעבדה, מסיכת פנים. אין להשתמש יזיד הנתרן אם תאי ממוינים משמשים מבחנים תפקודיים.
  3. השתמש בתוכנה המתאימה לסוג של סדרן המשמש בידוד התא. פתח את התוכנה ובצע את הוראות היצרן כדי להגדיר את הפרמטרים מיון ומפרטים המכונה.
    הערה: המפרטים המכונית מסוכמים בטבלה 3. בעוד מפרטי המכונה יכולים להיות שונים במוסדות שונים, חשוב לציין כי הפחתת לחץ מיון בגודל פיה גדולה יותר יש צורך (45 psi זרבובית 85 מיקרומטר) כדי להגדיל את הכדאיות של תאים ובתאי populatיון ואת האיכות של רנ"א המוכן מן התאים הממוינים. חשוב להשתמש ובתאים כבדים מועשרים לקביעת הפיצוי. אוכלוסיות כבדות או לויקוציטים אחרות יש פלואורסצנציה אוטומטית ו תוצאה אחרת בהחלטה הכי מוצלחת של האוכלוסייה סטרומה באסטרטגית gating שווא.
  4. כייל את המכשיר ומניחים צינור 5 מ"ל פוליפרופילן מסביב לתחתית המכיל 350 μL של SM במכשיר אוסף כזה. התחל רכישת מדגם ולמיין. אסוף 1,000 אירועים של תת-האוכלוסייה ולעצור את זרימת המדגם.
  5. קח את הצינור מתוך מכשיר המיון ולמדוד את התאים הממוינים על cytometer את הזרימה. זהה את אחוז אוכלוסיית תא המיון הנוכח בין תאי חיים. אחוז זה נותן את הטוהר של תאים ממוינים.
  6. אם טוהר מיין עולה 95%, להציב צינור מסביב לתחתית פוליפרופילן 5 מ"ל המכיל 350 μL של חיץ RLT תמוגה במכשיר אוסף כזה.
  7. התחל מהסוג ולאסוף 7,000-10,000 אירועים לכל תת-אוכלוסייה סטרומה.
  8. מעבירים את חיץ RLT תמוגה המכיל את התאים מסודרים בתוך שפופרת התגובה DNase- ו RNase ללא ולאחסן את דגימות ב -80 ° C עד לניתוח נוסף.

תוצאות

הנוהל שהוצג כאן לעיכול של הכבד באמצעות תערובת הרומן של תוצאות אנזימים בתוך ההשעיה תא בודד המכיל parenchymal ותאי הכבד הלא parenchymal (איורים 1 ו 2 א). לאחר ACK-lysing של כדוריות דם אדומות, הזרימה הישירה cytometry ניתוח של השעית התא היחיד אפשרי (איור...

Discussion

דלקת כבד ופציעתם של מקורות שונים לעורר תהליכי התחדשות בכבד אשר מלווה בהרחבת תא אב והפעלה 2, 3. ובתאים בכבד אלה יש גזע אופייני תא סביר לשחק תפקיד משמעותי pathomechanism של מחלות כבד שונות.

ההטרוגניות של תאי ?...

Disclosures

יש המחברים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי פרס אלכסנדר פון הומבולדט קרן Sofja Kovalevskaja כדי VLK.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMILife Technologies21875-034
phenol red free DMEMLife Technologies31053-028
FBSLife Technologies10270-106
Collagenase PSigma-Aldrich11249002001
DNAse-ISigma-Aldrich10104159001
DispaseLife Technologies17105041
ACK Lysing BufferLife TechnologiesA10492-01
HBSSLife Technologies14025-050
PBSSigma-AldrichD8537
Sodium AzideSigma-AldrichS2002Prepare 1% stock solution
10% BSAMiltenyi Biotec130-091-376
autoMACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec130-091-222add 0.5% (v/v) BSA and store on ice
Phenol-red free DMEMSigma-AldrichD1145
counting Beads Count BrightLife TechnologiesC36950
PIMiltenyi Biotec130-093-233
FcR Blocking ReagentMiltenyi Biotec130-092-575
anti-CD31 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-097-418
anti-CD45 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-301
Dead Cell Removal KitMiltenyi Biotec130-090-101
anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-485
CD64 PurifiedBioLegend139302Dilution: 1:100
CD16/32 PurifiedBioLegend101302Dilution: 1:100
CD45 APC/Cy7BioLegend103116Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells
CD31 BiotinBioLegend102504Dilution: 1:200, marks endothelial cells
ASGPR1 PurifiedBio-TechneAF2755-SPDilution: 1:100, marks hepatocytes
Podoplanin APCBioLegend127410Dilution: 1:1,400, marks progenior cells
Podoplanin BiotinBioLegend127404Dilution: 1:1,400
CD133 PEMiltenyi Biotec130-102-210use 3 µL, marks progenitor cells
CD133 BiotinBioLegend141206Dilution: 1:100
CD34 BiotineBioScience13-0341-81Dilution: 1:100
CD90.2 Pacific BlueBioLegend140306Dilution: 1:800
CD157 PEBioLegend140203Dilution: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421BioLegend118225Dilution: 1:100
Sca-1 BiotinMiltenyi Biotec130-101-885use 10 µL
Mouse IgG2b, κ PEBioLegend400311
Rat IgG1 PEBioLegend400407
Rat IgG2b, κ APC/Cy7BioLegend400624
Rat IgG2a, κ BiotinBioLegend400504
Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421BioLegend400535
Syrian Hamster IgG APCBioLegend402012
Syrian Hamster IgG BiotinBioLegend402004
Normal Goat IgG Control PurifiedBio-TechneAB-108-C
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA11055Dilution: 1:800
Streptavidin Alexa Fluor 405Life TechnologiesS32351Dilution: 1:400
100 µm Filter meshA. HartensteinPAS3
LS ColumnMiltenyi Biotec130-042-401
QuadroMACS separatorMiltenyi Biotec130-090-976
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-343
AutoMACS Pro SeparatorMiltenyi Biotec130-092-545
FACS AriaTMIIIBD Biosciences
FACSDiva sofwareBD Biosciences
Polypropylene Round bottom tubeFalcon352063
Rneasy plus mini kitQiagen74134RLT lysis buffer is included

References

  1. Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
  2. Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
  3. Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
  4. Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
  5. Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
  6. Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
  7. Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
  8. Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
  9. Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
  10. Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
  11. Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
  12. Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
  13. Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
  14. Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
  15. Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
  16. Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
  17. Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
  18. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
  19. Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

120gp38CD133cytometry

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved