In Vivo Отслеживание развития отек и микрососудистая патология в модели экспериментальной церебральной малярии с использованием магнитно-резонансной томографии

Резюме

We describe a mouse model of experimental cerebral malaria and show how inflammatory and microvascular pathology can be tracked in vivo using magnetic resonance imaging.

Аннотация

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of cerebral malaria can be difficult. We present an experimental mouse model of cerebral malaria that shares multiple features of the human disease, including edema and microvascular pathology. Using magnetic resonance imaging (MRI), we can detect and track the blood-brain barrier disruption, edema development, and subsequent brain swelling. We describe multiple MRI techniques that can visualize these pertinent pathological changes. Thus, we show that MRI represents a valuable tool to visualize and track pathological changes, such as edema, brain swelling, and microvascular pathology, in vivo.

Введение

Малярия является серьезной проблемой глобального здравоохранения. ¹ Тяжелая малярия характеризуется, в частности, вовлечением головного мозга и часто является плохим прогностическим фактором. Участие в мозге распространено у детей в возрасте до пяти лет в районах с высокой передачей малярии и является основной причиной смерти от малярии в этой возрастной группе. ¹ Хотя агрессивное лечение может быть жизненно важным, выявление церебральной малярии, особенно на ранних стадиях, может быть затруднено. Патологические процессы, связанные с церебральной малярией, включают микрососудистые нарушения и отек мозга, что может привести к серьезному отеку мозга. В этой статье мы представляем протокол магнитно-резонансной томографии (МРТ), который позволяет полностью мозговой визуализации in vivo экспериментальной церебральной малярии (ECM). В этом заболевании широко использовались методы визуализации с высоким разрешением с высоким разрешением, хотя мало что известно о том, как ECM инициирует в центральнойНервной системы или какие конкретные механизмы приводят к заболеванию. МРТ in vivo , охватывающая весь мозг, представляет собой важный исследовательский инструмент для лучшего понимания патологии ECM. МРТ способна оценить глобальную головную мозговую опухоль, которая в последнее время признана важным предсказателем смерти не только в ECM, но также и при церебральной малярии. ^{2 , 3} Тяжелая опухоль головного мозга возникает при смертельных заболеваниях и представляет собой одну из нескольких патологических особенностей между моделями ECM и болезнями человека, заболеванием, которое характеризуется как воспалительными, так и микрососудистыми изменениями. ⁴

ECM может индуцироваться у мышей CBA или C57BL путем заражения летальным плазмодием berghei ANKA. ⁵ Начало ECM обычно происходит между 6 и 10 днями после инфицирования и приводит к фитингу, атаксии, респираторному дистрессу и коме, что приводит к рэпуId смерть. ⁴ Быстрая шкала комы и поведения (RMCBS) - это полезный показатель для оценки клинических симптомов ECM. Он состоит из 10 параметров, каждый из которых оценивается от 0 до 2, с максимально возможной оценкой 20. ⁶ Недавно мы показали хорошее согласие между степенью оценки RMCBS у мышей ECM и патологическими изменениями, продемонстрированными с помощью МРТ. ⁷ В этом протоколе мы описываем индукцию ECM у мышей и визуализацию in vivo магнитно-резонансной томографии мышей с ECM.

протокол

Все эксперименты на животных, описанные в этой статье, проводились в соответствии с стандартными рекомендациями Федерации лабораторных ассоциаций животных (FELASA) категории B и стандартами общеорганизационного лабораторного животноводства (GV-SOLAS) и были одобрены местными властями Германии в Карлсруэ (Regierungspräsidium Karlsruhe , Германия). Обратите внимание, что уровень биозависимости 2 относится к работе москита и Plasmodium berghei ANKA sporozoite.

1. Инфекция

1. Инфекция мошек Anopheles stephensi с помощью Plasmodium berghei ANKA путем кормления их в течение 15 мин на гаметоцитемической мыши. Держите инфицированных комаров при влажности 80% и 21 ° C.
2. Соберите самцов комаров из их клетки через 17-22 дня после еды. Поместите их на лед, чтобы обезболивать их.
3. Используя щипцы, разместите от трех до четырех москитов на стеклянном слайде, покрытом каплей холодной среды RPMI. Поместите слайд под микроскоп.
4. Используя щипцы, аккуратно растяните комара между головой и телом. Выделите слюнную железу с помощью шприца и иглы. Повторите эту процедуру с оставшимися комарами.
5. Соберите слюнные железы со стекла, сосав их стеклянной пипеткой и соберите их в 1,5 мл центрифужной пробирке.
   ПРИМЕЧАНИЕ. В зависимости от уровня инфицирования, обычно от 8 000 до 15 000 инфекционных спорозоитов могут быть получены в слюнной железе.
6. В течение приблизительно 3 минут разбейте изолированные слюнные железы в пробирке центрифуги маленькой пластиковой палкой для выделения спорозоитов из ткани слюнной железы.
7. Центрифуга в течение 3 мин при 1000 мкг и 4 ° С для очистки спорозоитов от оставшейся ткани.
8. Внесите супернатант, который содержит спорозоиты (SPZ), в новую пробирку для центрифуги и подсчитайте очищенные спорозоиты в гемоцитометре Нойбауэра.
9. Отрегулируйте концентрацию очищенных спорозоитов до 10 000 / мл, добавив phЗамасленный залив.
10. Вводят в общей сложности 1000 спорозоитов (0,1 мл) в хвостовые вены инбредных мышей C57BL / 6 для инициирования инфекции. Чтобы облегчить инъекции, поместите мышей C57BL / 6 в ограничитель и поместите хвосты в теплую (приблизительно 37 ° C) воду, чтобы помочь визуализации хвостовых вен;
    ПРИМЕЧАНИЕ. Сама инъекция - это короткая процедура, которая может быть выполнена в течение нескольких секунд.
11. Один раз в день проверяйте паразитемию крови на мазках крови с 3-го дня после заражения SPZ.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Мониторинг паразитемии был ранее визуализирован в статье JoVE Mueller et al. ⁸
12. Оцените мышей один раз в день с помощью шкалы быстрого кома и шкалы поведения (RMCBS), начиная с 5-го дня после инъекции спорозоита.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Подробное описание этой процедуры, включая демонстрацию видео, было опубликовано Caroll et al. ⁶
13. оценитьМышей с визуализацией МРТ в соответствии с оценкой RMCBS и вопросом исследования, подлежащим рассмотрению. ⁶

2. Настройка магнитно-резонансной томографии

1. Выполните МРТ на маленьком сканирующем сканере 9,4 т с использованием объемного резонатора для радиочастотной передачи и катушки приемника поверхности с 4-канальной фазированной решеткой. Включите водяную баню с контролируемой температурой до 42 ° C, чтобы поддерживать температуру тела мыши.
2. Вызывают анестезию в камере с использованием 2% изофлурана и сжатого воздуха, пока мышь больше не реагирует на пинч пальца. Поддерживайте анестезию на уровне 1-1,5%.
3. Поместите катетер хвостовой вены в хвостовую вену мыши. Расположите мышь для МРТ, поставив ее склонным и с хрустом спиной на животной кровати, оборудованной головной дверью и зубчатым стержнем, чтобы свести к минимуму движение головы. Старайтесь не выпрямлять шейный позвоночник мыши.
4. Подключите систему инъекции контрастного вещества к катетеру хвостовой вены, Используйте специальную инъекционную систему, заполненную шприцем Gd-DTPA (0,3 ммоль / кг), или используйте полиэтиленовые трубки, подключенные к шприцу Gd-DTPA (0,3 ммоль / кг).
5. Нанести глазную мазь декспантенолом на оба глаза. Поместите обмотку головки приемника с 4-канальной фазированной решеткой на головку мыши. Поместите дыхательную подушку на тыльную сторону мыши и подключите ее к устройству мониторинга дыхания.

3. Протокол обработки изображений

ПРИМЕЧАНИЕ. Выберите последовательности изображений из приведенного ниже протокола в соответствии с вопросами исследования, которые необходимо решить. Все перечисленные параметры действительны для программного обеспечения MRI, но могут потребоваться корректировка при использовании других программ.

1. Начните с выполнения локализующего сканирования, чтобы убедиться, что мозг мыши находится в изоцентре магнита.
2. Чтобы качественно оценить вазогенный отек, используйте 3D-взвешенное изображение с Т2, выбирая многосекундную RARE-последовательность.
   1. Введите следующий paПомехами в программное обеспечение MRI: время повторения = 2000 мс, время эха = 22 мс, изотропное разрешение = 0,1 мм, поле зрения = 20 x 10 x 12 мм ³ ; Матрица = 200 x 100 x 120, угол поворота = 90-180 °; (Спин-эхо) и редкий фактор = 8. Запустите последовательность и подождите 10 мин 48 с, чтобы получить необработанные изображения.
3. Чтобы количественно оценить вазогенный отек, произведите релаксометрию Т2, выбирая многослойную множественную спин-эхо-последовательность.
   1. Используйте следующие параметры: время повторения = 3,100 мс, время эха = 8-136 мс с шагом 8 мс, количество срезов = 17, толщина среза = 0,7 мм, разрешение по плоскости = 0,116 мм x 0,116 мм, поле зрения 20 X 20 мм ² , матрица = 172 x 172, угол поворота = 90-180 градусов; (Спин-эхо). Запустите последовательность и подождите 8 мин 53 с, чтобы получить необработанные изображения.
4. Чтобы количественно оценить как вазогенный отек, так и цитотоксический отек, выполните диффузионно-взвешенную визуализацию / коэффициент кажущейся диффузии(АЦП) путем выбора диффузионной последовательности ЭПИ спин-эха.
   1. Используйте следующие параметры: время повторения = 3.400 мс, эхо-время = 20 мс, толщина среза = 0,7 мм, количество срезов = 17, количество сенсибилизированных направлений диффузии = 30, значение b = 1,500 с / мм ² , δ = 3 мс , Δ = 9 мс, частичный коэффициент ускорения Фурье = 1,51, поле зрения = 12 x 15 мм ² , матрица = 96 x 128, разрешение в плоскости = 0,125 мм x 0,117 мм, угол поворота = 90-180 градусов и Количество насыщенных срезов (сагиттал) = 1. Запустите последовательность и подождите 7 минут 56 с, пока не будут получены необработанные изображения.
5. Чтобы оценить микрогеморрагии, используйте 3D T2 * -среднюю визуализацию. Выберите FLASH-последовательность с компенсацией потока.
   1. Введите следующие параметры в программное обеспечение MRI: время повторения = 2000 мс, время эха = 22 мс, изотропное разрешение 0,08 мм, поле зрения = 32 x 15 x 8 мм ³ , размер матрицы = 400 x 188 x 100 и fУгол губ = 12 градусов. Запустите последовательность и подождите 15 мин 40 с, чтобы получить необработанные изображения.
6. Чтобы оценить артериальную проходимость, используйте время ангиографии полета, выбрав трехмерную последовательность FLASH.
   1. Используйте следующие параметры в программном обеспечении MRI: время повторения = 16 мс, время эха = 3,5 мс, толщина среза = 0,07 мм, разрешение в плоскости = 0,104 x 0,104 мм, поле зрения = 20 x 20 x 10 мм ³ , матрица = 192 x 192 x 142, угол поворота = 15 градусов. Запустите последовательность и подождите 7 минут 16 с, пока изображения не будут получены.
7. Чтобы оценить нарушение гематоэнцефалического барьера, используйте 3D T1-взвешенную визуализацию до и после инъекции контрастного агента 0,3 ммоль / кг. Выберите радиочастотную вспышку FLASH с глобальным радиочастотным возбуждением.
   1. Используйте следующие параметры последовательности в программном обеспечении MRI: время повторения = 5 мс, время эха = 1,9 мс, изотропное разрешение = 0,156 мм, поле зрения 20 х 18,7X 18,7 мм ³ , матрица 128 x 120 x 120 и угол поворота = 8.5 ° ;. Начните последовательность и подождите 1 мин 14 секунд, пока изображения не будут получены.

4. Обработка и анализ изображений

1. Чтобы проанализировать нарушение гематоэнцефалического барьера, вычитайте трехмерные не расширенные изображения, взвешенные по T1, из расширенных изображений с T1-взвешиванием с помощью арифметического инструмента или инструмента калькулятора изображения в ImageJ. Оцените вычитание изображений для увеличения сигнала, что соответствует разрушению гематоэнцефалического барьера. ⁹
2. Чтобы проанализировать объем мозга, используйте собственные 3D-массивы T1 или 3D T2. Выделите мозг из обонятельной луковицы в мозжечок, используя редактор сегментации. ¹⁰
3. Вазогенный отек
   1. Обработайте данные релаксометрии T2 с помощью программного обеспечения MRI или используйте нелинейную процедуру подбора наименьших квадратов. ¹¹ Данные с диффузионно-взвешенной технологией для получения карт АЦП с использованием МРТTware или FDT (см. Таблицу материалов ).
   2. Поместите области интереса вручную в разные анатомические области.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Автоматическое размещение областей, представляющих интерес, может регистрироваться неправильно из-за значительного отека мозга. Таким образом получают значения Т2 и АЦП выбранных анатомических областей.
4. Чтобы проанализировать объем микрогеморрагии, выделите микрогеморрагии, которые выглядят как яйцевидные, темные фокусы на T2 * -уровневых наборах данных, используя редактор сегментации.

Результаты

У мышей C57BL / 6 первые клинические симптомы ECM наблюдаются между 6 и 10 днями после заражения спорозоитами P. berghei ANKA . ECM развивается у 60 - 80% инфицированных мышей и быстро прогрессирует до комы и смерти в течение 24-48 часов. Напротив, мыши, которые не развивают ECM, уми?...

Обсуждение

В этой статье мы описываем МРТ-протокол всего мозга для определения изменений в экспериментальной церебральной малярии. Мы считаем, что МРТ до сих пор недостаточно используется в исследованиях малярии и надеемся, что наши протоколы помогут другим исследователям. Мы хотели бы описать ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter	1001747	for anesthesia
Dotarem	Guebert	1086923	Gd-DTPA contrast agent; 0.5 mmol/mL
Amira (Image Processing Program)	FEI Group		Version Amira 5.3.2
MATLAB	The MathWorks, Inc.,		Release 2012b
FDT toolbox	FMRIB's Software Library	http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html