磁気共鳴映像法を用いた実験的大脳マラリアモデルにおける浮腫発生と微小血管病変のin vivo追跡

要約

We describe a mouse model of experimental cerebral malaria and show how inflammatory and microvascular pathology can be tracked in vivo using magnetic resonance imaging.

要約

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of cerebral malaria can be difficult. We present an experimental mouse model of cerebral malaria that shares multiple features of the human disease, including edema and microvascular pathology. Using magnetic resonance imaging (MRI), we can detect and track the blood-brain barrier disruption, edema development, and subsequent brain swelling. We describe multiple MRI techniques that can visualize these pertinent pathological changes. Thus, we show that MRI represents a valuable tool to visualize and track pathological changes, such as edema, brain swelling, and microvascular pathology, in vivo.

概要

マラリアは世界的に重要な健康問題です。重度のマラリアは部分的に脳の関与を特徴とし、しばしば不良な予後因子である。 5歳未満の小児では、マラリア伝播率の高い地域で脳関与が一般的であり、その年齢層でのマラリア関連死亡の主な原因となります。積極的な治療は命を救うことができますが、脳マラリアの検出は、特に初期段階では困難です。脳マラリアに関連する病理学的プロセスには、脳血管障害および脳浮腫が含まれ、重度の脳の腫脹を招く可能性がある。この記事では、実験的脳マラリア（ECM）の全脳インビボイメージングを可能にする磁気共鳴イメージング（MRI）プロトコルを紹介します。 ECMが中央でどのように開始するかについてはほとんど知られていないが、全脳高分解能イメージング法はこの疾患では十分に活用されていないあるいは特定の機序が原因となってこの疾患に至ることがあります。脳全体をカバーするインビボ MRIは、ECM病理のより良い理解を得るための重要な研究ツールである。 MRIは、最近、ECMだけでなくヒト大脳マラリアにおいても死の重要な予測因子であると最近認識されている世界的な脳の脳の腫脹を評価することができる。重度の脳の腫脹は、致命的な疾患で起こり、ECMモデルとヒトの疾患（炎症性および微小血管の両方の変化が特徴である疾患）との間のいくつかの病理学的特徴の1つを表す。 ⁴

ECMは、致死的Plasmodium berghei ANKA感染によるCBAまたはC57BLマウスで誘導することができる。 ECMの発症は、感染後6日目から10日目までに典型的に起こり、フィッティング、運動失調、呼吸困難、昏睡をもたらし、これがラップにつながるイドの死。ラピッドネズミ昏睡および行動尺度（RMCBS）は、ECMの臨床症状を評価するのに役立つスコアです。これは、0から2のスコアを付けられた10のパラメータで構成され、最大20の可能なスコアを有する^。6最近、我々はECMマウスにおけるRMCBSスコアの重症度とMRIによって示される病理学的変化との間に良好な一致を示した。 ⁷このプロトコールでは、マウスにおけるECM誘導およびECMによるマウスのインビボ磁気共鳴イメージングについて記載する。

プロトコル

この記事で報告されたすべての動物実験は、実験動物科学連盟（FELASA）カテゴリBおよび実験動物科学協会（GV-SOLAS）標準ガイドラインに従って実施され、カールスルーエの地方ドイツ当局（RegierungspräsidiumKarlsruhe） 、ドイツ）。 biosavetyレベル2は、蚊とPlasmodium berghei ANKAスポロゾイトの仕事に適用されます。

1.感染

1. Anophelesは、配偶子母細胞で15分間飼育することにより、 Plasmodium berghei ANKAを用いて蚊を繁殖させる。感染した蚊を湿度80％、21℃に保つ。
2. 血液摂取の17〜22日後にケージから女性の蚊を収集する。それらを氷上に置き、麻酔する。
3. 鉗子を使用して、一滴の冷RPMI培地で覆われたガラススライド上に3-4匹の蚊を置く。スライドを顕微鏡の下に置きます。
<鉗子を使用して、慎重に頭と体の間に蚊を伸ばします。シリンジと針を用いて唾液腺を分離する。残りの蚊でこの手順を繰り返します。
4. ガラススライドから唾液腺を採取し、それらをガラスピペットで吸い取り、1.5mLの遠心チューブに集める。
   注：感染率に応じて、唾液腺あたり通常8,000〜15,000の感染性スポロゾイトを得ることができます。
5. 約3分間、唾液腺組織からスポロゾイトを単離するために、小さなプラスチックスティックで遠心チューブ内の分離した唾液腺を粉砕します。
6. 残りの組織からスポロゾイトを精製するために、1,000×gおよび4℃で3分間遠心分離する。
7. スポロゾイト（SPZ）を含む上清を新しい遠心管にピペットで移し、精製したスポロゾイトをNeubauer血球計で数えます。
8. phを加えて精製スポロゾイトの濃度を10,000 / mLに調整するオスフェート緩衝生理食塩水。
9. 近交系のC57BL / 6マウスの尾静脈に合計1,000個のスポロゾイト（0.1 mL）を注入して感染を開始させます。注射を容易にするために、C57BL / 6マウスを拘束具に置き、尾を静脈（約37℃）の水に入れて尾静脈の視覚化を助ける。
   注記：注入自体は、数秒以内に実行できる短い手順です。
10. 1日1回、SPZ感染後3日目以降の血液塗抹標本において、血液段階の寄生虫血症をチェックする。
    注：Parasitemiaのモニタリングは、Mueller らの JoVEの記事で以前に可視化されています。 ⁸
11. スポロゾイト注射後5日目から急速マウス昏睡および行動尺度（RMCBS）スコアでマウスを1日1回評価する。
    注：ビデオデモンストレーションを含むこの手順の詳細な説明は、Caroll et al。 ⁶
12. 評価RMCBSスコアおよび対処すべき研究課題に従って、MRI画像を有するマウス。 ⁶

2.磁気共鳴イメージングセットアップ

1. 高周波伝送用のボリューム共振器と4チャネルフェーズドアレイの表面受信コイルを使用して、9.4T小型動物スキャナーでMRIを実行します。マウスの体温を維持するために、温度制御された水浴を42℃にする。
2. 2％イソフルランおよび圧縮空気を用いて、マウスがつま先にもはや反応しなくなるまで、チャンバー内の麻酔を誘導する。麻酔を1-1.5％に維持する。
3. マウスの尾静脈に尾静脈カテーテルを置く。頭の動きを最小限に抑えるために、ヘッドロックと歯のバーが装備された動物のベッドに傷つきやすいように置き、MRIのためにマウスを配置します。マウスの頸椎をまっすぐにしないように注意してください。
4. 造影剤注入システムを尾静脈カテーテルに接続する。 Gd-DTPA（0.3 mmol / kg）シリンジを充填したカスタムメードの注入システムを使用するか、Gd-DTPA（0.3 mmol / kg）シリンジに接続したPEチューブを使用してください。
5. デクスパンテノール眼軟膏を両眼に塗布する。 4チャンネルフェーズドアレイサーフェスレシーバヘッドコイルをマウスの頭に置きます。マウスの後ろに呼吸パッドを置き、呼吸監視装置に接続します。

3.イメージングプロトコル

注：対処すべき研究課題に従って、以下に列挙したプロトコールからイメージング配列を選択する。記載されているすべてのパラメータはMRIソフトウェアで有効ですが、他のソフトウェアプログラムが使用されている場合は調整する必要があります。

1. マウスの脳がマグネットのアイソセンタにあることを確認するために、ローカライズスキャンを開始します。
2. 血管原性浮腫を定性的に評価するには、マルチスライスレアシーケンスを選択して3D T2強調画像を使用します。
   1. 次のPAを入力してください繰返し時間= 2.000ms、エコー時間= 22ms、等方性分解能= 0.1mm、視野= 20×10×12mm ³ 。マトリックス= 200×100×120、フリップ角= 90~180°、 （スピンエコー）、および希少因子= 8.シーケンスを開始し、10分48秒待って生の画像を取得する。
3. 血管形成性浮腫を定量的に評価するために、マルチスライス、多重スピンエコーシーケンスを選択することによってT2緩和測定を実施する。
   1. 繰返し時間= 3.100ms、エコー時間= 8-136ms、8msの増分、スライス数= 17、スライス厚さ= 0.7mm、面解像度= 0.116mm×0.116mm、視野20 x20mm2、マトリックス= 172x172、フリップ角= 90-180°、 （スピンエコー）。シーケンスを開始し、8分53秒待って生の画像を取得する。
4. 血管原性浮腫および細胞傷害性浮腫の両方を定量的に評価するために、拡散強調画像/見掛け拡散係数スピンエコーEPI拡散シーケンスを選択することによって、効率的（ADC）マッピングを可能にする。
   1. 反復時間= 3.400ms、エコー時間= 20ms、スライス厚= 0.7mm、スライス数= 17、拡散増感方向の数= 30、b値= 1.500s / mm ² 、δ= 3msのパラメータを使用する。 、Δ= 9ms、部分フーリエ符号化加速係数= 1.51、視野= 12×15mm ² 、マトリックス= 96×128、面内分解能= 0.125mm×0.117mm、フリップ角= 90-180度、および彩度スライス（矢状）の数= 1。シーケンスを開始し、生画像が取得されるまで7分56秒待つ。
5. 微小出血を評価するには、3D T2 *加重イメージングを使用する。フロー補正FLASHシーケンスを選択します。
   1. 繰り返し時間= 2.000 ms、エコー時間= 22 ms、等方性解像度0.08 mm、視野= 32 x 15 x 8 mm ³ 、マトリックスサイズ= 400 x 188 x 100、およびfリップアングル= 12度。シーケンスを開始し、生の画像を取得するために15分40秒待つ。
6. 動脈の開存性を評価するには、3D FLASHシーケンスを選択して、飛行時間血管造影を使用します。
   1. 繰返し時間= 16ms、エコー時間= 3.5ms、スライス厚さ= 0.07mm、面内分解能= 0.104×0.104mm、視野= 20×20×10mm ³ 、MRIソフトウェアの以下のパラメータを使用する。 = 192×192×142、フリップ角= 15度である。シーケンスを開始し、画像が取得されるまで7分16秒待ちます。
7. 血液脳関門の崩壊を評価するには、0.3 mmol / kgの造影剤注入の前後に3D T1強調画像を使用する。グローバルラジオ周波数の励起を使用して、ラジオ周波数で損なわれたFLASHシーケンスを選択します。
   1. MRIソフトウェアでは、繰り返し時間= 5ms、エコー時間= 1.9ms、等方性分解能= 0.156mm、視野20×18.7×18.7mm ³ 、マトリックス128×120×120、フリップ角= 8.5°。シーケンスを開始し、画像が取得されるまで1分14秒待ちます。

4.画像処理と解析

1. 血液脳関門の障害を解析するには、ImageJの算術ツールまたは画像計算ツールを使用して、強化されたT1強調画像から3D非拡張T1強調画像を差し引きます。減数画像を評価し、血液脳関門の障害に対応する信号の増加を確認する。 ⁹
2. 脳の容積を分析するには、ネイティブ3D T1または3D T2加重データセットを使用します。セグメンテーションエディタを使用して、脳を嗅球から小脳まで描写する。 ¹⁰
3. 血管形成性浮腫
   1. MRIソフトウェアでT2緩和測定データを処理するか、非線形最小二乗適合手順を使用します。 ¹¹ MRI sofを用いたADCマップを得るための拡散強調データの処理twareまたはFDTツールボックス（ 材料表を参照）。
   2. 関心領域を異なる解剖学的領域に手動で配置します。
      注記：重要な脳の腫脹により、関心領域の自動配置が正しく登録されないことがあります。選択された解剖学的領域のT2時間およびADC値がこのようにして得られる。
4. 微小出血量を分析するには、セグメンテーションエディタを使用して、T2 *加重データセット上に卵形の暗い焦点として現れる微小出血を描写する。

結果

C57BL / 6マウスでは、 P. berghei ANKAスポロゾイトによる感染後6日目〜10日目の間にECMの最初の臨床症状が観察される。 ECMは感染マウスの60〜80％で発症し、24〜48時間以内に急速に昏睡と死に進行する。対照的に、ECMを発症しないマウスは、過気管支喘息により重度の貧血から感染後第2週後に死亡する。 ¹²

ディスカッション

この記事では、実験的脳マラリアの変化を描写する全脳MRIプロトコルについて説明します。我々は、今日までマラリア研究においてMRIが十分に活用されておらず、我々のプロトコールが他の研究者を助けることを期待している。私たちは役に立つかもしれないいくつかの追加ポイントについて説明したいと思います。

重度の病気のマウスが画像化される場合、位置決め?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter	1001747	for anesthesia
Dotarem	Guebert	1086923	Gd-DTPA contrast agent; 0.5 mmol/mL
Amira (Image Processing Program)	FEI Group		Version Amira 5.3.2
MATLAB	The MathWorks, Inc.,		Release 2012b
FDT toolbox	FMRIB's Software Library	http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html