使用磁共振成像实验性脑疟疾模型中的水肿发育​​和微血管病理学的体内追踪

摘要

We describe a mouse model of experimental cerebral malaria and show how inflammatory and microvascular pathology can be tracked in vivo using magnetic resonance imaging.

摘要

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of cerebral malaria can be difficult. We present an experimental mouse model of cerebral malaria that shares multiple features of the human disease, including edema and microvascular pathology. Using magnetic resonance imaging (MRI), we can detect and track the blood-brain barrier disruption, edema development, and subsequent brain swelling. We describe multiple MRI techniques that can visualize these pertinent pathological changes. Thus, we show that MRI represents a valuable tool to visualize and track pathological changes, such as edema, brain swelling, and microvascular pathology, in vivo.

引言

疟疾是一个重大的全球健康问题。 ¹严重疟疾的特征部分是脑受累，往往是不良预后因素。疟疾传播高的地区，五岁以下儿童的脑梗死是常见的，并且是该年龄组疟疾相关死亡的主要原因。 ¹虽然积极的治疗可以挽救生命，但是特别是早期阶段的脑疟疾检测可能很困难。涉及脑疟疾的病理过程包括微血管破裂和脑水肿，可导致严重的脑肿胀。在本文中，我们提出了磁共振成像（MRI）协议，允许全脑脑实验性脑疟疾（ECM） 体内成像。全脑高分辨率成像方法在这种疾病中已经广泛利用不足，尽管对ECM如何在中枢起搏方面知之甚少神经系统或什么具体机制导致疾病。涵盖全脑的体内 MRI代表了一种重要的研究工具，可以更好地了解ECM病理学。 MRI能够评估全球大脑脑肿胀，最近已经被认为是ECM的重要预测因子，也是人脑疟疾的重要预测因素。 ^2，3严重的脑肿胀发生在致命疾病中，代表了ECM模型与人类疾病之间的几种病理特征之一，其特征是炎症和微血管改变。 ⁴

可以通过感染致死的疟原虫疟原虫ANKA在CBA或C57BL小鼠中诱导ECM 。 ECM的发病通常发生在感染后6天和10天之间，并且导致拟合，共济失调，呼吸窘迫和昏迷，这导致说唱id死亡。 ⁴快速鼠类昏迷和行为量表（RMCBS）是评估ECM临床症状的有益成绩。它由10个参数组成，每个评分从0到2，最大可能得分为20. ⁶最近，我们在ECM小鼠中RMCBS评分的严重程度和MRI证实的病理变化之间表现出良好的一致性。 ⁷在本协议中，我们描述了小鼠的ECM诱导和ECM小鼠的体内磁共振成像。

研究方案

本文中报道的所有动物实验均根据实验动物科学协会联合会（FELASA）B类和实验动物科学学会（GV-SOLAS）标准指南进行，并得到当地德国当局在卡尔斯鲁厄（卡尔斯鲁厄大学（RegierungspräsidiumKarlsruhe） ，德国）。请注意，生物安全级别2适用于蚊子和Bermhei疟原虫ANKA子孢子工作。

感染

1. 通过在拜访模式鼠标上喂养15分钟来感染按摩皂甙Stephensi蚊子与Berghei ANKA 疟原虫 。将感染的蚊子保持在80％湿度和21°C。
2. 在血餐后17天至22天，从笼子里收集女性蚊子。将它们放在冰上麻醉它们。
3. 使用镊子，将三至四只蚊子放在载有一滴冷RPMI培养基的玻片上。将幻灯片放在显微镜下。
4. 使用镊子，小心翼翼地伸展头部和身体之间的蚊子。使用注射器和针头分离唾液腺。用剩余的蚊子重复这个步骤。
5. 通过用玻璃移液管吸取玻璃移液管，从玻片上收集唾液腺，并将其收集在1.5 mL离心管中。
   注意:根据感染率，每唾液腺通常可以获得8,000至15,000个感染性子孢子。
6. 约3分钟，用小的塑料棒粉碎离心管内的分离的唾液腺，以将子孢子与唾液腺组织分离。
7. 在1,000×g和4℃下离心3分钟以净化剩余组织中的子孢子。
8. 将含有子孢子（SPZ）的上清液吸移到新的离心管中，并计数Neubauer血细胞计数器中的纯化子孢子。
9. 通过添加ph将浓缩的子孢子浓度调整为10,000 / mL盐酸缓冲盐水。
10. 将总共​​1000个子孢子（0.1mL）注入近交C57BL / 6小鼠的尾静脉中以引发感染。为了方便注射，将C57BL / 6小鼠置于限制器中，并将尾巴放入温热（约37℃）的水中以帮助尾静脉的可视化;
    注意:注射本身是一个简短的过程，可以在几秒钟内完成。
11. 每天一次，在SPZ感染后，从第3天开始，检查血液涂片上的血液寄生虫血症。
    注意:监测寄生虫血症以前在Mueller 等人的JoVE文章中可视化。 ⁸
12. 从子孢子注射后的第5天开始，用Rapid Murine Coma and Behavior Scale（RMCBS）评分每日一次。
    注意:Caroll 等人已经发表了此程序的详细描述，包括视频演示。 ⁶
13. 评估根据RMCBS评分的MRI成像小鼠和研究问题需要解决。 ⁶

磁共振成像设置

1. 使用用于射频传输的音量谐振器和4通道相控阵表面接收器线圈在9.4T小型动物扫描仪上进行MRI。将温度控制的水浴打开至42°C，以保持鼠标的体温。
2. 在室内使用2％异氟烷和压缩空气诱导麻醉，直到鼠标不再对脚趾反应。维持麻醉1-1.5％。
3. 将尾静脉导管放入小鼠的尾静脉。将鼠标放置在MRI上，并将其放置在装有头锁和牙杆的动物床上，以尽量减少头部运动。注意不要拉直老鼠的颈椎。
4. 将造影剂注射系统连接到尾静脉导管。使用填充有Gd-DTPA（0.3 mmol / kg）注射器的定制注射系统，或使用连接到Gd-DTPA（0.3 mmol / kg）注射器的PE管。
5. 将双酚茴香眼膏用于双眼。将4通道相控阵表面接收头线圈放置在鼠标头上。将呼吸垫放在鼠标背面并将其连接到呼吸监测装置上。

成像协议

注意:根据要解决的研究问题，从下面列出的协议中选择成像序列。所有列出的参数对MRI软件有效，但如果使用其他软件程序，则可能需要进行调整。

1. 首先进行本地化扫描，以确保鼠标的大脑位于磁铁的等中心。
2. 为了定性评估血管性水肿，通过​​选择多切片RARE序列，使用3D T2加权成像。
   1. 输入以下pa参考MRI软件:重复时间= 2.000 ms，回波时间= 22 ms，各向同性分辨率= 0.1mm，视场= 20 x 10 x 12 mm ³ ;矩阵= 200×100×120，翻转角= 90〜180°; （自旋回波），稀有因子= 8.启动序列，等待10分48秒获取原始图像。
3. 定量评估血管性水肿，通过​​选择多切片多自旋回波序列来进行T2松弛度测定。
   1. 使用以下参数:重复时间= 3.100 ms，回波时间= 8-136 ms，增量为8 ms，切片数为17，切片厚度= 0.7 mm，平面分辨率= 0.116 mm x 0.116 mm，视场20 x 20 mm ² ，矩阵= 172 x 172，翻转角= 90-180度; （自旋回波）。启动序列，等待8分53秒获取原始图像。
4. 为了定量评估血管性水肿和细胞毒性水肿，进行扩散加权成像/表观扩散系统通过选择自旋回波EPI扩散序列来实现（ADC）映射。
   1. 使用以下参数:重复时间= 3.400ms，回波时间= 20ms，切片厚度= 0.7mm，切片数= 17，扩散敏化方向数= 30，b值= 1.500s / mm ² ，δ= 3ms ，Δ= 9ms，部分傅里叶编码加速因子= 1.51，视场= 12×15mm ² ，矩阵= 96×128，平面内分辨率= 0.125mm×0.117mm，翻转角= 90-180度，以及饱和片数（矢状）= 1.启动序列，等待7分56秒，直到获取原始图像。
5. 评估微血肿，使用3D T2 *加权成像。选择流量补偿FLASH序列。
   1. 在MRI软件中输入以下参数:重复时间= 2.000 ms，回波时间= 22 ms，各向同性分辨率0.08 mm，视场= 32 x 15 x 8 mm ³ ，矩阵大小= 400 x 188 x 100，f唇角= 12度。启动序列，等待15分40秒获取原始图像。
6. 为了评估动脉通畅，通过选择3D FLASH序列来使用飞行时间血管造影。
   1. 在MRI软件中使用以下参数:重复时间= 16 ms，回波时间= 3.5 ms，切片厚度= 0.07 mm，平面内分辨率= 0.104 x 0.104 mm，视场= 20 x 20 x 10 mm ³ ，矩阵= 192×192×142，翻转角= 15度。启动序列并等待7分钟16秒直到获取图像。
7. 为了评估血脑屏障破坏，在造影剂注射0.3 mmol / kg之前和之后使用3D T1加权成像。选择具有全球射频激励的射频损坏FLASH序列。
   1. 在MRI软件中使用以下序列参数:重复时间= 5 ms，回波时间= 1.9 ms，各向同性分辨率= 0.156 mm，视场20 x 18.7×18.7mm ³ ，矩阵128×120×120，翻转角= 8.5°。启动序列并等待1分14秒，直到获取图像。

图像处理与分析

1. 为了分析血脑屏障破坏，使用ImageJ中的算术工具或图像计算器工具从增强型T1加权图像中减去3D非增强T1加权图像。评估减法图像以增加信号，这对应于血脑屏障破坏。 ⁹
2. 要分析大脑体积，请使用本机3D T1-或3D T2加权数据集。使用分割编辑器将大脑从嗅球描绘成小脑。 ¹⁰
3. 血管性水肿
   1. 用MRI软件处理T2松弛度数据或使用非线性最小二乘法拟合程序。 ¹¹使用MRI sof处理扩散加权数据以获得ADC图tware或FDT工具箱（请参阅材料表 ）。
   2. 将感兴趣区域手动放置到不同的解剖区域。
      注意:感兴趣区域的自动放置可能由于显着的大脑肿胀而不正确地注册。以这种方式获得所选解剖区域的T2时间和ADC值。
4. 为了分析微出血体积，使用分割编辑器描绘在T2 *加权数据集上显示为卵形，黑色焦点的微出血。

结果

在C57BL / 6小鼠中，可以观察到ECM的第一临床症状，在用Berghei ANKA子孢子感染后的第 6天和第10天之间。 ECM在60-80％的感染小鼠中发展，并在24至48小时内迅速进入昏迷和死亡。相比之下，不会发展ECM的小鼠在感染后第二周因死于高血糖症严重贫血而死亡。 ¹²

在MRI成像中，ECM的最早的迹象在嗅球中是...

讨论

在本文中，我们描述了一个全脑MRI方案来描绘实验性脑疟疾的变化。我们认为迄今为止，疟疾研究中MRI尚未得到充分利用，希望我们的方案能够帮助其他调查人员。我们想描述一些可能有帮助的附加要点。

如果严重恶心的小鼠成像，定位至关重要。由于颅内压升高，小鼠易死亡，因此颈椎不应伸展。麻醉也应保持在最低限度。如果轻度疾病的小鼠成像，MRI的最佳时间点是在?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter	1001747	for anesthesia
Dotarem	Guebert	1086923	Gd-DTPA contrast agent; 0.5 mmol/mL
Amira (Image Processing Program)	FEI Group		Version Amira 5.3.2
MATLAB	The MathWorks, Inc.,		Release 2012b
FDT toolbox	FMRIB's Software Library	http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html