Un protocole pour caractériser les changements morphologiques de<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; En réponse au traitement antibiotique

Résumé

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Résumé

L'évaluation de l'action antibiotique avec un nouveau développement de médicament dirigé contre la bactérie anaérobie est difficile et techniquement exigeante. Pour obtenir un aperçu du MOA possible, les changements morphologiques associés à l'exposition aux antibiotiques peuvent être visualisés à l'aide d'une microscopie électronique à balayage (SEM). L'intégration de l'imagerie SEM avec des courbes de destruction traditionnelles peut améliorer notre vision de l'action antidrogue et favoriser le processus de développement de médicaments. Pour tester cette prémisse, les courbes de tuer et les études SEM ont été menées en utilisant des médicaments connus mais différents MOA (vancomycine et métronidazole). Les cellules de C. difficile (R20291) ont été cultivées avec ou sans antibiotiques pendant jusqu'à 48 h. Tout au long de l'intervalle de 48 h, les cellules ont été recueillies à plusieurs moments pour déterminer l'efficacité des antibiotiques et pour l'imagerie sur la SEM. Conformément aux rapports précédents, la vancomycine et le métronidazole ont eu une activité bactéricide significative après 24 heures de traitement, tel que mesuré par un pays de l'unité de colonisation (CFU)Ting. En utilisant l'imagerie SEM, nous avons déterminé que le métronidazole avait des effets significatifs sur la longueur de la cellule (> réduction de 50% de la longueur de la cellule pour chaque antibiotique, P <0,05) par rapport aux témoins et à la vancomycine. Alors que la réponse phénotypique au traitement médicamenteux n'a pas été documentée précédemment de cette manière, elles sont compatibles avec le MOA du médicament démontrant la polyvalence et la fiabilité de l'imagerie et des mesures et l'application de cette technique pour d'autres composés expérimentaux.

Introduction

Clostridium difficile est une bactérie bactérienne positive aux grammes, qui provoque environ 500 000 infections chaque année aux États-Unis et est considéré comme un agent pathogène urgent pour les niveaux de menace par les Centers for Disease Control and Prevention (CDC), le plus haut niveau de risque. ¹ La dernière décennie a connu un développement considérable de médicaments chez les antimicrobiens ayant une activité contre C. difficile . ^{2 , 3} Les études in vitro sont une composante nécessaire du processus de développement de médicaments. ⁴ Traditionnellement, les études de susceptibilité et de mortalité in vitro sont utilisées pour valider les futures études animales et autres études in vivo .

Bien que ces méthodes jouent un rôle important pour évaluer les actions de destruction, elles ne captent pas la réponse phénotypique des cellules au traitement pharmacologique. En incorporant la microscopie électronique à balayage (SEM) avec standarEn cas d'études cinétiques, une caractérisation plus complète des effets directs des antibiotiques est possible. ^{5 , 6 , 7} Ici, nous présentons une méthode où la SEM est utilisée comme moyen de profiler l'efficacité du traitement antibiotique.

Protocole

1. Isoler C. difficile à partir de différentes sources environnementales ou cliniques

1. Isolats environnementaux: À l'aide d'une jauge de coton pré-stérilisée (légèrement mouillée avec NaCl à 0,85%), tamponnez la surface de toute zone d'intérêt (plancher, porte, poignée, étagère, etc. ). ⁸ Assurez-vous de porter des gants stériles et placez l'écouvillon dans un tube stérilisé après avoir terminé.
2. Isolats cliniques (selles): Planter 10 à 100 mg d'échantillons cliniques de selles sur agar de céfoxitine-cyclosérine-fructose (CCFA) en utilisant une boucle d'inoculation et incuber dans des conditions anaérobies strictes pendant 48 à 72 h. Conserver les colonies isolées de C. difficile dans des cryogénies à -80 ° C pour des analyses ultérieures. ^{7 , 9 , 10}
3. Enrichir les échantillons d'écouvillons environnementaux dans le bouillon de perfusion cardiaque (BHI) avec 0,05% de taurocholate de sodium et placer dans une chambre anaérobie à 37 ° Cpendant 5 jours. Centrifuger 1 mL de la culture à 10 000 xg et remettre en suspension le culot dans 100 μl d'éthanol.
4. Placer les cellules remises en suspension (50 μL) sur des plaques d'agarose de cycloserincéfoxitine-fructose (CCFA) et incuber dans une chambre anaérobie à 37 ° C pendant 40 à 48 h. Conserver les colonies isolées de C. difficile dans des cryogénies à -80 ° C pour des analyses ultérieures.
5. Testez les colonies soupçonnées de C. difficile en utilisant le réactif d'agglutination au latex ou la PCR.

2. Cultures de C. difficile et Killing Kinetic Procedures

1. Cultiver des souches environnementales ou cliniques de C. difficile purifiées sur des plaques d'agar de sang dans une chambre anaérobie à 37 ° C pendant 48 h.
2. Prendre une colonie isolée avec une boucle d'inoculation, la transférer dans 5 mL de milieu BHI dans un tube de 15 mL, et faire pousser pendant 24 h dans une chambre anaérobie à 37 ° C.
3. Diluer les pré-cultures 1: 100 à environ 10 ⁶ unités de formation de coloniesS (CFU) / ml dans du nouveau BHIS pré-réduit (BHI plus 5 g / L d'extrait de levure et 1% de L-cystéine) complété par 0,1% de taurocholate de sodium et la concentration appropriée d'antibiotique (T0).
4. Recueillir un échantillon de 1 mL avec une pipette à chaque point de temps (T0, T6, T24, T48) et déposer une petite aliquote (100 μL dans les dilutions en série) sur une plaque d'agar de sang. Laissez les cellules pousser sur la plaque d'agar de sang pendant 48 h dans une chambre anaérobie à 37 ° C et comptez le nombre de colonies qui en résulte pour déterminer l'UFC.

3. Préparation d'échantillons pour la microscopie électronique à balayage

1. Recueillir 1 mL de cellules de chaque point de temps dans des tubes de microcentrifugation et centrifuger à 10 000 xg pendant 10 min. Jeter le surnageant et laver les cellules dans le PBS.
2. Centrifuger les échantillons à 10 000 xg pendant 10 min à nouveau et jeter le surnageant. Ré-diluer les cellules dans 1 mL de paraformaldéhyde à 4% et incuber pendant 1 h à température ambiante.
3. Centrifuger les échantillons à nouveau pendant 10 min à 10,000 xg et jeter le surnageant. Laver les cellules deux fois avec de l'eau distillée et rediluer dans 100 μl d'eau distillée. Régler le volume en fonction de la turbidité de la solution.
   REMARQUE: la réalisation de plusieurs dilutions en série est une bonne idée.
4. Relancez les lamelles et ajoutez 40 μL de l'échantillon. Incuber pendant 15 minutes dans un capot d'écoulement pour évaporer le liquide et permettre aux cellules d'adhérer à la lamelle. Si le liquide est encore présent, utilisez un ventilateur pour enlever le liquide.
5. Placez des lamelles étiquetées avec des cellules dans une machine de pulvérisation de bureau et de ruban adhésif. Assurer l'or pur dans la machine à pulvériser. Mettre la machine sous tension et commencer la pulvérisation à basse pression (50 mTorr). Couvrir les cellules pendant 30 s à 80 mA, ce qui se traduit par 20 nm de revêtement doré.
6. Transférer les cellules revêtues au microscope électronique à balayage.

4. Imagerie des cellules C. difficile sur un microscope électronique à balayage

1. Vent le microscope électronique à balayage (SEM) correctement par prEn utilisant le bouton de ventilation du logiciel.
2. En utilisant du ruban adhésif en carbone, fixez les lamelles couchées sur le plateau métallique. Une fois que le SEM est ventilé, la porte devrait s'ouvrir facilement. Verrouillez la platine métallique dans la chambre SEM en la vissant.
3. Cliquez sur le bouton POMPE du logiciel. Le SEM sera utilisable lorsque le système lit "Vac OK".
4. Cliquez sur le détecteur SE sous l'onglet des détecteurs. Allumez le faisceau en cliquant sur le bouton qui affiche la tension. Démarrez l'imagerie à une tension inférieure (5 kV) avant d'augmenter la tension (jusqu'à 15 kV). Une image apparaît après la mise sous tension du faisceau.
5. En utilisant la fonction de suivi, trouvez une zone sur les lamelles couchées sur l'image. Zoomer dans la région et trouver des structures en forme de tige; Ce sont clostridium difficile .
6. Ajustez et concentrez l'image pour étalonner le système. Cela devrait se faire à plusieurs distances de travail: 15, 9 et 5 mm. Image à une distance de travail de 5 mm.
7. Allume toiLtra haute résolution et commence à se concentrer et à optimiser l'astigmatisme.
8. Commencez à vous concentrer à un haut grossissement. Utilisez les touches grossières et fines pour cela. Ajustez l'astigmatisme aussi bien pour obtenir une image plus claire.
   1. Ajuster l'astigmatisme à un haut grossissement. Pour ce faire, ajustez les bascules d'astigmatisme (elles ressemblent aux bascules de mise au point fine / grossière) et vérifiez l'image pour plus de clarté en zoomant numériquement sur le logiciel.
9. Se la fonction de balayage lent pour collecter une image de haute qualité. Enregistrez l'image collectée en tant que fichier .TIFF, qui sera utilisé pour l'analyse. Assurez-vous que la barre de données est sélectionnée si des mesures seront effectuées lors de l'analyse.
10. Collectez des images à différents angles (jusqu'à 52 ° en tournant manuellement l'angle directement sur le SEM. Les images en angle tendent à révéler des informations plus approfondies.
11. Modifiez la tension du faisceau en fonction des cellules en cours d'image. Conservez ceci principalement entre 5 à 15 kV pour toutes les expériences.
12. Une fois l'image terminée, éteignez le faisceau et augmentez la distance de travail à 20 mm. La chambre peut ensuite être évacuée et la scène peut être retirée. Copiez toutes les images sur un lecteur pour une analyse plus approfondie.

5. Traitement et analyse d'images

1. Téléchargez et installez le logiciel librement disponible, FIJI (http://fiji.sc), sur l'ordinateur.
2. Ouvrez le fichier image dans FIJI.
3. En utilisant la fonction de ligne, tracez précisément la barre d'échelle.
4. Cliquez sur l'onglet Analyser dans le programme FIJI et enfin sélectionnez la fonction Sélectionner l'échelle. Une fenêtre apparaîtra qui nécessitera le réglage de la distance connue en fonction de la barre d'échelle. Modifiez également l'unité de longueur et cliquez sur OK.
5. Maintenant que le programme est calibré pour la distance, utilisez la fonction de ligne pour mesurer la longueur de la cellule. Pour obtenir la longueur, utilisez la fonction de ligne pour retrouver la totalité de la cellule. Sélectionnez l'onglet Analyser à nouveau, puis cliquez sur Mesurer. L'application doit être longueOreille dans les unités indiquées précédemment.

Résultats

Clostridium difficile est une bactérie formant des spores et il est donc essentiel de déterminer les différences de morphologie entre les cellules végétatives et les spores avant toute analyse fonctionnelle. La figure 1 illustre les images représentatives des cellules végétatives qui ont été capturées pendant la phase exponentielle de la courbe de croissance et des cellules de spores. Comme représenté, les cellules végétatives sont longues, lisses...

Discussion

L'objectif de l'étude actuelle était de créer une méthode à haut débit pour isoler C. difficile et tester la sensibilité aux antibiotiques à l'aide d'une microscopie électronique à balayage (SEM) comme moyen pour une caractérisation plus approfondie de l'action pharmacologique de l'antibiotique. En utilisant les protocoles décrits ici, nous avons démontré que l'imagerie de la réponse phénotypique de la cellule au traitement antibiotique peut révéler un aperçu de l&...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
cotton gauze	Caring	PRM21408C
NaCl	Macron	7532
50 mL tubes	Falcon	352098
Brain Heart Infusion (BHI)	Criterion	C5141
L-cysteine	Alfa Aesar	A10389
yeast extract	Criterion	C741
sodium taurocholate	Alfa Aesar	A18346
anaerobic chamber	Coy		vinyl anaerobic chamber
cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates	Anaerobe systems	AS-213
blood agar plates	Hardy diagnostics	A-10
latex agglutination reagent	Oxoid	DR1107A	C. diff test kit
microcentrifuge tubes	Eppendorf	222363204
PBS	Gibco	10010-031
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	50-259-98
microscope slides	J. Melvin freed brand	7525M	75 x 25mm
flow hood	Labconco	Class II type A2	biosafety cabinet
desk sputtering machine	Denton Vacuum	Desk II
tape	Plastic Core	05072-AB	SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape
gold	Denton Vacuum	TAR001-0158	2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil
scanning electron microscope	FEI	XL-30