Protocolo para Caracterizar as Alterações Morfológicas<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Em resposta ao tratamento antibiótico

Resumo

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Resumo

A avaliação da ação antibiótica com o desenvolvimento de novos fármacos voltados para as bactérias anaeróbias é difícil e tecnicamente exigente. Para se ter uma ideia do possível MOA, as alterações morfológicas associadas à exposição aos antibióticos podem ser visualizadas utilizando microscopia electrónica de varrimento (SEM). Integrar a imagem de SEM com as curvas tradicionais de morte pode melhorar nossa visão sobre a ação da droga e avançar no processo de desenvolvimento da droga. Para testar esta premissa, as curvas de morte e os estudos de SEM foram conduzidos utilizando fármacos com MOA conhecidos mas diferentes (vancomicina e metronidazol). As células de C. difficile (R20291) foram cultivadas com ou sem a presença de antibiótico até 48 h. Ao longo do intervalo de 48 h, as células foram recolhidas em múltiplos pontos de tempo para determinar a eficácia de antibióticos e para imagens no SEM. De acordo com os relatórios anteriores, a vancomicina eo metronidazol apresentaram uma actividade bactericida significativa após 24 h de tratamento, tal como medido pela unidade de formação de colónias (UFC)Ting Usando a imagem SEM, determinou-se que o metronidazol teve efeitos significativos sobre o comprimento celular (> 50% de redução no comprimento celular para cada antibiótico, P <0,05) em comparação com os controles e vancomicina. Embora a resposta fenotípica ao tratamento com fármaco não tenha sido previamente documentada desta forma, são consistentes com o MOA do fármaco demonstrando a versatilidade e fiabilidade da imagem e medições e a aplicação desta técnica para outros compostos experimentais.

Introdução

Clostridium difficile é uma bactéria gram-positiva, formadora de esporos, causando cerca de 500.000 infecções anualmente nos EUA e é considerada um patógeno urgente de ameaça pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC), o maior nível de risco. A década passada tem visto um desenvolvimento considerável de fármacos em antimicrobianos com atividade contra C. difficile . ^{2 , 3} Os estudos in vitro são um componente necessário do processo de desenvolvimento do fármaco. ⁴ Tradicionalmente, estudos de susceptibilidade in vitro e morte são usados ​​para validar futuros estudos animais e outros in vivo .

Embora estes métodos desempenhem um papel importante na avaliação da acção de morte, não capturam a resposta fenotípica das células ao tratamento farmacológico. Ao incorporar microscopia eletrônica de varredura (MEV) comD matando estudos cinéticos, uma caracterização mais completa dos efeitos diretos do antibiótico é possível. ^{5 , 6 , 7} Aqui, apresentamos um método em que o SEM é utilizado como um meio para perfilar a eficácia do tratamento antibiótico.

Protocolo

1. Isolamento de C. difficile a partir de diferentes fontes ambientais ou clínicas

1. Isolados ambientais: Utilizando um indicador de algodão pré-esterilizado (ligeiramente molhado com NaCl a 0,85%), limpe a superfície de qualquer área de interesse (chão, porta, pega, prateleira, etc. ). ⁸ Certifique-se de usar luvas estéreis e coloque o cotonete em um tubo esterilizado após concluído.
2. Isolados clínicos (fezes): Placa de 10 a 100 mg de amostras clínicas de fezes em cefoxitina-cicloserina-frutose ágar (CCFA), utilizando um ciclo de inoculação e incubar sob condições anaeróbicas rigorosas durante 48-72 h. Armazenar colônias isoladas de C. difficile estoque em cryovials a -80 ° C para análises adicionais. ^{7 , 9 , 10}
3. Enriqueça as amostras de esfregaços ambientais em infusão de coração cerebral (BHI) com 0,05% de taurocolato de sódio e coloque em câmara anaeróbica a 37 ° CDurante 5 dias. Centrifugar 1 mL da cultura a 10.000 xg e ressuspender o sedimento em 100 mL de etanol.
4. Plantar as células ressuspensas (50 μL) em placas de cicloserinecefoxitina frutose agar (CCFA) e incubar numa câmara anaeróbica a 37 ° C durante 40-48 h. Armazenar colônias isoladas de C. difficile estoque em cryovials a -80 ° C para análises adicionais.
5. Teste as colônias suspeitas de C. difficile usando o reagente de aglutinação de látex ou PCR.

2. Culturing C. difficile e Killing Kinetic Procedures

1. Cultivar estirpes ambientais ou clínicas de C. difficile em placas de agar de sangue numa câmara anaeróbica a 37 ° C durante 48 h.
2. Tomar uma colónia isolada com um ciclo de inoculação, transferi-la para 5 mL de meio BHI num tubo de 15 mL e crescer durante 24 h numa câmara anaeróbica a 37 ° C.
3. Diluir as pré-culturas 1: 100 a aproximadamente 10 ⁶ unidades formadoras de colónias(CFU) / mL em BHIS pré-reduzido fresco (BHI mais 5 g / L de extracto de levedura e 1% de L-cisteína) suplementado com taurocolato de sódio a 0,1% e a concentração apropriada de antibiótico (T0).
4. Recolher uma amostra de 1 mL com uma pipeta em cada ponto de tempo (T0, T6, T24, T48) e espalhar uma pequena alíquota (100 μL em diluições em série) numa placa de agar de sangue. Deixar as células crescerem sobre a placa de agar de sangue durante 48 h numa câmara anaeróbica a 37 ° C e contar o número resultante de colónias para determinar CFU.

3. Preparação de amostras para Microscopia Eletrônica de Varredura

1. Recolher 1 mL de células de cada ponto de tempo em tubos de microcentrífuga e centrifugar a 10.000 xg durante 10 min. Descartar o sobrenadante e lavar as células em PBS.
2. Centrifugar as amostras a 10 000 xg durante 10 min novamente e descartar o sobrenadante. Re-diluir as células em 1 mL de paraformaldeído a 4% e incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
3. Centrifugar novamente as amostras durante 10 min a 10,000 xg e descartar sobrenadante. Lavar as células duas vezes com água destilada e redilutar em 100 μL de água destilada. Ajuste o volume dependendo da turbidez da solução.
   NOTA: Fazer várias diluições em série é uma boa idéia.
4. Rotule os lamínulas e adicione 40 μL da amostra nele. Incubar durante 15 min em uma capa de fluxo para evaporar o líquido e permitir que as células aderem à lamela. Se ainda houver líquido, use um ventilador para remover o líquido.
5. Coloque lamínulas rotuladas com células em uma máquina de pulverização de mesa e fita para baixo. Secure ouro puro na máquina de pulverização. Ligue a máquina e comece a pulverização a baixa pressão (50 mTorr). Revestir as células durante 30 s a 80 mA, o que se traduz em 20 nm de revestimento de ouro.
6. Transferência de células revestidas para o microscópio eletrônico de varredura.

4. Imagens de células C. difficile em um microscópio eletrônico de varredura

1. Ventilar o microscópio eletrônico de varredura (SEM) corretamente por prEssing o botão de ventilação no software do computador.
2. Usando fita de carbono, fixe os lamínulas revestidas para o estágio de metal. Uma vez que o SEM é ventilado, a porta deve abrir facilmente. Bloqueie o estágio de metal na câmara de SEM, aparafusando-o.
3. Clique no botão PUMP no software do computador. O SEM será utilizável quando o sistema lê "Vac OK".
4. Clique no detector SE na guia de detectores. Ligue o feixe clicando no botão que exibe a tensão. Iniciar imagens com uma tensão mais baixa (5 kV) antes de aumentar a tensão (até 15 kV). Uma imagem será exibida após o feixe estar ligado.
5. Usando a função de rastreamento, encontre uma área nos lamínulas revestidos para a imagem. Zoom para a região e encontrar em forma de haste estruturas; Estes são clostridium difficile .
6. Amplie e focalize a imagem para calibrar o sistema. Isto deve ser feito em várias distâncias de trabalho: 15, 9 e 5 mm. Imagem a uma distância de trabalho de 5 mm.
7. Ligue o uLtra modo de imagem de alta resolução e começar a focar e otimizar o astigmatismo.
8. Comece a focar em alta ampliação. Utilize os botões de foco fino e grosseiro para isso. Ajustar o astigmatismo também para obter uma imagem mais clara.
   1. Ajuste o astigmatismo com alta ampliação. Para fazer isso, ajuste as alternâncias de astigmatismo (elas se parecem com as alternâncias de foco fino / grosseiro) e verifique a imagem para obter clareza digitando zoom no software do computador.
9. A função de leitura lenta para coletar uma imagem de alta qualidade. Salve a imagem coletada como um arquivo .TIFF, que será usado para análise. Certifique-se de que a barra de dados esteja selecionada se as medições forem feitas durante a análise.
10. Colecione imagens em diferentes ângulos (até 52 °, girando manualmente o ângulo diretamente no SEM.) As imagens angulares tendem a revelar mais informações de profundidade.
11. Altere a tensão do feixe dependendo das células que estão sendo visualizadas. Manter este principalmente entre 5 - 15 kV para todas as experiências.
12. Após completar a imagem, desligue o feixe e aumente a distância de trabalho para 20 mm. A câmara pode então ser ventilada e a fase pode ser removida. Copie todas as imagens em uma unidade para uma análise mais aprofundada.

5. Processamento e Análise de Imagens

1. Faça o download e instale o software disponível gratuitamente, FIJI (http://fiji.sc), no computador.
2. Abra o arquivo de imagem em FIJI.
3. Usando a função de linha, traçar com precisão a barra de escala.
4. Clique na guia Analisar no programa FIJI e finalmente selecione a função Selecionar Escala. Aparecerá uma janela que exigirá a definição da distância conhecida com base na barra de escala. Altere também a unidade de comprimento e clique em OK.
5. Agora que o programa é calibrado para a distância, use a função de linha para medir o comprimento da célula. Para obter o comprimento, use a função de linha para rastrear a célula na sua totalidade. Selecione a guia Analisar novamente e clique em Medir. O comprimento deve serNas unidades indicadas anteriormente.

Resultados

Clostridium difficile é uma bactéria formadora de esporos e, portanto, é essencial para determinar as diferenças morfológicas entre células vegetativas e esporos antes de qualquer análise funcional. A Figura 1 demonstra imagens representativas de células vegetativas que foram capturadas durante a fase exponencial da curva de crescimento e células de esporos. Conforme ilustrado, as células vegetativas são longas, lisas, em forma de haste estru...

Discussão

O objetivo do presente estudo foi criar um método de alto rendimento para isolar C. difficile e testar a susceptibilidade aos antibióticos usando microscopia eletrônica de varredura (MEV) como meio para uma caracterização mais completa da ação farmacológica do antibiótico. Usando os protocolos aqui delineados, demonstrámos que imaginar a resposta fenotípica da célula ao tratamento com antibióticos pode revelar uma visão da acção farmacológica do fármaco. No total, a porção de imagem deste pr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
cotton gauze	Caring	PRM21408C
NaCl	Macron	7532
50 mL tubes	Falcon	352098
Brain Heart Infusion (BHI)	Criterion	C5141
L-cysteine	Alfa Aesar	A10389
yeast extract	Criterion	C741
sodium taurocholate	Alfa Aesar	A18346
anaerobic chamber	Coy		vinyl anaerobic chamber
cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates	Anaerobe systems	AS-213
blood agar plates	Hardy diagnostics	A-10
latex agglutination reagent	Oxoid	DR1107A	C. diff test kit
microcentrifuge tubes	Eppendorf	222363204
PBS	Gibco	10010-031
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	50-259-98
microscope slides	J. Melvin freed brand	7525M	75 x 25mm
flow hood	Labconco	Class II type A2	biosafety cabinet
desk sputtering machine	Denton Vacuum	Desk II
tape	Plastic Core	05072-AB	SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape
gold	Denton Vacuum	TAR001-0158	2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil
scanning electron microscope	FEI	XL-30