Протокол для характеристики морфологических изменений<em&gt; Сложный Clostridium</em&gt; В ответ на лечение антибиотиками

Резюме

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Аннотация

Оценка действия антибиотиков при разработке новых лекарств, направленная на анаэробные бактерии, сложна и технически сложна. Чтобы получить представление о возможном MOA, морфологические изменения, связанные с воздействием антибиотиков, можно визуализировать с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). Интеграция СЭМ-изображений с традиционными кривыми убийства может улучшить наше понимание действия лекарств и ускорить процесс разработки лекарственного средства. Чтобы проверить это предположение, кривые убивания и исследования SEM проводились с использованием препаратов с известными, но разными MOA (ванкомицин и метронидазол). C. difficile cells (R20291) выращивали с или без присутствия антибиотика в течение 48 часов. В течение 48-часового интервала клетки собирали в различные моменты времени, чтобы определить эффективность антибиотиков и визуализацию на SEM. В соответствии с предыдущими сообщениями, ванкомицин и метронидазол проявляли значительную бактерицидную активность после 24 ч лечения, измеряемого колониеобразующей единицей (КОЕ) странытин. С помощью СЭМ-изображений мы определили, что метронидазол оказывает значительное влияние на длину клетки (> 50% уменьшение длины клетки для каждого антибиотика, Р <0,05) по сравнению с контролем и ванкомицином. Хотя фенотипический ответ на лечение наркотиками ранее не был описан в этом документе, они согласуются с MOA лекарственного средства, демонстрируя универсальность и надежность изображений и измерений, а также применение этого метода для других экспериментальных соединений.

Введение

Clostridium difficile является грамположительной спорообразующей бактерией, ежегодно вызывающей около 500 000 инфекций в США, и считается Центром по контролю и профилактике заболеваний (CDC), который является самым опасным уровнем риска. ¹ За последнее десятилетие было отмечено значительное развитие лекарств в противомикробных препаратах с активностью против C. difficile . ^{2 , 3} Исследования in vitro являются необходимым компонентом процесса разработки лекарственного средства. ⁴ Традиционно исследования in vitro чувствительности и время убивают используются для проверки будущих животных и других исследований in vivo .

Хотя эти методы и играют важную роль для оценки действия убийства, они не учитывают фенотипический ответ клеток на фармакологическое лечение. Путем включения сканирующей электронной микроскопии (SEM) со стандартнымD убийство кинетических исследований, более тщательная характеристика прямого воздействия антибиотиков возможна. ^{5 , 6 , 7} Здесь мы представляем метод, в котором SEM используется для определения эффективности лечения антибиотиками.

протокол

1. Выделение C. difficile из различных экологических или клинических источников

1. Экологические изоляты: Используя предварительно стерилизованный хлопок (слегка смачиваемый 0,85% NaCl), протрите поверхность любой интересующей области (пол, дверь, ручка, полка и т . Д.). ⁸ Обязательно надевайте стерильные перчатки и поместите тампон в стерилизованную пробирку после завершения.
2. Клинические изоляты (стул): от 10 до 100 мг клинических образцов стула на цефокситин-циклосерин-фруктозный агар (CCFA), используя цикл инокуляции и инкубировать в строгих анаэробных условиях в течение 48-72 часов. Сохраняйте изолированные колонии запаса C. difficile в криопробирках при -80 ° C для дальнейших анализов. ^{7 , 9 , 10}
3. Обогащайте пробирки с окружающей средой в бульоне для инфузии мозга (BHI) с 0,05% таурохолатом натрия и помещайте его в анаэробную камеру при 37 ° CВ течение 5 дней. Центрифуга 1 мл культуры при 10000 мкг и ресуспендируют осадок в 100 мкл этанола.
4. Пластинку ресуспендированных клеток (50 мкл) на чашки циклосеринецефикитинового фруктозного агар (CCFA) и инкубируют в анаэробной камере при 37 ° C в течение 40-48 часов. Сохраняйте изолированные колонии запаса C. difficile в криопробирках при -80 ° C для дальнейших анализов.
5. Тестировали подозрительные колонии C. difficile, используя реагент агглютинации латекса или ПЦР.

2. Культивирование кинетических процедур C. difficile и Killing

1. Выращивают очищенные экологические или клинические штаммы C. difficile на пластинах кровяного агара в анаэробной камере при 37 ° С в течение 48 часов.
2. Возьмите одну изолированную колонию с петлей для инокуляции, перенесите ее в 5 мл BHI-среду в 15-мл пробирку и растите в течение 24 часов в анаэробной камере при 37 ° C.
3. Разбавьте прекультуры 1: 100 примерно до 10 ⁶ колониеобразующей единицыС (CFU) / мл в свежих предварительно восстановленных BHIS (BHI плюс 5 г / л дрожжевого экстракта и 1% L-цистеина) с добавлением 0,1% таурохолата натрия и соответствующей концентрации антибиотика (T0).
4. Соберите 1 мл образца пипеткой в ​​каждый момент времени (T0, T6, T24, T48) и намажьте / распределите небольшую аликвоту (100 мкл в серийных разведениях) на пластину с кровяным агаром. Пусть клетки растут на пластине с кровяным агаром в течение 48 часов в анаэробной камере при 37 ° C и подсчитывают результирующее количество колоний для определения КОЕ.

3. Подготовка образцов к сканирующей электронной микроскопии

1. Соберите 1 мл клеток с каждой точки времени в микроцентрифужных пробирках и центрифугируйте при 10000 мкг в течение 10 мин. Отбросьте супернатант и промойте клетки в PBS.
2. Центрифугируют образцы при 10000 мкг в течение 10 мин и отбрасывают супернатант. Повторно развести клетки в 1 мл 4% параформальдегида и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
3. Образцы центрифуги снова в течение 10 мин при 10,000 мкг и отбрасывают супернатант. Промывают клетки дважды дистиллированной водой и повторно разбавляют в 100 мкл дистиллированной воды. Отрегулируйте громкость в зависимости от мутности раствора.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Создание нескольких серийных разведений - хорошая идея.
4. Покровные покровные этикетки и добавить 40 мкл образца на нем. Инкубируйте 15 минут в капюшоне для испарения жидкости и дайте клеткам прилипать к покровному стеклу. Если жидкость все еще присутствует, используйте нагнетатель для удаления жидкости.
5. Помеченные покровные стекла с ячейками в настольной машине для напыления и наклеить ленту. Зафиксируйте чистое золото в распылительной машине. Включите машину и начните напыление при низком давлении (50 мТорр). Покрывают клетки в течение 30 с при 80 мА, что соответствует 20 нм золотого покрытия.
6. Передача покрытых клеток на сканирующий электронный микроскоп.

4. Изображения C. difficile Cells на сканирующем электронном микроскопе

1. Выпуском сканирующего электронного микроскопа (SEM) правильно prНажав кнопку выхода на компьютерном программном обеспечении.
2. Используя углеродную ленту, закрепите покровные стекла с покрытием на металлической сцене. Как только SEM будет выпущен, дверь должна легко открыться. Зафиксируйте металлическую ступень в камере SEM, вкрутив ее.
3. Нажмите кнопку НАСОС на программном обеспечении компьютера. SEM можно будет использовать, когда система запишет «Vac OK».
4. Нажмите на детектор SE под вкладкой детекторов. Включите луч, нажав на кнопку, отображающую напряжение. Начать визуализацию при более низком напряжении (5 кВ) до увеличения напряжения (до 15 кВ). Изображение появится после включения луча.
5. Используя функцию отслеживания, найдите область на покровных покровных изображениях. Осмотрите область и найдите стержневые структуры; Это clostridium difficile .
6. Увеличьте масштаб и сфокусируйте изображение для калибровки системы. Это должно быть сделано на нескольких рабочих дистанциях: 15, 9 и 5 мм. Изображение на рабочем расстоянии 5 мм.
7. ВключитьLtra с высоким разрешением и начать фокусировать и оптимизировать астигматизм.
8. Начните фокусироваться на большом увеличении. Для этого используйте грубые и тонкие фокусные переключатели. Отрегулируйте астигматизм, чтобы получить более четкое изображение.
   1. Отрегулируйте астигматизм при большом увеличении. Для этого настройте переключатели астигматизма (они похожи на переключатели тонкой / грубой фокусировки) и проверьте изображение для ясности путем цифрового увеличения в программном обеспечении компьютера.
9. С помощью функции медленного сканирования, чтобы получить высококачественное изображение. Сохраните собранное изображение как .TIFF-файл, который будет использоваться для анализа. Убедитесь, что панель данных выбрана, если измерения будут выполнены во время анализа.
10. Собирайте изображения под разными углами (до 52 °, вручную поворачивая угол непосредственно на SEM. Углы изображения, как правило, показывают больше информации о глубине.
11. Измените напряжение луча в зависимости от отображаемых ячеек. Держите это в основном между 5 - 15 кВ для всех экспериментов.
12. По завершении формирования изображения выключите луч и увеличьте рабочее расстояние до 20 мм. Затем камера может быть вентилирована, а стадия может быть удалена. Скопируйте все изображения на диск для дальнейшего анализа.

5. Обработка и анализ изображений

1. Загрузите и установите свободно распространяемое программное обеспечение FIJI (http://fiji.sc) на компьютер.
2. Откройте файл изображения в FIJI.
3. Используя функцию линии, точно проведите масштабную шкалу.
4. Перейдите на вкладку «Анализ» в программе FIJI и, наконец, выберите функцию «Выбрать масштаб». Появится окно, которое потребует установки известного расстояния на основе шкалы. Измените также единицу измерения длины и нажмите OK.
5. Теперь, когда программа откалибрована для расстояния, используйте линейную функцию для измерения длины ячейки. Чтобы получить длину, используйте функцию линии, чтобы полностью проследить ячейку. Снова выберите вкладку «Анализ» и нажмите «Измерять». Длина должна быть appУхо в единицах, обозначенных ранее.

Результаты

Clostridium difficile является спорообразующей бактерией, и поэтому важно определить морфологические различия между вегетативными и споровыми клетками перед любым функциональным анализом. Рисунок 1 демонстрирует репрезентативные изображения вегетативных кле?...

Обсуждение

Целью настоящего исследования было создание высокопроизводительного метода для выделения C. difficile и тестирования восприимчивости к антибиотикам с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) в качестве средства для более полной характеристики фармакологического действия а?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
cotton gauze	Caring	PRM21408C
NaCl	Macron	7532
50 mL tubes	Falcon	352098
Brain Heart Infusion (BHI)	Criterion	C5141
L-cysteine	Alfa Aesar	A10389
yeast extract	Criterion	C741
sodium taurocholate	Alfa Aesar	A18346
anaerobic chamber	Coy		vinyl anaerobic chamber
cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates	Anaerobe systems	AS-213
blood agar plates	Hardy diagnostics	A-10
latex agglutination reagent	Oxoid	DR1107A	C. diff test kit
microcentrifuge tubes	Eppendorf	222363204
PBS	Gibco	10010-031
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	50-259-98
microscope slides	J. Melvin freed brand	7525M	75 x 25mm
flow hood	Labconco	Class II type A2	biosafety cabinet
desk sputtering machine	Denton Vacuum	Desk II
tape	Plastic Core	05072-AB	SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape
gold	Denton Vacuum	TAR001-0158	2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil
scanning electron microscope	FEI	XL-30