Manyetik Rezonans Görüntüleme Kullanarak Deneysel Serebral Sıtma Bir Modelinde Ödem Gelişimi ve Mikrovasküler Patolojinin İn Vivo Takibi

Özet

We describe a mouse model of experimental cerebral malaria and show how inflammatory and microvascular pathology can be tracked in vivo using magnetic resonance imaging.

Özet

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of cerebral malaria can be difficult. We present an experimental mouse model of cerebral malaria that shares multiple features of the human disease, including edema and microvascular pathology. Using magnetic resonance imaging (MRI), we can detect and track the blood-brain barrier disruption, edema development, and subsequent brain swelling. We describe multiple MRI techniques that can visualize these pertinent pathological changes. Thus, we show that MRI represents a valuable tool to visualize and track pathological changes, such as edema, brain swelling, and microvascular pathology, in vivo.

Giriş

Sıtma önemli bir küresel sağlık sorundur. ¹ Şiddetli sıtma kısmen serebral tutulum ile karakterizedir ve genellikle kötü bir prognostik faktördür. Serebral tutulum, yüksek sıtma iletim alanlarında beş yaşın altındaki çocuklarda görülür ve bu yaş grubunda sıtmaya bağlı ölümün ana nedenini temsil eder. ¹ Agresif tedavi hayatı kurtarabilirken, serebral sıtmanın özellikle erken safhalarda saptanması zor olabilir. Serebral sıtma ile ilgili patolojik süreçler mikrovasküler bozulma ve ciddi beyin şişmesine neden olabilen serebral ödemleri içerir. Bu yazıda, deneysel serebral sıtmanın (ECM) in vivo tüm beyin görüntülemesine olanak tanıyan bir manyetik rezonans görüntüleme (MRI) protokolü sunulmuştur. ECM'nin merkezde nasıl başlattığı hakkında çok az şey bilinmesine rağmen, tüm beyinli yüksek çözünürlüklü görüntüleme yöntemleri bu hastalıkta yaygın şekilde kullanılmamaktadır.Sinir sistemi veya hastalığa yol açan belirli mekanizmalar. Bütün beyni kapsayan in vivo MRG, ECM patolojisini daha iyi anlamak için önemli bir araştırma aracıdır. MR, yakın zamanda sadece ECM'de değil, aynı zamanda insan serebral sıtmada ölümün önemli bir belirteçi olduğu kabul edilen küresel beyin beyin şişmesini de değerlendirebilir. ^{2 , 3} Ağır beyin şişmesi ölümcül hastalıkta ortaya çıkar ve ECM modelleri ile inflamatuar ve mikrovasküler değişikliklerle karakterize edilen bir hastalık olan çeşitli patolojik özelliklerden birini temsil eder. ⁴

ECM, ölümcül Plasmodium berghei ANKA ile enfeksiyon yoluyla CBA veya C57BL farelerinde indüklenebilir. ECM'nin başlangıcı tipik olarak enfeksiyon sonrası 6. ve 10. günlerde ortaya çıkar ve uyuşma, ataksi, solunum sıkıntısı ve komaya neden olur ki bu da rap oluştururÖlüm id ⁴ Hızlı Murin Koma ve Davranış Ölçeği (RMCBS), ECM'nin klinik belirtilerini değerlendirmek için yararlı bir noktadır. Her biri 0 ile 2 arasında puan alan 10 parametreden oluşuyor ve olası maksimum skor 20'dir. ⁶ Yakın zamanda, ECM farelerindeki RMCBS skorlarının şiddeti ile MR ile gösterilen patolojik değişiklikler arasında iyi bir uyum gösterdik. ⁷ Bu protokolde, farelerde ECM indüksiyonu ve ECM'ye sahip farelerin in vivo manyetik rezonans görüntülemesini tarif ederiz.

Protokol

Bu makalede bildirilen tüm hayvan deneyleri, Laboratuar Hayvanları Dernekleri Federasyonu (FELASA) kategorisi B ve Laboratuar Hayvanları Bilimi Topluluğu (GV-SOLAS) standart yönergelerine göre gerçekleştirildi ve Karlsruhe'deki yerel Alman makamları tarafından onaylandı (Regierungspräsidium Karlsruhe , Almanya). Biyolojik gözde 2. seviye, sivrisinek ve Plasmodium berghei ANKA sporozoit çalışmaları için geçerlidir.

1. Enfeksiyon

1. Anopheles stephensi sivrisineklerini Plasmodium berghei ANKA ile bir gametositik fare üzerinde 15 dakika boyunca besleyerek enfekte edin. Enfekte olmuş sivrisinekleri% 80 nem ve 21 ° C'de tutun.
2. Kan sularını kanından 17-22 gün sonra kendi kafeslerinden toplayın. Onları anestezi için buz üzerine koyun.
3. Forseps kullanarak, bir damla soğuk RPMI ortamı ile kaplanmış bir cam slaytta üç ila dört sivrisinek yerleştirin. Slayt mikroskop altına yerleştirin.
4. Forseps kullanarak, sivrisinek başıyla gövde arasına dikkatli bir şekilde gerdirin. Bir şırınga ve iğne kullanarak tükürük bezini izole edin. Bu işlemi kalan sivrisineklerle tekrarlayın.
5. Bir cam pipet ile emerek cam slayttan tükürük bezlerini toplayın ve onları 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
   NOT: Enfeksiyon oranlarına bağlı olarak, tükürük bezi başına genellikle 8000 ila 15000 bulaşıcı sporozoit elde edilebilir.
6. Yaklaşık 3 dakika boyunca, sükunet bezi dokusundan sporozoitleri izole etmek için küçük, plastik bir sopayla santrifüj tüpü içindeki izole tükürük bezlerini parçalayın.
7. Kalan dokudan sporozoitleri arındırmak için 1,000 xg'de ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin.
8. Sporozoitleri (SPZ) içeren süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne pipetleyin ve bir Neubauer hemositometresinde saflaştırılmış sporozoitleri sayın.
9. Saflaştırılan sporozoitlerin konsantrasyonunu 10.000 / mL'ye ayarlamak için ph eklenmelidir.Osfat tamponlu salin.
10. Enfekte etmek için yakın akrabalı C57BL / 6 farelerin kuyruk damarlarına toplam 1.000 sporozoit (0.1 mL) enjekte edin. Enjeksiyonları kolaylaştırmak için, C57BL / 6 farelerini bir sınırlayıcıya yerleştirin ve kuyruk damarlarının görselleştirilmesine yardımcı olmak için kuyrukları ılık (yaklaşık 37 ° C) suya koyun;
    NOT: Enjeksiyonun kendisi birkaç saniye içinde gerçekleştirilebilen kısa bir prosedürdür.
11. Günde bir kez, SPZ enfeksiyonundan sonra 3. günden itibaren kan yaymalarındaki kan basması parazitemisini kontrol edin.
    NOT: İzleme parazitemi, daha önce JoVE makalesinde Mueller ve ark. Tarafından görselleştirilmiştir . ⁸
12. Fareleri, sporozoit enjeksiyonundan sonraki 5. günden itibaren Hızlı Murin Koma ve Davranış Ölçeği (RMCBS) skoru ile günde bir kez değerlendirin.
    NOT: Bir video gösterimi de dahil olmak üzere bu prosedürün ayrıntılı bir açıklaması Caroll ve diğerleri tarafından yayımlanmıştır . ⁶
13. BelirlemekRMCBS skoruna göre MR görüntülemeye sahip fareler ve ele alınacak araştırma sorusu. ⁶

2. Manyetik Rezonans Görüntüleme Kurulumu

1. Radyofrekans iletimi için bir hacim rezonatörü ve 4 kanallı faz dizi yüzeyli alıcı bobin kullanan bir 9.4T küçük hayvan tarayıcıda MR uygulayın. Fare vücut sıcaklığını korumak için sıcaklık kontrollü su banyosunu 42 ° C'ye getirin.
2. Fare artık parmak sıkışmasına tepki verilene kadar% 2 izofluran ve sıkıştırılmış hava kullanarak odadaki anestezi indükleyin. Anesteziyi% 1-1.5 tutun.
3. Farenin kuyruk damarına bir kuyruk ven kateteri yerleştirin. Fareyi, eğilimli olarak yerleştirerek ve kafa hareketini en aza indirgemek için bir başlık ve diş çubuğu ile donatılmış bir hayvan yatağına yerleştirin. Farenin servikal omurgasını düzleştirmemeye özen gösterin.
4. Kuyruk damar katetere kontrast ajan enjeksiyon sistemi bağlayın. Gd-DTPA (0.3 mmol / kg) şırınga ile doldurulmuş ısmarlama bir enjeksiyon sistemi kullanın veya bir Gd-DTPA (0.3 mmol / kg) şırıngaya bağlı PE boru kullanın.
5. Her iki gözde dexpanthenol göz merhemi uygulayın. 4 kanallı faz dizi alıcı alıcı kafa bobini farenin başına yerleştirin. Farenin arkasına solunum pedini yerleştirin ve bir solunum izleme cihazına bağlayın.

3. Görüntüleme Protokolü

NOT: Ele alınacak araştırma sorularına göre aşağıda listelenen protokollerden görüntüleme sekanslarını seçin. Listelenen tüm parametreler MRI yazılımı için geçerlidir, ancak diğer yazılım programları kullanılıyorsa düzeltilmesi gerekebilir.

1. Fare beyninin mıknatısın izosantresinde olduğundan emin olmak için bir lokalize tarama gerçekleştirerek başlayın.
2. Vazojenik ödemi niteliksel olarak değerlendirmek için çok dilimli bir RARE dizisi seçerek 3D T2 ağırlıklı görüntüleme kullanın.
   1. Aşağıdaki pa'yı girinTekrarlama süresi = 2.000 ms, yankı süresi = 22 ms, izotropik çözünürlük = 0.1 mm, görüş alanı = 20 x 10 x 12 mm ³ ; Matris = 200 x 100 x 120, çevirme açısı = 90-180 °; (Spin-eko) ve nadir faktör = 8'dir. Sıra başlatın ve ham görüntüleri elde etmek için 10 dakika 48 saniye bekleyin.
3. Vazojenik ödemi kantitatif olarak değerlendirmek için, çok dilimli, çoklu spin echo dizisi seçerek T2 relaksometri gerçekleştirilir.
   1. Aşağıdaki parametreleri kullanın: tekrarlama süresi = 3.100 ms, yankı süresi = 8-136 ms, 8 ms'lik artışlarla, dilim sayısı = 17, dilim kalınlığı = 0.7 mm, düzlem çözünürlük = 0.116 mm x 0.116 mm, görüş alanı 20 X 20 mm2, matris = 172 x 172, flip açısı = 90-180 derece; (Spin eko). Sıra başlatın ve ham görüntüler elde etmek için 8 dakika 53 saniye bekleyin.
4. Hem vazojenik ödemi hem de sitotoksik ödemi kantitatif olarak değerlendirmek için, difüzyon ağırlıklı görüntüleme / görünür difüzyon katsayıları uygulayınBir spin-eko EPI difüzyon sekansı seçerek, uygun (ADC) haritalama.
   1. Aşağıdaki parametreleri kullanın: Tekrarlama süresi = 3.400 ms, yankı süresi = 20 ms, dilim kalınlığı = 0.7 mm, dilim sayısı = 17, difüzyon hassaslaştırılmış yönlerin sayısı = 30, b değeri = 1.500 s / mm2, δ = 3 ms , Δ = 9 ms, kısmi Fourier şifreleme ivme faktörü = 1.51, görüş alanı = 12 x 15 mm2, matris = 96 x 128, düzlem çözünürlüğü = 0.125 mm x 0.117 mm, çevirme açısı = 90-180 derece ve Doygunluk dilimlerinin sayısı (sagital) = 1. Seri başlatın ve ham görüntüler elde edilinceye kadar 7 dakika 56 saniye bekleyin.
5. Mikrohemorileri değerlendirmek için, 3D T2 * ağırlıklı görüntüleme kullanın. Akış dengeli bir FLASH dizisi seçin.
   1. Aşağıdaki parametreleri MRI yazılımına girin: Tekrar süresi = 2.000 ms, yankı süresi = 22 ms, izotropik çözünürlük 0.08 mm, görüş alanı = 32 x 15 x 8 mm ³ , matris boyutu = 400 x 188 x 100 ve fDudak açısı = 12 derece. Sıra başlatın ve ham görüntü elde etmek için 15 dakika 40 saniye bekleyin.
6. Arteryel açıklığı değerlendirmek için, 3D FLASH sekansı seçerek uçuş anjiyografi zamanını kullanın.
   1. MRI yazılımında aşağıdaki parametreleri kullanın: Tekrar süresi = 16 ms, yankı süresi = 3.5 ms, dilim kalınlığı = 0.07 mm, düzlem çözünürlüğü = 0.104 x 0.104 mm, görüş alanı = 20 x 20 x 10 mm ³ , matris = 192 x 192 x 142 ve çevirme açısı = 15 derece. Sıra başlatın ve görüntüler elde edilinceye kadar 7 dakika 16 saniye bekleyin.
7. Kan-beyin bariyeri bozulmasını değerlendirmek için 0.3 mmol / kg kontrast ajan enjeksiyonu öncesi ve sonrası 3D T1 ağırlıklı görüntüleme kullanın. Genel bir radyo frekansı uyarımı ile radyo frekansıyla şımartılmış FLASH dizisi seçin.
   1. MRI yazılımında aşağıdaki dizi parametrelerini kullanın: Tekrar süresi = 5 ms, eko süresi = 1.9 ms, izotropik çözünürlük = 0.156 mm, görüş alanı 20 x 18.7X 18.7 mm3, matris 128 x 120 x 120 ve çevirme açısı = 8.5 °; Sıra başlatın ve görüntüler elde edilinceye kadar 1 dakika 14 saniye bekleyin.

4. Görüntü İşleme ve Analiz

1. Kan-beyin bariyeri bozulmasını analiz etmek için ImageJ'deki aritmetik araç veya görüntü hesaplama aracı ile geliştirilmiş T1 ağırlıklı görüntülerden 3D olmayan arttırılmış T1 ağırlıklı görüntüleri çıkarın. Kan-beyin bariyeri bozulmasına karşılık gelen bir artış sinyali için çıkarma görüntülerini değerlendirin. ⁹
2. Beynin hacmini analiz etmek için yerli 3D T1 veya 3D T2 ağırlıklı veri kümelerini kullanın. Segmentasyon düzenleyicisini kullanarak beyni koku ampulünden serebele doğru tasvir edin. ¹⁰
3. Vazojenik ödem
   1. T2 gevşetme verilerinin MR yazılımı ile işlenmesi veya doğrusal olmayan en küçük kareler uyma prosedürü kullanılması. ¹¹ MRC sof kullanarak ADC haritaları elde etmek için işlem difüzyon ağırlıklı verilerÇifte veya FDT alet kutusuna yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu ).
   2. İlgilendiğiniz bölgeleri elle farklı anatomik bölgelere yerleştirin.
      NOT: Beynin şişmesi nedeniyle ilgi alanlarının otomatik yerleştirilmesi hatalı kaydedilebilir. Seçilen anatomik bölgelerin T2 ve ADC değerleri bu şekilde elde edilir.
4. Mikrohemoraj hacmini analiz etmek için segmentasyon editörünü kullanarak T2 * ağırlıklı veri kümelerinde ovoid, karanlık odak olarak görünen mikrohemrhajları tanımlayın.

Sonuçlar

C57BL / 6 farelerinde ECM'nin ilk klinik semptomları, P. berghei ANKA sporozoitleriyle enfeksiyondan sonra 6 ve 10 günler arasında gözlemlenebilir. ECM, enfekte olmuş farelerin% 60-80'inde gelişir ve 24 ila 48 saat içinde hızla komaya ve ölüme geçer. Buna karşılık, ECM gelişmeyen fareler, hiperparasitemiye bağlı ciddi anemiden enfeksiyon sonrası ikinci haftadan sonra ölürler. ¹²

Tartışmalar

Bu makalede, deneysel serebral sıtma değişikliklerini tanımlamak için bütün beyin MR protokolünü açıklıyoruz. MRA'nın sıtma araştırmasında bugüne kadar az kullanıldığına ve protokollerimizin diğer araştırmacılara yardımcı olacağını umduğuna inanıyoruz. Yararlı olabilecek bazı ek noktalar açıklamak isteriz.

Ağır hasta fareler görüntülendiğinde, konumlandırma çok önemlidir. İntrakranyal basıncın artması nedeniyle farelerin ölümüne duyarl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter	1001747	for anesthesia
Dotarem	Guebert	1086923	Gd-DTPA contrast agent; 0.5 mmol/mL
Amira (Image Processing Program)	FEI Group		Version Amira 5.3.2
MATLAB	The MathWorks, Inc.,		Release 2012b
FDT toolbox	FMRIB's Software Library	http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html