Morfolojik Değişiklikleri Karakterize Eden Bir Protokol<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Antibiyotik Tedavisine Yanıt Vermek

Özet

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Özet

Anaerobik bakterilere yönelik yeni ilaç geliştirme ile antibiyotik eyleminin değerlendirilmesi zor ve teknik olarak zorunludur. Olası MOA'yı anlamak için antibiyotik maruziyeti ile ilişkili morfolojik değişiklikler taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak görüntülenebilir. SEM görüntülemeyi geleneksel öldürme eğrileri ile bütünleştirmek ilaç eylemi konusundaki görüşümüzü geliştirebilir ve ilaç geliştirme sürecini ilerletebilir. Bu önceliği test etmek için, eğrileri öldürün ve SEM çalışmaları, bilinen fakat farklı MOA'lı (vankomisin ve metronidazol) ilaçlarla gerçekleştirildi. C. difficile hücreleri (R20291) 48 saate kadar antibiyotik varlığında veya yokluğunda yetiştirildi. 48 saatlik aralık boyunca, antibiyotik etkinliğini belirlemek ve SEM'de görüntüleme yapmak için hücreler çoklu zaman noktalarında toplandı. Önceki raporlarla uyumlu olarak, vankomisin ve metronidazolün, koloni oluşturan birim (CFU) konseyleri ile ölçülen 24 saatlik tedaviyi takiben önemli miktarda bakterisid aktivitesi vardıting. SEM görüntüleme yöntemini kullanarak, metronidazolün, kontroller ve vankomisin ile karşılaştırıldığında hücre uzunluğu (her bir antibiyotik için hücre uzunluğunda>% 50 azalma; P <0.05) üzerine önemli etkileri olduğunu saptadık. İlaç tedavisine fenotipik tepki daha önce bu şekilde belgelenmemesine karşın, ilacın MOA'sıyla tutarlıdır ve görüntüleme ve ölçümlerin çok yönlülüğü ve güvenilirliği ile bu tekniğin diğer deneysel bileşikler için uygulanmasını göstermektedir.

Giriş

Clostridium difficile , gram pozitif, spor oluşturan bir bakteridir ve ABD'de yılda yaklaşık 500.000 enfeksiyona neden olur ve en yüksek risk seviyesi olan Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) tarafından bir tehdit seviyesi acil patojen olarak değerlendirilir. Son on yılda, C. difficile'ye karşı aktivite gösteren antimikrobiyallerde önemli ilaç geliştirme görüldü . ^{2 , 3} İn vitro çalışmalar ilaç geliştirme sürecinin gerekli bir bileşenidir. Geleneksel olarak, in vitro duyarlılık ve zaman öldürme çalışmaları gelecek hayvan ve diğer in vivo çalışmaların geçerliliğini doğrulamak için kullanılır.

Bu yöntemler öldürme eylemini değerlendirmek için önemli bir rol oynamakla birlikte, hücrelerin farmakolojik tedaviye fenotipik tepki vermezler. Taramalı elektron mikroskopisi (SEM) standart ile birleştirilerekKinetik çalışmaları öldürdüğünde, antibiyotik direkt etkilerinin daha ayrıntılı bir şekilde tanımlanması mümkündür. ^{5 , 6 , 7} Burada, SEM'in antibiyotik tedavisinin etkililiğini gösteren bir araç olarak kullanıldığı bir yöntem sunuyoruz.

Protokol

1. Farklı çevre veya klinik kaynaklardan C. difficile'nin izolasyonu

1. Çevresel izolatlar: Önceden sterilize edilmiş bir pamuk göstergesi (hafifçe 0,85% NaCl ile ıslatılmış) kullanarak herhangi bir alanın yüzeyini (zemin, kapı, kol, raf vb. ) Sürünüz. ⁸ Steril eldiven giydiğinizden ve svabın tamamlandıktan sonra sterilize edilmiş bir tüpe konulduğundan emin olun.
2. Klinik izolatlar (dışkı): Bir aşılama döngüsünü kullanarak 10 ila 100 mg klinik dışkı örnekleri plakositit sikloserin-fruktoz agar (CCFA) üzerine plakaya alın ve 48 - 72 saat katı anaerobik koşullar altında inkübe edin. C. difficile stokunun izole edilmiş kolonilerini daha ileri analizler için -80 ° C'de cryovials'de saklayın. ^{7 , 9 , 10}
3. Beyinde kalp infüzyonu (BHI) sosundaki çevresel swab örneklerini% 0.05 sodyum taurokolat ile zenginleştirin ve 37 ° C'de anaerobik bir bölmeye yerleştirin5 gün boyunca. 10,000 xg'de kültürün 1 mL'sini santrifüjleyin ve pelleti 100 uL etanol içinde tekrar süspansiyon haline getirin.
4. Yeniden süspanse hücreleri (50 mcL) sikloserinecefoxitin fruktoz agar (CCFA) plakaları üzerine plak ve 40 - 48 saat boyunca 37 ° C bir anaerobik odada inkübe edin. C. difficile stokunun izole edilmiş kolonilerini daha ileri analizler için -80 ° C'de cryovials'de saklayın.
5. Şüpheli C. difficile kolonilerini lateks aglutinasyon reaktifi veya PCR kullanarak test edin.

2. C. difficile Kültürü ve Kinetik Prosedürleri Öldürme

1. Saflaştırılmış çevresel veya klinik C. difficile suşlarını kan agar plakalarında, anaerobik bölmede 37 ° C'de 48 saat büyütün.
2. Bir izole edilmiş koloni bir inokülasyon döngüsü ile alın, 15 mL'lik bir tüp içinde 5 mL BHI ortamına aktarın ve 37 ° C'de anaerobik bölmede 24 saat büyür.
3. Kültür öncesi 1: 100'ü yaklaşık 10 ⁶ koloni oluşturan birime inceltin% 0.1 sodyum taurokolat ve uygun antibiyotik konsantrasyonu (T0) ile takviye edilmiş taze ön indirgenmiş BHIS (BHI artı 5 g / L maya ekstraktı ve% 1 L-sistein) içinde s (CFU) / mL.
4. Her zaman noktasında (T0, T6, T24, T48) bir pipetle 1 mL numune toplayın ve bir kan agar plakasına küçük bir alikuot (seri seyreltmelerde 100 uL) yayın. Hücreler, 37 ° C'de anaerobik bir odada 48 saat süreyle kan agar plakasında büyümelerine ve sonuç olarak CFU'yu belirlemek için kolonilerin sayısının saymasına izin verin.

3. Taramalı Elektron Mikroskopisi için Numunelerin Hazırlanması

1. Mikrosantrifüj tüpleri her zaman noktasından 1 ml hücre toplayın ve 10 dakika için 10,000 xg'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve hücreleri PBS'de yıkayın.
2. Örnekleri 10.000 xg'de tekrar 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı atın. 1 mL% 4 paraformaldehid içinde hücreleri tekrar seyreltin ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
3. Numuneleri 1'de 10 dakika santrifüjleyin0,000 xg ve süpernatantı atın. Hücreleri damıtılmış su ile iki kez yıkayın ve 100 uL damıtılmış su içinde yeniden doyurun. Solüsyonun bulanıklığına bağlı olarak hacmi ayarlayın.
   NOT: Birden fazla seri seyreltme yapmak iyi bir fikirdir.
4. Lamelleri etiketleyin ve üzerinde 40 μL örnek ekleyin. Sıvı buharlaştırmak ve hücrelerin lamel bağlı kalmasına izin vermek için bir akış davlumbaz 15 dakika inkübe edin. Sıvı hala mevcutsa, sıvıyı çıkarmak için bir üfleyici kullanın.
5. Etiketli lamelleri hücrelerle birlikte masa üstü püskürtme makinesine yerleştirin ve bandı bantlayın. Püskürtme makinesinde saf altını koruyun. Makineyi açın ve düşük basınçta (50 mTorr) püskürtme işlemine başlayın. 80 mA'de 30 saniye boyunca kaplayın, bu da 20 nm altın kaplamaya dönüşür.
6. Kaplanmış hücreleri taramalı elektron mikroskopuna aktarın.

4. Taramalı Elektron Mikroskopta C. difficile Hücrelerini Görüntüleme

1. Tarama elektron mikroskobunu (SEM) pr tarafından uygun şekilde havalandırınBilgisayar yazılımındaki havalandırma düğmesine basarak.
2. Karbon bant kullanarak, kaplı lamelleri metal sahne üzerine sabitleyin. SEM havalandıktan sonra, kapı kolayca açılmalıdır. Metal etabı SEM odasına vidalayarak kilitleyin.
3. Bilgisayar yazılımındaki PUMP düğmesini tıklayın. Sistem "Vac OK" yazısını okuduğunda SEM kullanılabilir.
4. Dedektörler sekmesinin altındaki SE dedektörünü tıklayın. Voltajı gösteren düğmeyi tıklayarak kirişi açın. Gerilimi arttırmadan önce görüntülemeyi daha düşük bir voltajda (5 kV) başlatın (15 kV'a kadar). Işın açıldıktan sonra bir görüntü belirir.
5. İzleme işlevini kullanarak, görüntü için kaplamalı lamelleri üzerinde bir alan bulun. Bölgeyi büyütüp çubuk şeklinde yapılar bulmak; Bunlar clostridium difficile .
6. Sistemi kalibre etmek için görüntüyü yakınlaştırın ve odaklanın. Bu, çoklu çalışma mesafelerinde yapılmalıdır: 15, 9 ve 5 mm. Çalışma mesafesi 5 mm olan görüntü.
7. Seni açLtra yüksek çözünürlüklü görüntüleme modu ile odaklanır ve astigmatizmayı yoğunlaştırmaya ve optimize etmeye başlar.
8. Yüksek büyütme noktasına odaklanmaya başlayın. Bunun için kaba ve ince odak geçişlerini kullanın. Astigmatizmayı daha net bir görüntü elde etmek için de ayarlayın.
   1. Astigmatizmayı yüksek büyütmede ayarlayın. Bunu yapmak için, astigmatizm geçişlerini ayarlayın (ince / kaba odak geçişlerine benzer) ve bilgisayar yazılımını dijital olarak yakınlaştırarak netlik için görüntüyü kontrol edin.
9. Yüksek kaliteli bir görüntü toplamak için yavaş tarama işlevini seçin. Toplanan görüntüyü, analiz için kullanılacak .TIFF dosyası olarak kaydedin. Analizler sırasında ölçümler yapılacaksa, veri çubuğunun seçili olduğundan emin olun.
10. Farklı açılardaki (52 ° 'ye kadar) görüntüleri direkt olarak SEM üzerinde döndürerek elde edin Açılı görüntüler daha fazla derinlik bilgisi ortaya çıkarmak eğilimindedir.
11. Görüntüleme yapılan hücrelere bağlı olarak ışın voltajını değiştirin. Bunu tüm deneyler için çoğunlukla 5 - 15 kV arasında tutun.
12. Görüntüleme tamamlandıktan sonra ışını kapatın ve çalışma mesafesini 20 mm'ye yükseltin. Daha sonra hazne havalandırılabilir ve sahne çıkarılabilir. Daha fazla analiz için tüm görüntüleri bir sürücüye kopyalayın.

5. Görüntü İşleme ve Analiz

1. Ücretsiz olarak bulunan FIJI (http://fiji.sc) yazılımını bilgisayara indirin ve yükleyin.
2. Resim dosyasını FIJI'da açın.
3. Çizgi işlevini kullanarak, ölçek çubuğunu tam olarak izleyebilirsiniz.
4. FIJI programındaki Analiz sekmesini tıklayın ve nihayet Ölçeği Seç işlevini seçin. Ölçek çubuğuna dayalı bilinen mesafenin ayarlanmasını gerektiren bir pencere belirecektir. Uzunluğu birimi de değiştirin ve Tamam'ı tıklayın.
5. Artık program mesafe için kalibre edildi, hücre uzunluğunu ölçmek için hat fonksiyonunu kullanın. Uzunluğu elde etmek için hücrenin tamamını izlemek için line fonksiyonunu kullanın. Çözümle sekmesini tekrar seçin ve ardından Ölçüm'e tıklayın. Uzunluk uygulaması olmalıdırDaha önce belirtilen birimlerdeki kulak.

Sonuçlar

Clostridium difficile , spor oluşturan bir bakteridir ve bu nedenle herhangi bir fonksiyonel analizden önce vejetatif ve spor hücreleri arasındaki morfoloji farklılıklarını belirlemek esastır. Şekil 1 , büyüme eğrisinin üstel fazında ve spor hücrelerinde yakalanan vejetatif hücrelerin temsili görüntülerini göstermektedir. Resimde görüldüğü gibi vejetatif hücreler uzun, pürüzsüz, çubuk şeklinde yapılarken, sporlar kaba bir dış g...

Tartışmalar

Bu çalışmanın amacı, C. difficile'yi izole etmek için yüksek verimli bir yöntem oluşturmak ve antibiyotik farmakolojik etkisinin daha kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesi için bir araç olarak taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak antibiyotik duyarlılığını test etmektir. Burada özetlenen protokolleri kullanarak, hücrenin antibiyotik tedavisine fenotipik tepki görüntülemenin ilacın farmakolojik etkisine dair bilgiler sağlayabileceğini gösterdik. Toplamda, bu p...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
cotton gauze	Caring	PRM21408C
NaCl	Macron	7532
50 mL tubes	Falcon	352098
Brain Heart Infusion (BHI)	Criterion	C5141
L-cysteine	Alfa Aesar	A10389
yeast extract	Criterion	C741
sodium taurocholate	Alfa Aesar	A18346
anaerobic chamber	Coy		vinyl anaerobic chamber
cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates	Anaerobe systems	AS-213
blood agar plates	Hardy diagnostics	A-10
latex agglutination reagent	Oxoid	DR1107A	C. diff test kit
microcentrifuge tubes	Eppendorf	222363204
PBS	Gibco	10010-031
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	50-259-98
microscope slides	J. Melvin freed brand	7525M	75 x 25mm
flow hood	Labconco	Class II type A2	biosafety cabinet
desk sputtering machine	Denton Vacuum	Desk II
tape	Plastic Core	05072-AB	SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape
gold	Denton Vacuum	TAR001-0158	2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil
scanning electron microscope	FEI	XL-30