بروتوكول لتوصيف التغيرات المورفولوجية<em&gt; كلوستريديوم ديفيسيل</em&gt; في الاستجابة للعلاج بالمضادات الحيوية

Summary

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Abstract

تقييم عمل المضادات الحيوية مع تطوير العقاقير الجديدة الموجهة نحو البكتيريا اللاهوائية أمر صعب ومطالب من الناحية الفنية. للحصول على نظرة ثاقبة وزارة الزراعة ممكن، والتغيرات المورفولوجية المرتبطة التعرض للمضادات الحيوية يمكن تصور باستخدام المجهر الإلكتروني المسح (سيم). دمج التصوير سيم مع منحنيات قتل التقليدية قد تحسن رؤيتنا في العمل المخدرات والمضي قدما في عملية تطوير المخدرات. لاختبار هذه الفرضية، وقتل منحنيات ودراسات سيم أجريت باستخدام المخدرات مع وزارة الزراعة المعروفة ولكن مختلفة (فانكومايسين وميترونيدازول). خلايا C. صعب (R20291) نمت مع أو بدون وجود المضادات الحيوية لمدة تصل إلى 48 ساعة. على مدى فترة 48 ساعة، تم جمع الخلايا في نقاط زمنية متعددة لتحديد فعالية المضادات الحيوية والتصوير على سيم. وتمشيا مع التقارير السابقة، كان فانكومايسين وميترونيدازول نشاطا كبيرا للجراثيم بعد 24 ساعة من العلاج على النحو الذي تقاسه وحدة تشكيل مستعمرة (كفو) كونتينغ. باستخدام التصوير سيم، وجدنا أن ميترونيدازول له آثار كبيرة على طول الخلية (> 50٪ تخفيض في طول الخلية لكل المضادات الحيوية؛ P <0.05) مقارنة مع الضوابط والفانكومايسين. في حين لم يتم توثيق الاستجابة المظهري للعلاج من تعاطي المخدرات سابقا بهذه الطريقة، فإنها تتفق مع وزارة الزراعة المخدرات التي تبين تنوع وموثوقية التصوير والقياسات وتطبيق هذه التقنية للمركبات التجريبية الأخرى.

Introduction

كلوستريديوم ديفيسيل عبارة عن جرثومية إيجابية تشكل البكتريا التي تسبب الجراثيم، مما تسبب في حوالي 500،000 إصابة سنويا في الولايات المتحدة، ويعتبر هذا المرض ممرضا عاجلا على مستوى التهديد من قبل مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها، وهو أعلى مستوى من المخاطر. ¹ شهد العقد الماضي تطورا كبيرا في العقاقير المضادة للميكروبات مع النشاط ضد C. صعب . ^{2 ، 3} في المختبر الدراسات هي عنصر ضروري من عملية تطوير المخدرات. ⁴ تقليديا، في المختبر وقابلية الوقت وقتل الدراسات تستخدم للتحقق من صحة الحيوان في المستقبل وغيرها من الدراسات في الجسم الحي .

في حين أن هذه الأساليب تخدم دورا هاما لتقييم عمل القتل، فإنها لا تعبر عن استجابة الخلايا الظاهرية للعلاج الدوائي. من خلال دمج المسح المجهري الإلكتروني (سيم) مع القياسيهد قتل الدراسات الحركية، توصيف أكثر دقة من المضادات الحيوية الآثار المباشرة هو ممكن. ^{5 ، 6 ، 7} هنا، نقدم طريقة حيث سيم يستخدم كوسيلة للتعرف على فعالية العلاج بالمضادات الحيوية.

Protocol

1. عزل C. صعب من مختلف المصادر البيئية أو السريرية

1. العزلات البيئية: باستخدام مقياس القطن المعقم مسبقا (مبللة طفيفة مع 0.85٪ كلوريد الصوديوم)، مسحة سطح أي مجال من مجالات الاهتمام (الكلمة، الباب، مقبض، الرف، الخ ). ⁸ تأكد من ارتداء قفازات معقمة ووضع مسحة في أنبوب معقمة بعد الانتهاء.
2. العزلات السريرية (البراز): لوحة 10 إلى 100 ملغ من عينات البراز السريري على أجار السيفوكسيتين سيكلوسيرين - الفركتوز (كفا) باستخدام حلقة التلقيح واحتضان تحت ظروف اللاهوائية صارمة لمدة 48 - 72 ساعة. مخزن المستعمرات المعزولة من C. صعب الأسهم في كريوفيالز في -80 درجة مئوية لمزيد من التحليلات. ^{7 ، 9 ، 10}
3. إثراء عينات مسحة البيئية في الدماغ ضخ القلب (بهي) مرق مع 0.05٪ توروشولات الصوديوم ومكان في غرفة اللاهوائية عند 37 درجة مئويةلمدة 5 أيام. الطرد المركزي 1 مل من الثقافة في 10،000 x ج و ريسوسبيند بيليه في 100 ميكرولتر من الإيثانول.
4. لوحة الخلايا معلق (50 ميكرولتر) على سيكلوسيرينسيفوكسيتين أجار الفركتوز (كفا) لوحات واحتضان في غرفة اللاهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة 40 - 48 ساعة. مخزن المستعمرات المعزولة من C. صعب الأسهم في كريوفيالز في -80 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.
5. اختبار يشتبه C. المستعمرات صعب باستخدام كاشف تراص اللاتكس أو ير.

2. زراعة C. صعب وقتل الإجراءات الحركية

1. تنمو تنقيته البيئية أو السريرية C. السلالات صعب على لوحات أجار الدم في غرفة اللاهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
2. تأخذ مستعمرة واحدة معزولة مع حلقة التلقيح، ونقله إلى 5 مل بهي المتوسطة في أنبوب 15 مل، وتنمو لمدة 24 ساعة في غرفة اللاهوائية عند 37 درجة مئوية.
3. تمييع ما قبل الثقافات 1: 100 إلى ما يقرب من 10 ⁶ وحدة تشكيل مستعمرة(كفو) / مل في الطازجة قبل تخفيض بهيس (بهي زائد 5 جرام / لتر استخراج الخميرة و 1٪ L- السيستين) تستكمل مع 0.1٪ توروشولات الصوديوم والتركيز المناسب للمضادات الحيوية (T0).
4. جمع عينة 1 مل مع ماصة في كل نقطة زمنية (T0، T6، T24، T48) لوحة / انتشار قسامة صغيرة (100 ميكرولتر في التخفيفات المسلسل) على لوحة أجار الدم. السماح للخلايا تنمو على لوحة أجار الدم لمدة 48 ساعة في غرفة اللاهوائية عند 37 درجة مئوية، وعدد عدد الناتجة من المستعمرات لتحديد كفو.

3. إعداد عينات لمسح المجهر الإلكتروني

1. جمع 1 مل من الخلايا من كل نقطة زمنية في أنابيب ميكروسنتريفوج وأجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف وغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني.
2. الطرد المركزي العينات في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة مرة أخرى وتجاهل طاف. إعادة تمييع الخلايا في 1 مل من بارافورمالدهيد 4٪ واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
3. عينات الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في 10،000 زغ وتجاهل طاف. غسل الخلايا مرتين مع الماء المقطر وإعادة تعيين في 100 ميكرولتر من الماء المقطر. ضبط حجم اعتمادا على تعكر الحل.
   ملاحظة: جعل التخفيفات التسلسلية متعددة هي فكرة جيدة.
4. تسمية كوفرسليبس وإضافة 40 ميكرولتر من العينة على ذلك. احتضان لمدة 15 دقيقة في غطاء محرك السيارة لتدفق السائل والسماح للخلايا على التمسك ساترة. إذا كان السائل لا يزال موجودا، استخدم منفاخ لإزالة السائل.
5. مكان كوفرسليبس المسمى مع الخلايا في آلة الاخرق مكتب وشريط أسفل. تأمين الذهب الخالص في آلة الاخرق. بدوره على الجهاز والبدء الاخرق في الضغط المنخفض (50 متور). خلايا معطف لمدة 30 ثانية في 80 مللي أمبير، والذي يترجم إلى 20 نانومتر من طلاء الذهب.
6. نقل الخلايا المغلفة إلى المجهر الإلكتروني الماسح الضوئي.

4. التصوير C. صعب الخلايا على المجهر الإلكتروني المسح الضوئي

1. تنفيس المجهر الإلكتروني الماسح (سيم) بشكل صحيح من قبل العلاقات العامةإسينغ زر تنفيس على برامج الكمبيوتر.
2. باستخدام الشريط الكربون، وتأمين كوفرسليبس المغلفة على المرحلة المعدنية. بمجرد تنفيس سيم، يجب فتح الباب بسهولة. قفل المرحلة المعدنية في غرفة سيم عن طريق شد عليه في.
3. انقر فوق الزر بومب في برنامج الكمبيوتر. سوف سيم تكون صالحة للاستخدام عندما يقرأ النظام "فاك موافق".
4. انقر على كاشف سي تحت علامة التبويب كاشفات. بدوره على شعاع من خلال النقر على الزر الذي يعرض الجهد. بدء التصوير في الجهد المنخفض (5 كيلو فولت) قبل زيادة الجهد (تصل إلى 15 كيلو فولت). ستظهر صورة بعد تشغيل الحزمة.
5. باستخدام وظيفة تتبع، والعثور على منطقة على كوفرسليبس المغلفة إلى الصورة. التكبير في المنطقة والعثور على هياكل على شكل قضيب. هذه هي كلوستريديوم صعب .
6. التكبير والتركيز على الصورة لمعايرة النظام. وينبغي أن يتم ذلك على مسافات عمل متعددة: 15 و 9 و 5 مم. صورة على مسافة عمل 5 مم.
7. قم بتشغيل uلترا عالية الدقة وضع التصوير والبدء في التركيز وتحسين الاستجماتيزم.
8. بدء التركيز في التكبير عالية. استخدام التركيز الخشنة وغرامة تبديل لهذا الغرض. ضبط الاستجماتيزم وكذلك للحصول على صورة أوضح.
   1. ضبط الاستجماتيزم في التكبير عالية. للقيام بذلك، وضبط الصيغ الاستجماتيزم (أنها تبدو مشابهة للتبديل التركيز غرامة / الخشنة) والتحقق من الصورة عن وضوح عن طريق التكبير رقميا على برامج الكمبيوتر.
9. سي وظيفة المسح البطيء لجمع صورة ذات جودة عالية. حفظ الصورة التي تم جمعها كملف .TIFF، والتي سيتم استخدامها للتحليل. تأكد من تحديد شريط البيانات إذا تم إجراء القياسات أثناء التحليل.
10. جمع الصور في زوايا مختلفة (تصل إلى 52 درجة عن طريق تحويل زاوية مباشرة على سيم.الزاوية الصور تميل إلى الكشف عن مزيد من المعلومات العمق.
11. تغيير شعاع الجهد اعتمادا على الخلايا التي يتم تصويرها. الحفاظ على هذا في الغالب بين 5-15 كيلوفولت لجميع التجارب.
12. بعد اكتمال التصوير، قم بإيقاف تشغيل الحزمة ورفع مسافة العمل إلى 20 مم. ويمكن بعد ذلك تنفيس الغرفة ويمكن إزالة المرحلة. نسخ جميع الصور على محرك الأقراص لمزيد من التحليل.

5. معالجة الصور وتحليلها

1. تحميل وتثبيت البرمجيات المتاحة بحرية، فيجي (http://fiji.sc)، على جهاز الكمبيوتر.
2. افتح ملف الصورة في فيجي.
3. باستخدام وظيفة الخط، تتبع بدقة شريط مقياس.
4. انقر فوق علامة التبويب تحليل في برنامج فيجي وأخيرا حدد وظيفة تحديد مقياس. ستظهر نافذة ستتطلب تحديد المسافة المعروفة استنادا إلى شريط المقياس. تغيير وحدة طول وكذلك انقر فوق موافق.
5. الآن بعد أن يتم معايرة البرنامج لمسافة، استخدم وظيفة خط لقياس طول الخلية. للحصول على طول، استخدم الدالة خط لتتبع الخلية في مجملها. حدد علامة التبويب تحليل مرة أخرى ثم انقر على قياس. يجب طول التطبيقالأذن في الوحدات المشار إليها سابقا.

النتائج

كلوستريديوم ديفيسيل هو بكتيريا تشكيل بوغ وبالتالي فمن الضروري تحديد الاختلافات التشكل بين الخضري وخلايا بوغ قبل أي تحليل وظيفي. الشكل 1 يوضح الصور التمثيلية للخلايا الخضرية التي تم التقاطها خلال المرحلة الأسية من منحنى النمو وخ?...

Discussion

وكان الهدف من الدراسة الحالية لخلق طريقة عالية الإنتاجية لعزل C. صعب واختبار الحساسية للمضادات الحيوية باستخدام المجهر الإلكتروني المسح (سيم) كوسيلة لتوصيف أكثر دقة من العمل الدوائي للمضادات الحيوية. باستخدام البروتوكولات المبينة هنا، أثبتنا أن التصوير استجاب...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
cotton gauze	Caring	PRM21408C
NaCl	Macron	7532
50 mL tubes	Falcon	352098
Brain Heart Infusion (BHI)	Criterion	C5141
L-cysteine	Alfa Aesar	A10389
yeast extract	Criterion	C741
sodium taurocholate	Alfa Aesar	A18346
anaerobic chamber	Coy		vinyl anaerobic chamber
cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates	Anaerobe systems	AS-213
blood agar plates	Hardy diagnostics	A-10
latex agglutination reagent	Oxoid	DR1107A	C. diff test kit
microcentrifuge tubes	Eppendorf	222363204
PBS	Gibco	10010-031
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	50-259-98
microscope slides	J. Melvin freed brand	7525M	75 x 25mm
flow hood	Labconco	Class II type A2	biosafety cabinet
desk sputtering machine	Denton Vacuum	Desk II
tape	Plastic Core	05072-AB	SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape
gold	Denton Vacuum	TAR001-0158	2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil
scanning electron microscope	FEI	XL-30