בשנת מעקב Vivo של בצקת פיתוח ופתולוגיה מיקרוסקולרית במודל של מלריה מוחית ניסיוני באמצעות תהודה מגנטית הדמיה

Summary

We describe a mouse model of experimental cerebral malaria and show how inflammatory and microvascular pathology can be tracked in vivo using magnetic resonance imaging.

Abstract

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of cerebral malaria can be difficult. We present an experimental mouse model of cerebral malaria that shares multiple features of the human disease, including edema and microvascular pathology. Using magnetic resonance imaging (MRI), we can detect and track the blood-brain barrier disruption, edema development, and subsequent brain swelling. We describe multiple MRI techniques that can visualize these pertinent pathological changes. Thus, we show that MRI represents a valuable tool to visualize and track pathological changes, such as edema, brain swelling, and microvascular pathology, in vivo.

Introduction

מלריה היא בעיה בריאותית עולמית משמעותית. ¹ מלריה חדה מאופיינת בחלקה במעורבות מוחית, ולעתים קרובות היא גורם פרוגנוסטי גרוע. מעורבות מוחית שכיחה אצל ילדים מתחת לגיל 5 באזורים של העברת מלריה גבוהה ומייצגת את הגורם העיקרי למוות הקשור למלריה בקבוצת גיל זו. ¹ בעוד טיפול אגרסיבי יכול להיות הצלת חיים, איתור מלריה מוחית, במיוחד בשלבים הראשונים, יכול להיות קשה. התהליכים הפתולוגיים המעורבים במלריה מוחית כוללים הפרעות בכלי הדם ובצקת מוחית, אשר עלולים לגרום לנפיחות מוחית חמורה. במאמר זה, אנו מציגים הדמיה תהודה מגנטית (MRI) פרוטוקול המאפשר המוח כולו הדמיה vivo של מלריה מוחי ניסיוני (ECM). שיטות מוח מלאות ברזולוציה גבוהה מוחלשות במידה ניכרת במחלה זו, אף כי מעט ידוע על האופן שבו ECM יוזם במרכזמערכת העצבים או אילו מנגנונים ספציפיים מובילים למחלה. ב MRI vivo , מכסה את המוח כולו, מייצג כלי מחקר חשוב כדי להשיג הבנה טובה יותר של הפתולוגיה של ECM. MRI הוא מסוגל להעריך נפיחות מוחי מוחי עולמי, אשר הוכרה לאחרונה להיות מנבא חשוב למוות לא רק ב- ECM, אלא גם מלריה מוחית אנושית. ^{2 , 3} נפיחות מוחית חמורה מתרחשת במחלה קטלנית ומייצגת אחת ממספר תכונות פתולוגיות בין המודלים של ECM לבין מחלת האדם, מחלה המאופיינת בשינויים דלקתיים ומיקרוסקולריים כאחד. ⁴

ECM יכול להיות המושרה CBA או עכברים C57BL דרך זיהום עם פלסמודיום ברגי ANKA. ⁵ הופעת ה- ECM מתרחשת בדרך כלל בין ימים 6 ו -10 לאחר ההדבקה ומביאה למצבים הולמים, אטקסיה, נשימה ותרדמת, אשר מובילים לראפמוות מוות. ⁴ The Rapid Murine Coma וסולם התנהגות (RMCBS) הוא ציון מועיל להערכת תסמינים קליניים של ECM. זה מורכב מ 10 פרמטרים, כל אחד הבקיע מ 0 ל 2, עם ציון מקסימלי האפשרי של 20. ⁶ לאחרונה, הראינו הסכמה טובה בין חומרת ציוני RMCBS בעכברים ECM ושינויים פתולוגיים שהפגינו MRI. ⁷ בפרוטוקול זה, אנו מתארים אינדוקציה ECM בעכברים ב vivo הדמיה תהודה מגנטית של עכברים עם ECM.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים שדווחו במאמר זה נערכו על פי האגודה הפדרלית למעבדות מדענים בבעלי חיים (FELASA) בקטגוריה B ו- GV-SOLAS, אשר אושרו על ידי הרשויות הגרמניות המקומיות בקרלסרוהה (Regierungspräsidium Karlsruhe) , גרמניה). לידיעתך, רמת הביו-שווה 2 חלה על יתושים ועל פלסמודיום ברגי ANKA sporozoite.

1. זיהום

1. להדביק יתושים sthensians anopheles עם Plasmodium berghei ANKA ידי האכלה אותם במשך 15 דקות על עכבר gametocytemic. שמור על יתושים נגועים על לחות 80% ו 21 ° C.
2. איסוף יתושים נקבה מן הכלוב שלהם 17-22 ימים לאחר ארוחה דם. מניחים אותם על קרח להרדים אותם.
3. בעזרת מלקחיים, במקום שלושה עד ארבעה יתושים על שקופית זכוכית מכוסה עם ירידה של בינוני RPMI קר. מניחים את השקופית תחת מיקרוסקופ.
4. באמצעות מלקחיים, בזהירות למתוח את היתוש בין הראש והגוף. לבודד את בלוטת הרוק באמצעות מזרק ומחט. חזור על הליך זה עם יתושים הנותרים.
5. לאסוף את בלוטות הרוק מן השקופית זכוכית על ידי מציצת אותם עם פיפטה זכוכית לאסוף אותם צינור צנטריפוגות 1.5 מ"ל.
   הערה: בהתאם לשיעורי הזיהום, בדרך כלל 8,000 עד 15,000 sporozoites זיהומיות ניתן להשיג לכל בלוטת הרוק.
6. במשך כ 3 דקות, לרסק את בלוטות הרוק מבודדים בתוך צינור צנטריפוגות עם קטן, מקל פלסטיק לבודד את sporozoites מ רקמת בלוטת הרוק.
7. צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 1000 xg ו 4 ° C לטהר את sporozoites מן הרקמה שנותרה.
8. פיפטה supernatant, אשר מכיל את sporozoites (SPZ), כדי צינור צנטריפוגה חדשה לספור את sporozoites מטוהרים hemocyer hemocytometer.
9. התאם את הריכוז של sporozoites מטוהרים ל 10,000 / מ"ל ​​על ידי הוספת phאוספטים שנאגרו מלוחים.
10. להזריק סך של 1,000 sporozoites (0.1 מ"ל) לתוך הוורידים הזנב של inbred C57BL / 6 עכברים ליזום זיהום. כדי להקל על זריקות, במקום C57BL / 6 עכברים מסננת ולשים את הזנבות לתוך חם (כ 37 מעלות צלזיוס) מים כדי לסייע עם ויזואליזציה של הוורידים הזנב;
    הערה: הזריקה עצמה היא הליך קצר שניתן לבצע תוך מספר שניות.
11. פעם ביום, לבדוק את השלב parasitemia דם על כתמי דם מיום 3 ואילך לאחר ההדבקה SPZ.
    הערה: פרזיטמיה ניטור כבר דמיינו בעבר במאמר JoVE על ידי Mueller et al. ⁸
12. להעריך את העכברים פעם ביום עם ניקוד Rapid Murine ו התנהגות סולם (RMCBS) ציון, החל מיום 5 לאחר הזרקת sporozoite.
    הערה: תיאור מפורט של הליך זה, כולל הפגנת וידאו, פורסם על ידי Caroll et al. ⁶
13. לְהַעֲרִיךאת העכברים עם הדמיה MRI על פי ניקוד RMCBS ואת שאלת המחקר שיש לטפל. ⁶

2. הגדרת תהודה מגנטית

1. בצע MRI על סורק בעל חיים קטן 9.4T באמצעות מהוד נפח עבור שידור רדיו תדר ו 4-channel-Phase-מערך מקלט סליל פני השטח. הפעל את אמבט טמפרטורה מבוקרת מים ל 42 מעלות צלזיוס על מנת לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר.
2. להשרות הרדמה בחדר באמצעות 2% isoflurane ו אוויר דחוס עד העכבר כבר לא מגיב על קמצוץ אצבע. לשמור על הרדמה ב 1-1.5%.
3. מניחים זחל וריד הזנב לתוך הווריד הזנב של העכבר. מקמו את העכבר עבור MRI על ידי הנחת אותו נוטה עם crunch בחזרה על מיטת בעלי חיים מצויד headlock ובר השן כדי למזער את תנועת הראש. הקפד לא ליישר את עמוד השדרה הצוואר של העכבר.
4. חיבור מערכת הזרקת הזרקת סוכן כדי catheter וריד הזנב. השתמש בהזרקת מערכת בהזמנה אישית מלא מזרק GD-DTPA (0.3 mmol / kg) מזרק או להשתמש בצינור PE מחובר מזרק GD-DTPA (0.3 מ"מ / ק"ג) מזרק.
5. החל משחת עיניים dexpanthenol לשני העיניים. מניחים את 4-channel-phase- מערך מערך ראש מקלט סליל ראש על הראש של העכבר. מניחים את לוח הנשימה על גב העכבר ומחברים אותו למכשיר לניטור הנשמה.

3. פרוטוקול הדמיה

הערה: בחר רצפים הדמיה מהפרוטוקול המפורט להלן על פי שאלות המחקר שיש לטפל. כל הפרמטרים הרשומים תקפים עבור תוכנת ה- MRI, אך ייתכן שיהיה צורך להתאים אותם אם נעשה שימוש בתוכנות אחרות.

1. התחל על ידי ביצוע סריקה לוקליזציה כדי לוודא כי המוח העכבר נמצא isocenter של המגנט.
2. כדי להעריך באופן איכותי את בצקת vasogenic, להשתמש 3D D2 משוקלל הדמיה על ידי בחירת רצף רב רצף נדיר.
   1. הזן את הבאRameters לתוך תוכנת MRI: זמן חזרה = 2.000 ms, הד זמן = 22 ms, רזולוציה איזוטרופית = 0.1mm, שדה תצוגה = 20 x 10 x 12 מ"מ ³ ; מטריצה ​​= 200 x 100 x 120, זווית הפוך = 90-180 °; (ספין הד), ו גורם נדיר = 8. הפעל את רצף ולחכות 10 דקות 48 שניות כדי לרכוש את התמונות גלם.
3. כדי להעריך כמותית בצקת vasogenic לבצע T2 relaxometry על ידי בחירה רב פרוסה, מספר רב הד ספין רצף.
   1. השתמש בפרמטרים הבאים: זמן החזרה = 3.100 ms, זמן הד = 8-136 מילישניות במרווחים של 8 אלפיות השנייה, מספר הפרוסות = 17, עובי הפרוסה = 0.7 מ"מ, ברזולוציה של המטוס = 0.116 מ"מ 0.116 מ"מ, שדה הראייה 20 X 20 מ"מ ² , מטריצה ​​= 172 x 172, זווית הפוך = 90-180 מעלות; (ספין הד). התחל את רצף לחכות 8 דקות 53 שניות כדי לרכוש את התמונות גלם.
4. כדי להעריך כמותית הן בצקת ווזוגנית בצקת ציטוטוקסית, לבצע דיפוזיה משוקלל הדמיה / דיפוזיה לכאורה coeFficient (ADC) מיפוי על ידי בחירת ספין הד epi דיפוזיה רצף.
   1. השתמש בפרמטרים הבאים: זמן החזרה = 3.400 ms, זמן הד = 20 מילישניות, עובי פרוסה = 0.7 מ"מ, מספר פרוסות = 17, מספר כיווני רגישות דיפוזיה = 30, ערך b = 1.500 s / mm ² , δ = 3 ms , Δ = 9 ms, גורם האצת קידוד חלקי של Fourier = 1.51, שדה הראייה = 12 x 15 מ"מ ² , מטריצה ​​= 96 x 128, רזולוציה בתוך המטוס = 0.125 מ"מ x 0.117 מ"מ, זווית הפוך = 90-180 מעלות, מספר פרוסות הרוויה (sagittal) = 1. הפעל את רצף ולחכות 7 דקות 56 s עד תמונות גלם נרכשים.
5. כדי להעריך microhemorrhages, השתמש 3D הדמיה T2 * -weighted. בחר רצף FLASH מפוצם זרימה.
   1. הזן את הפרמטרים הבאים בתוכנת ה- MRI: זמן החזרה = 2.000 ms, זמן הד = 22 ms, רזולוציה איזוטרופית 0.08 מ"מ, שדה תצוגה = 32 x 15 x 8 מ"מ ³ , גודל מטריצה ​​= 400 x 188 x 100, ו- fזווית השפתיים = 12 מעלות. התחל את רצף ולחכות 15 דקות 40 s כדי לרכוש את התמונות גלם.
6. כדי להעריך פטריות עורקית, השתמש זמן של אנגיוגרפיה הטיסה על ידי בחירת רצף 3D FLASH.
   1. השתמש בפרמטרים הבאים בתוכנת ה- MRI: זמן החזרה = 16 ms, זמן הד = 3.5 מילישניות, עובי פרוסה = 0.07 מ"מ, רזולוציה בתוך המטוס = 0.104 x 0.104 מ"מ, שדה תצוגה = 20 x 20 x 10 מ"מ ³ , מטריצה = 192 x 192 x 142, והפוך זווית = 15 מעלות. הפעל את רצף לחכות 7 דקות 16 s עד התמונות נרכשים.
7. כדי להעריך הפרעה מוחית מוח דם, השתמש 3D דימות משוקלל T1 לפני ואחרי הזרקת סוכן בניגוד 0.3 mmol / kg. בחר רצף FLASH תדר רדיו מפונק עם עירור תדר רדיו גלובלי.
   1. השתמש בפרמטרים הבאים ברצף בתוכנת ה- MRI: זמן חזרות = 5 ms, זמן הד = 1.9 ms, רזולוציה איזוטרופית = 0.156 מ"מ, שדה תצוגה 20 x 18.7X 18.7 מ"מ ³ , מטריצה ​​128 x 120 x 120 וזווית הפוך = 8.5 ° ;. התחל את רצף לחכות 1 דקות 14 עד התמונות נרכשים.

4. עיבוד תמונה וניתוח

1. כדי לנתח את המוח הפרעה מחסום דם, לחסר 3D שאינם משופרת תמונות T1 משוקלל משופרת תמונות משוקלל T1 עם כלי אריתמטי או כלי תמונה התמונה ImageJ. להעריך את תמונות חיסור עבור עלייה של האות, אשר תואמת הפרעות במחסום דם מוחי. ⁹
2. כדי לנתח את עוצמת הקול במוח, השתמש במערכי נתונים תלת-ממדיים משוקללים של T1 או 3D T2. מסדרים את המוח מן הנורה חוש הריח למוח הקטן באמצעות עורך פילוח. ¹⁰
3. בצקת ואזוגנית
   1. לעבד את הנתונים T2 relaxometry עם תוכנת MRI או להשתמש הליך ליניארי לפחות ריבועים להתאים. ¹¹ תהליך דיפוזיה משוקלל נתונים כדי להשיג מפות ADC באמצעות MRI sofTware או FDT ארגז כלים (ראה טבלת חומרים ).
   2. מקום אזורים של עניין באופן ידני לתוך אזורים אנטומיים שונים.
      הערה: המיקום האוטומטי של תחומי עניין עשוי להירשם בצורה לא נכונה עקב נפיחות מוחית משמעותית. T2 פעמים וערכים ADC של האזורים האנטומיים שנבחרו מתקבלים בצורה זו.
4. כדי לנתח את נפח microhemorrhage, להגדיר microhemorrhages, אשר מופיעים כמו ovoid, מוקדים כהים על T2 * dedasets משקל, באמצעות עורך פילוח.

תוצאות

ב C57BL / 6 עכברים, הסימפטומים הקליניים הראשונים של ECM ניתן לראות בין הימים 6 ו 10 לאחר ההדבקה עם P. ברגי ANKA sporozoites. ECM מפתחת 60-80% של עכברים נגועים במהירות התקדמות לתרדמת ומוות בתוך 24 עד 48 שעות. לעומת זאת, עכברים שאינם מפתחים ECM מתים לאחר השבוע השני לאחר הה?...

Discussion

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול MRI של המוח כולו כדי לקבוע שינויים במלריה במוח ניסיוני. אנו מאמינים כי MRI כבר under-utilised במחקר מלריה עד כה ומקווים כי הפרוטוקולים שלנו יסייע לחוקרים אחרים. ברצוננו לתאר כמה נקודות נוספות שעשויות להיות מועילות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter	1001747	for anesthesia
Dotarem	Guebert	1086923	Gd-DTPA contrast agent; 0.5 mmol/mL
Amira (Image Processing Program)	FEI Group		Version Amira 5.3.2
MATLAB	The MathWorks, Inc.,		Release 2012b
FDT toolbox	FMRIB's Software Library	http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html