في فيفو تتبع من تطوير وذمة والأمراض الوعائية الوعائية في نموذج من الملاريا الدماغية التجريبية باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي

Summary

We describe a mouse model of experimental cerebral malaria and show how inflammatory and microvascular pathology can be tracked in vivo using magnetic resonance imaging.

Abstract

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of cerebral malaria can be difficult. We present an experimental mouse model of cerebral malaria that shares multiple features of the human disease, including edema and microvascular pathology. Using magnetic resonance imaging (MRI), we can detect and track the blood-brain barrier disruption, edema development, and subsequent brain swelling. We describe multiple MRI techniques that can visualize these pertinent pathological changes. Thus, we show that MRI represents a valuable tool to visualize and track pathological changes, such as edema, brain swelling, and microvascular pathology, in vivo.

Introduction

والملاريا مشكلة صحية عالمية كبيرة. ¹ تتميز الملاريا الشديدة جزئيا بالاشتراك الدماغي وغالبا ما تكون عاملا نذيريا ضعيفا. وتشترك الشلل الدماغي في الأطفال الذين تقل أعمارهم عن خمس سنوات في المناطق التي تنتقل فيها الإصابة بالملاريا، وتمثل السبب الرئيسي للوفاة المرتبطة بالملاريا في تلك الفئة العمرية. ^{1 في} حين أن العلاج العدواني يمكن أن يكون المنقذة للحياة، والكشف عن الملاريا الدماغية، وخاصة في المراحل المبكرة، يمكن أن يكون صعبا. وتشمل العمليات المرضية التي تنطوي على الملاريا الدماغية اضطراب الأوعية الدموية الدقيقة وذمة دماغية، والتي يمكن أن تؤدي إلى تورم شديد في المخ. في هذه المقالة، نقدم التصوير بالرنين المغناطيسي (مري) البروتوكول الذي يسمح كله الدماغ في الجسم الحي التصوير من الملاريا المخية التجريبية (إسم). وقد تم استخدام أساليب التصوير ذات الدقة العالية في الدماغ بأكمله على نطاق واسع في هذا المرض، على الرغم من أن القليل من المعروف عن كيفية بدء إسم في وسطالجهاز العصبي أو ما آليات محددة تؤدي إلى المرض. في التصوير بالرنين المغناطيسي الجسم الحي ، التي تغطي الدماغ كله، يمثل أداة بحثية هامة للحصول على فهم أفضل لعلم الأمراض إسم. التصوير بالرنين المغناطيسي قادر على تقييم تورم الدماغ الدماغية العالمية، والتي تم الاعتراف بها مؤخرا لتكون مؤشرا هاما للوفاة ليس فقط في إسم، ولكن أيضا في الملاريا الدماغية البشرية. ^{2 ، 3} يحدث تورم شديد في الدماغ في المرض القاتل ويمثل واحدة من العديد من الميزات المرضية بين نماذج إسم والأمراض البشرية، وهو المرض الذي يتميز كل من التغيرات الالتهابية والأوعية الدموية الدقيقة. ⁴

يمكن أن يسببها إسم في الفئران سبا أو C57BL من خلال العدوى مع الفطرية بلاسموديوم بيرغي أنكا. ⁵ بداية من إسم يحدث عادة بين أيام 6 و 10 بعد العدوى ويؤدي إلى المناسب، وترنح، وضيق في الجهاز التنفسي، والغيبوبة، مما يؤدي إلى الرابمعرف الموت. ⁴ السريع غيبوبة الفئران والسلوك مقياس (رمكبس) هو نتيجة مفيدة لتقييم الأعراض السريرية لل إسم. وهو يتألف من 10 المعلمات، وسجل كل من 0 إلى 2، مع أقصى درجة ممكنة من 20. ^{6 في} الآونة الأخيرة، أظهرنا اتفاق جيد بين شدة درجات رمكبس في الفئران إسم والتغيرات المرضية التي أظهرها التصوير بالرنين المغناطيسي. ⁷ في هذا البروتوكول، ونحن تصف إسم تحريض في الفئران وفي الجسم الحي التصوير بالرنين المغناطيسي من الفئران مع إسم.

Protocol

أجريت جميع التجارب على الحيوانات المذكورة في هذه المقالة وفقا لاتحاد جمعيات علوم الحيوان المختبرية (فيلاسا) الفئة B وجمعية العلوم الحيوانية المختبرية (غف-سولاس) المبادئ التوجيهية القياسية والتي تمت الموافقة عليها من قبل السلطات الألمانية المحلية في كارلسروه (ريجيرونسبراسيديوم كارلسروه ، ألمانيا). يرجى ملاحظة أن مستوى بيوسافيتي 2 ينطبق على البعوض و بلاسموديوم بيرغي أنكا سبوروزويت العمل.

1. العدوى

1. تصيب البعوض أنوفيلس ستيفنسي مع بلاسموديوم بيرغي أنكا عن طريق إطعامهم لمدة 15 دقيقة على الماوس غاميتوسيتيميك. الحفاظ على البعوض المصابة في 80٪ الرطوبة و 21 درجة مئوية.
2. جمع البعوض الإناث من القفص 17 إلى 22 يوما بعد وجبة الدم. وضعها على الجليد لتخدير لهم.
3. باستخدام ملقط، وضع ثلاثة إلى أربعة البعوض على شريحة زجاجية مغطاة قطرة من المتوسطة رمي الباردة. وضع الشريحة تحت المجهر.
<لي> باستخدام ملقط، تمتد بعناية البعوض بين الرأس والجسم. عزل الغدة اللعابية باستخدام حقنة وإبرة. كرر هذا الإجراء مع البعوض المتبقية.
4. جمع الغدد اللعابية من الشريحة الزجاجية عن طريق مص لهم حتى مع ماصة الزجاج وجمعها في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل.
   ملاحظة: اعتمادا على معدلات العدوى، وعادة ما يمكن الحصول على 8،000 إلى 15،000 البثور المعدية في الغدة اللعابية.
5. لمدة 3 دقائق تقريبا، تحطيم الغدد اللعابية المعزولة داخل أنبوب الطرد المركزي مع عصا صغيرة من البلاستيك لعزل البثور من أنسجة الغدة اللعابية.
6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 1000 x ج و 4 درجة مئوية لتنقية سبوروزويتس من الأنسجة المتبقية.
7. ماصة طاف، الذي يحتوي على سبوروزويتس (سفز)، إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد وعد سبوروزويتس المنقى في عدادة الكريات نيوباور.
8. ضبط تركيز سبوروزويتس المنقى إلى 10،000 / مل بإضافة فأوزفات مخزنة المالحة.
9. حقن ما مجموعه 1000 سبوروزويتس (0.1 مل) في الأوردة الذيل من C57BL الفئران / 6 الفئران لبدء العدوى. لتسهيل الحقن، ووضع C57BL / 6 الفئران في ضبط النفس ووضع ذيول في الدافئة (حوالي 37 درجة مئوية) المياه للمساعدة في التصور من الأوردة الذيل.
   ملاحظة: الحقن في حد ذاته هو إجراء قصير التي يمكن أن يؤديها في غضون ثوان قليلة.
10. مرة واحدة يوميا، والتحقق من الطفيليات مرحلة الدم على مسحات الدم من يوم 3 فصاعدا بعد الإصابة سفز.
    ملاحظة: رصد تطفل الدم سبق تصور في مقالة جوف من قبل مولر وآخرون. ⁸
11. تقييم الفئران مرة واحدة يوميا مع غيبوبة الفئران السريع وسلوك مقياس (رمكبس) النتيجة، بدءا من اليوم 5 بعد حقن سبوروزويت.
    ملاحظة: تم نشر وصف مفصل لهذا الإجراء، بما في ذلك عرض فيديو، من قبل كارول وآخرون. ⁶
12. تقييموالفئران مع التصوير بالرنين المغناطيسي وفقا لنتيجة رمكبس والمسألة البحثية التي يتعين معالجتها. ⁶

2. إعداد التصوير بالرنين المغناطيسي

1. أداء التصوير بالرنين المغناطيسي على 9.4T الماسح الضوئي الحيوانات الصغيرة باستخدام مرنان حجم لنقل الترددات الراديوية و 4 قناة على مراحل مجموعة لفائف استقبال السطح. بدوره على حمام المياه التي تسيطر عليها درجة الحرارة إلى 42 درجة مئوية من أجل الحفاظ على درجة حرارة الجسم من الماوس.
2. تخدير التخدير في غرفة باستخدام 2٪ إيسوفلوران والهواء المضغوط حتى الماوس لم يعد يتفاعل مع قرصة أخمص قدميه. الحفاظ على التخدير في 1-1.5٪.
3. وضع قسطرة الوريد الذيل في الوريد ذيل الماوس. ضع الماوس على التصوير بالرنين المغنطيسي عن طريق وضعه عرضة ومع عودة مثقوبة على سرير الحيوان مجهزة هيدلوك وشريط الأسنان لتقليل حركة الرأس. الحرص على عدم تصويب العمود الفقري العنقي من الماوس.
4. ربط نظام حقن وكيل النقيض إلى القسطرة الوريد الذيل. استخدام نظام حقن مخصص مملوءة حقنة غ-دتبا (0.3 مليمول / كلغ) أو استخدام أنابيب بي متصلة حقنة غ-دتبا (0.3 مليمول / كلغ) حقنة.
5. تطبيق مرهم العين ديكسبانتينول لكلا العينين. وضع ملف رئيس استقبال 4-قناة على مراحل صفيف رئيس على رأس الماوس. وضع وسادة التنفس على الجزء الخلفي من الفأرة وتوصيله إلى جهاز مراقبة التنفس.

3. بروتوكول التصوير

ملاحظة: اختر متواليات التصوير من البروتوكول المدرجة أدناه وفقا لأسئلة البحث التي سيتم تناولها. جميع المعلمات المدرجة صالحة للبرمجيات التصوير بالرنين المغناطيسي ولكن قد تحتاج إلى تعديل إذا تم استخدام برامج أخرى.

1. تبدأ من خلال إجراء المسح المترجمة للتأكد من أن الدماغ الماوس هو في إيزوسنتر من المغناطيس.
2. لتقييم نوعي وذمة فاسوجينيك، واستخدام 3D T2 المرجحة التصوير عن طريق اختيار تسلسل نادر متعددة شريحة.
   1. أدخل الصفحة التالية(2)، زمن صدى = 22 مللي ثانية، قرار متناح = 0.1 مم، مجال الرؤية = 20 × 10 × 12 مم ³ ؛ ماتريكس = 200 x 100 x 120، فليب أنغل = 90-180 °؛ (تدور صدى)، ونادرا عامل = 8. بدء تسلسل وانتظر 10 دقيقة 48 ثانية للحصول على الصور الخام.
3. لتقييم كميا وذمة فاسوجينيك أداء T2 ريلاكسوميتري عن طريق اختيار شريحة متعددة، متعددة تسلسل صدى تدور.
   1. استخدم المعلمات التالية: زمن التكرار = 3.100 مللي ثانية، زمن صدى = 8-136 مللي ثانية في الزيادات من 8 مس، عدد الشرائح = 17، سمك شريحة = 0.7 مم، في دقة الطائرة = 0.116 مم × 0.116 مم، مجال الرؤية 20 x 20 مم ² ، ماتريكس = 172 x 172، زاوية الوجه = 90-180 درجة؛ (تدور الصدى). بدء تسلسل وانتظر 8 دقيقة 53 ثانية لاكتساب الصور الخام.
4. لتقييم كميا وذمة المنشأ على حد سواء وذمة سامة للخلايا، وتنفيذ التصوير المرجح الانتشار / نشر واضح كوففيسينت (أدك) عن طريق تحديد تسلسل انتشار إبي تدور صدى.
   1. استخدم المعلمات التالية: زمن التكرار = 3.400 مللي ثانية، زمن صدى = 20 مللي ثانية، سمك شريحة = 0.7 مم، عدد الشرائح = 17، عدد الاتجاهات المحسسة للانتشار = 30، b القيمة = 1.500 s / مم ² ، δ = 3 مس ، Δ = 9 مللي ثانية، عامل تسريع فورييه الجزئي = 1.51، مجال الرؤية = 12 × 15 مم ² ، مصفوفة = 96 × 128، دقة في الطائرة = 0.125 مم × 0.117 مم، زاوية الوجه = 90-180 درجة، و عدد شرائح التشبع (السهمي) = 1. بدء تسلسل وانتظر 7 دقيقة 56 ثانية حتى يتم الحصول على الصور الخام.
5. لتقييم ميكرويمهاجيس، استخدم 3D T2 * الوزن التصوير. حدد تسلسل فلاش تعويض تدفق.
   1. أدخل المعلمات التالية في برنامج التصوير بالرنين المغناطيسي: زمن التكرار = 2.000 مللي ثانية، وقت صدى = مس 22، قرار متناح 0.08 مم، مجال الرؤية = 32 × 15 × 8 مم ³ ، حجم المصفوفة = 400 × 188 × 100، و fزاوية الشفاه = 12 درجة. بدء تسلسل وانتظر 15 دقيقة 40 ثانية للحصول على الصور الخام.
6. لتقييم المباح الشرايين، واستخدام الوقت من تصوير الأوعية الطيران عن طريق اختيار تسلسل فلاش 3D.
   1. استخدم المعلمات التالية في برنامج التصوير بالرنين المغناطيسي: زمن التكرار = مس 16، زمن صدى = 3،5 مس، سماكة شريحة = 0،07 مم، دقة في المستوي = 0،104 x 0،104 مم، مجال الرؤية = 20 x 20 x 10 مم ³ ، مصفوفة = 192 × 192 × 142، وزاوية الوجه = 15 درجة. بدء تسلسل وانتظر 7 دقيقة 16 ثانية حتى يتم الحصول على الصور.
7. لتقييم الدم في الدماغ الحاجز تعطيل، استخدم 3D T1 المرجحة التصوير قبل وبعد حقن وكيل النقيض من 0.3 مليمول / كغ. حدد تسلسل فلاش مدلل الترددات الراديوية مع إثارة الترددات الراديوية العالمية.
   1. استخدم معلمات التسلسل التالية في برنامج التصوير بالرنين المغناطيسي: زمن التكرار = 5 مللي ثانية، زمن صدى = 1،9 مس، قياس متناح = 0،156 مم، مجال الرؤية 20 x 18،7× 18.7 مم ³ ، مصفوفة 128 × 120 × 120 و زاوية الوجه = 8.5 °؛. بدء تسلسل وانتظر 1 دقيقة 14S حتى يتم الحصول على الصور.

4. معالجة الصور وتحليلها

1. لتحليل الدم في الدماغ الحاجز التعطيل وطرح 3D غير المحسنة T1 المرجحة الصور من الصور المحسنة T1 المرجحة مع أداة حسابية أو صورة أداة حاسبة في إيماجيج. تقييم الصور الطرح لزيادة إشارة، والذي يتوافق مع عرقلة الدم في الدماغ الحاجز. ⁹
2. لتحليل حجم الدماغ، واستخدام الأصلي T1 3D أو 3D T2 المرجحة مجموعات البيانات. ترسيم الدماغ من لمبة الشم إلى المخيخ باستخدام محرر تجزئة. ¹⁰
3. الوذمة فاسوجينيك
   1. معالجة البيانات T2 ريلاكسوميتري مع برنامج التصوير بالرنين المغناطيسي أو استخدام غير المربوطة أقل مربعات تناسب الإجراء. ¹¹ عملية مرجحة نشر البيانات للحصول على خرائط أدك باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي أريكةتوار أو فدت الأدوات (انظر المواد الجدول ).
   2. مناطق مكان الفائدة يدويا في مختلف المناطق التشريحية.
      ملاحظة: موضع التلقائي من المناطق ذات الاهتمام قد تسجل بشكل غير صحيح بسبب تورم كبير في الدماغ. يتم الحصول على T2 مرات وقيم أدك من المناطق التشريحية المختارة في هذا الشكل.
4. لتحليل حجم ميكرويموريهاج، تحديد ميكرويمورهاجيس، والتي تظهر كما بويضة، بؤر مظلمة على T2 * مجموعات البيانات ذات الوزن، وذلك باستخدام محرر تجزئة.

النتائج

في C57BL / 6 الفئران، يمكن ملاحظة الأعراض السريرية الأولى من إسم بين أيام 6 و 10 بعد الإصابة ب P. بيرغي أنكا سبوروزويتس. إسم يتطور في 60-80٪ من الفئران المصابة وسرعان ما يتقدم إلى الغيبوبة والموت في غضون 24 إلى 48 ساعة. في المقابل، الفئران التي لا تتطور إسم ...

Discussion

في هذه المقالة، ونحن تصف بروتوكول الدماغ كله التصوير بالرنين المغناطيسي لتحديد التغييرات في الملاريا الدماغية التجريبية. ونحن نعتقد أن التصوير بالرنين المغنطيسي قد تم استغلاله بشكل كاف في أبحاث الملاريا حتى الآن، ونأمل أن بروتوكولاتنا سوف تساعد المحققين الآخرين. ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter	1001747	for anesthesia
Dotarem	Guebert	1086923	Gd-DTPA contrast agent; 0.5 mmol/mL
Amira (Image Processing Program)	FEI Group		Version Amira 5.3.2
MATLAB	The MathWorks, Inc.,		Release 2012b
FDT toolbox	FMRIB's Software Library	http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html