JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نظهر نهجاً جديداً لاستخدام التصوير المقطعي التماسك الضوئية المجال الطيفي عالية الدقة (الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر) لمساعدة إيصال وكلاء العلاج الجيني في الفضاء سوبريتينال وتقييم تغطية مساحية وتميز حيوية مستقبله.

Abstract

وتستخدم الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر رصد تقدم انحطاط مستقبله في نماذج الماوس حية، وتقييم إيصال العوامل العلاجية في الفضاء سوبريتينال، وتقييم السمية ونجاعة في فيفو. الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر يستخدم القرب من الأشعة تحت الحمراء (800 880 nm) وقد البصريات على وجه التحديد مصممة للبصريات فريدة من نوعها للعين الماوس مع القرار المحوري sub-2-ميكرون. تم تصويرها نماذج الماوس المعدلة وراثيا تنكس الشبكية الخارجي (علم) وضوابط لتقييم تطور المرض. واستخدمت ميكرونيدليس الزجاج سحبت لتقديم حقن الشبكية الفرعية من الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) أو جسيمات نانوية (NP) عن طريق نهج ترانس scleral والعابرة تشورويدال. الموضع الدقيق للابرة في الفضاء سوبريتينال كان مطلوباً قبل حقنه معايرة ضغط، التي يسلم السائل في الفضاء الشبكية الفرعية. وأجريت جراحة سوبريتينال الوقت الحقيقي على الشبكية لدينا نظام (RIS) تصوير. الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر أظهر التدريجي تنكس الشبكية الموحدة بسبب التعبير عن السامة متحولة البشرية متحولة رودوبسين (P347S) (روP347S) التحوير في الفئران. الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر يسمح الكمي الدقيق لجميع طبقات الشبكية. طبقة النووي الخارجي (ONL) سمك ومستقبله قياسات الطول (OSL) الجزء الخارجي ترتبط بحيوية مستقبله، والانحطاط، أو الإنقاذ. يسمح نظام التسليم RIS التصور في الوقت الحقيقي لحقن سوبريتينال في الأطفال حديثي الولادة (~ P10-14) أو الفئران الكبار، والموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر يحدد نجاح التسليم فورا وخرائط مساحية مدى. الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر هو أداة قوية يمكن تقييم نجاح جراحة سوبريتينال في الفئران، وباﻹضافة إلى قياس حيوية photoreceptors فيفو. يمكن استخدام الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر أيضا تحديد الأفواج الحيوان موحدة لتقييم مدى تنكس الشبكية، وسمية والإنقاذ العلاجية في الدراسات البحثية العلاج الجيني السريري.

Introduction

يتم وضع الباحثون العلاج الجيني لمجموعة متنوعة من الأمراض التنكسية الشبكية والشبكية مع الآمال في ترجمة رواية المداواة إلى علاجات للأمراض البشرية1،2،،من34 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11-مجال الوقت أو التصوير المقطعي التماسك الضوئية المجال الطيفي (SD--أكتوبر) وقد استخدمت للتحقيق في الجوانب الخارجي تنكس الشبكية في نماذج محددة الماوس من المرض12،13،14 . الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر، مع ذلك، لم يكن على نطاق واسع تستخدم في سياق تحسين تقييم نماذج الماوس لتحديد معدل والتماثل المكاني من ضمور الشبكية، أو في سياق التقييم السريري للجينات على أساس المداواة، على سبيل المثال، إلى تقييم الإنقاذ أو سمية أو مدى المكانية لناقلات تسليم8،،من1516. مجرد نموذج الفأر يتميز تماما، يمكن أن تكون بيانات الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر مورد موثوق بها ومفيدة لقياس أثر التداوي لممارسة الإنقاذ أو سمية في نماذج الماوس تنكس الشبكية17. تستخدم العديد من مجموعات حقن سوبريتينال كوسيلة لتسليم ناقلات نظراً لكفاءتها في ترانسدوسينج photoreceptors وخلايا ظهارة (RPE) صباغ الشبكية. ومع ذلك، يظل هذا أسلوب صعب على الشريحة الرئيسية، نظراً لأن فإنه يتم عادة عن طريق الجراحة خالية من ناحية من سطح القرنية، وغالباً ما يكون محفوفا باعتام عدسة العين، والنزيف، وانفصال الشبكية غير المقصودة التي تحدث ببساطة عن طريق التلاعب مؤخرة الزجاجي. العديد من المجموعات لا تزال محاولة حقن سوبريتينال عمياء وتسليم هذا الفيروس باستخدام الحقن اليدوي مع القطر كبيرة نسبيا الفولاذ المقاوم للصدأ الإبر (34 ز)8،،من1718،19 20، ،،من2122، واستخدامات قليلة التماسك الضوئية الطبقي (OCT) التصوير لتأكيد التسليم الصحيح لمكافحة ناقلات للشبكية8،17، 20 , 22-وقد وصف بعض التحسينات في الأسلوب مؤخرا استخدام الإبر microscale مدفوعا من ميكرومانيبولاتور22.

نقدم نهج متكامل الذي يساعد في تحديد المواقع من الإبرة، والحقن التي يسرتها منظار ستيريو موجه مخصصة المصممة في المعمل على وجه التحديد لتصور داخل العين صغيرة من الماوس17، 23-استخدام الإبر سحبت الزجاج الصغير بالاشتراك مع ميكرومانيبولاتور ستيريوتاكسيك توفير مراقبة أفضل للموضع إبرة مع لا قطع جراحي أسفل المطلوبة (أي، عن طريق كونجونكتيفاي والنسيج الضام) قبل حقن. ينظم استخدام الضغط حاقن الصغير يساعد على تسليم وحدات التخزين حقن متسقة، ويمكن أن يتم الحقن مع قدر أكبر من الاستقرار، الدقة، وابطا بكثير من الحقن اليدوي يؤديها حقنه باليد، مما يقلل من التواجد لحقن فقاعة في العين. إبرة أصغر يساعد على منع التسرب بعد سحب الإبرة لأن المسار الختم الذاتي. لتقييم مدى حقن/التسليم، تعتمد العديد من المجموعات التحقيقية على إيجاد وتقييم مدى مساحية الفلورية الخضراء تعزيز البروتين (اجفب) التعبير في الشبكية (بناء تعبير ألقاه الناقل) في نهاية التجريبية نقطة (القتل الرحيم) لتأكيد نجاح حقن11،19،،من2024. وهذا النهج (عدم استخدام OCT) للتحقق من نجاح العمليات الجراحية النفايات كمية هائلة من الموارد في وقت الإجراءات الجراحية، والحيوانات، ونظرا لحاجة جميع الحيوانات مع فشل العمليات الجراحية (غير معروف) إلى الإبقاء على اتباعها مع التدابير المتكررة حتى حصاد الموت والعين (عند قياس اجفب). تأكيد موقع الحقن في الشبكية ويمكن تحسين استخدام الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر لإثبات أن الحقن يقع بين الطبقات الصحيحة الشبكية (أي مساحة سوبريتينال). يمكن أيضا استخدام الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر الفور تحديد المحاولات غير الناجحة (فشل العمليات الجراحية) لتحديد المتغيرات ذات الصلة في الوقت الحقيقي الجراحية لتحسين النهج الذي. لقد وجدنا أن الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر يوفر العديد من المزايا في الجينات الإكلينيكية دراسات العلاج عن طريق السماح السريع التقييم الكمي تنكس الشبكية الخارجي، مما يتيح تحديد/إعدام الحيوانات الدراسة التي لا تفي بالمعايير التجريبية ( مثلاً، حقن سوبريتينال غير صحيحة)، وإلى توجيه التصوير المتابعة إلى منطقة العين حيث تم تسليم ناقلات (حيث التأثير السريري الأكثر احتمالاً)، فضلا عن التحكم في المناطق حيث لم يتم تسليم ناقلات. منذ تنميتها، واصلت استخدام SD، تشرين الأول/أكتوبر تكون مقبولة والمستخدمة من قبل الباحثين طب العيون ويعتبر الآن المعيار لتصوير الشبكية في الدراسات العلمية الشبكية في الماوس أو القوارض نماذج13،25. واستخدمت الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر وقدراته البرمجيات بطرق متكاملة فريدة من نوعها تعزيز هدف العلاج الجيني الكمي ناجحة في نماذج الماوس في كل خطوة في هذه العملية، بما في ذلك اختيار نموذج الحيوان، وصف الانحطاط في المختار نماذج الأمراض، وتقديم العلاج، ورسم خرائط تسليم ناقلات الأمراض، وتقييم فعالية سمية/. يسمح استخدام الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر لاكتشاف الأدوية أكثر فعالية في كل مستوى من هذه العملية. هنا يصف لنا هذه النهج التي يتم استخدامها في برنامجنا "اكتشاف المخدرات في الجيش الملكي النيبالي".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

بروتوكولات الحيوان تم استعراضها والموافقة عليها برعاية الحيوان المؤسسية واللجان استخدام HCS WNY خامسا والجامعة في بوفالو-جامعة ولاية نيويورك. واستخدمت الحيوانات وفقا للشروط الواردة في الرابطة للبحث في الرؤية و "طب العيون" (آرفو) وإعلان هلسنكي.

1-الماوس نماذج

  1. تحديد نماذج الماوس ليتم تقييمه بما في ذلك عناصر التحكم.
    ملاحظة: تم إجراء تصوير C57BL/6(J)، mWT hC1/hC1//موت، نموذجا تنكس شبكية ماوس جزئيا أنسنة متماثل ل hC1 الآليلاتP347S روالمسخ البشري على البرية-النوع (WT) الماوس رو+ + الوراثي26 , 27، hC1 x BL/6(J)، نموذج أنسنة جزئيا مع نسخة واحدة من اليل hC1P347S روالمسخ البشري على الماوس WT رو+ + الوراثي (hC1/--//mWT/mWT) (التي تم الحصول عليها عن طريق عبور mWT hC1/hC1//موت مع (C57BL/6 الفئران ي)). أعلاه جسمية مهيمنة التهاب الشبكية الصباغي (أدرب) نماذج على خلفية C57BL/6(J). وكان نموذج الفأر متماثل لنسختين من المورثة WT رو البشرية على خلفية خروج المغلوب رو الماوس أيضا تستخدم28،29. هذا الخط في الخلفية 129Sv. عندما كان يعبر هذا الخط مع دفع رو ماوس على خلفية 129Sv، تحدث جرعة واحدة من البشر رو على الماوس الخلفية رو .
  2. الحفاظ على الحيوانات بعد الشروط ذات الصلة بالتصميم التجريبي.
    ملاحظة: وأبقى الحيوانات في البيطرية الطبية وحدة (فمو) في HCS WNY خامسا. تم تغذية الفئران تشاو المختبر القياسية ونمت ح h:12 12 تحت الضوء: دورات الظلام مع الحمل الفلورسنت لينة بيضاء الأضواء مع حوالي 300 لوكس في ˚F حوالي 72 على مستوى القفص.

2-هلام العين الماوس

  1. تحضير هلام الضوئية المستخدمة ل تصوير الشبكية30 والعمليات الجراحية.
  2. الجمع بين 2 مغ/مل w/v عالية الوزن الجزيئي (4 × 106 غ/مول كاربومير 1 العقيمة x الفوسفات خفف المحلول الملحي (PBS).
  3. خلط في درجة حرارة الغرفة حتى يشكل الهلام هلام لزج شفاف بصريا.
  4. نقل الهلام في زجاجات معقمة صغيرة والطرد المركزي في يتأرجح الطرد مركزي منضدية دلو في ز 350 x لإزالة فقاعات الهواء المحاصرين.
  5. تطبيق الهلام مباشرة على القرنية لإنشاء واجهة بين القرنية الماوس وزجاج تغطية قسط (18 ملم × 18 ملم).

3-الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر تصوير

  1. انظر الجهاز الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر (الشكل 1).
  2. وزن الحيوان لتحديد الجرعة المناسبة من مخدر. ثم تخدير الماوس باستخدام 25 ميليلتر/غرام من وزن الجسم الحل 2.5% للمخزن 2,2,2-تريبروموثيل الكحول (أفيرتين) الحل عن طريق داخل حقن (IP) وإضافة قطرات العين تمدد التلاميذ بعد الحيوان هي معطلة.
  3. التأكد من أن الحيوان هو تماما تخديره برشة أخمص القدمين، وتكون على يقين من الحيوان لا تتفاعل.
  4. تقليم شعيرات وضع الماوس على مزلقة الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر.
  5. ضع العين الماوس مباشرة أمام عدسة غطاء الرأس، والتعامل مع عناصر تحكم المرحلة حتى تقع القرنية والقزحية. تبقى القرنية المائية عن طريق تطبيق الدموع الاصطناعية.
    ملاحظة: ميكرومانيبولاتورس تسوية غرامة على مزلقة الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر تستخدم لتحديد موضع الماوس أن هذه الفتحة التلميذ هو محورها والموجهة. غطاء الرأس الضوئية ثم متقدمة حتى الشبكية تصبح مرئية وكذلك يعدل الحيوان للحصول على أفضل صورة ممكنة.
  6. أولاً، افتح البرنامج "الماوس" ثم انقر فوق "المريض/الامتحان". الثاني، انقر فوق "إضافة المريض" وقم بإدخال المعلومات ذات الصلة لتحديد الحيوان في إطار المريض الجديد "وحفظ والخروج". وثالثاً، انقر فوق "إضافة امتحان" تليها "بدء امتحان". رابعا، انقر فوق "إضافة مخصصة لتفحص" وحدد "حجم مستطيل"، اختر نظام التشغيل أو OD للعين يجري تصويرها، ثم انقر فوق "إضافة الامتحان". وأخيراً، تبدأ هدف الصك والحيوان للحصول على منطقة الفائدة لتحديد المواقع. بعد العثور على المنطقة الصحيحة، وإزالة أي السوائل الزائدة من سطح العين باستخدام القطن معقم يميل قضيب قبل الحصول على الصور من أجل زيادة تعزيز جودة الصورة، ثم انقر فوق "بدء تشغيل لقطة"، وإذا كان يتم الحصول على صورة جيدة، انقر فوق "حفظ المسح الضوئي ".
    ملاحظة: معلمات نموذجية مستطيلة الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر الصور هي 900-المسح/ب-المسح و 90 ب-مسح/الصورة. الصور المكتسبة 1.4 × 1.4 مم. منطقة الشبكية تصويرها تعتمد على التجربة الخاصة، ولكن معظم الصور تتركز على رأس العصب البصري (أنه).

4-تقييم الوجود، ومعدل، وتوحيد نموذج تنكسات الشبكية الخارجي

  1. التقييم النموذجي الخارجي تنكس الشبكية بالموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر
    1. الحصول على الحيوانات مع طائفة واسعة من الإعمار لكل من عنصر التحكم ومواضيع تجريبية لتقييم وجود، ومعدل، وتوحيد تنكس الشبكية الخارجي.
    2. أداء الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر تصوير على الحيوانات متعددة في كل عصر من كل الأفواج (المرض وعادي). استخدم الطريقة الموضحة في 3.1.6 الحصول على الصور OCT.
      ملاحظة: ويمكن جمع البيانات من مجموعة كبيرة من الحيوانات في كل مرة، التي وزعت على أعياد الميلاد التي تغطي فترة زمنية واسعة (سنة واحدة)، أو مجموعة صغيرة من الحيوانات يمكن استخدامها لتجميع صور متعددة على مدى فترة طويلة من الزمن (سنة واحدة) للحصول على نتائج مماثلة.
    3. افتح صورة مستطيلة حجم الموارد بشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر مسجل، وتحدد ب-الفحص الأولى قياس (من الناحية المثالية ستشمل أنه أو أخرى بارزة يمكن تحديدها) من فرقة الصور. تكبير الصورة لملء الشاشة باستخدام ميزة التكبير/التصغير في البرنامج.
    4. فتح العدد المطلوب من الفرجار بالحق النقر على صورة ب-المسح الضوئي وثم النقر فوق "الفرجار" وأخيراً النقر على العديد من الفرجار كما هو مطلوب (هي مرقمة من 1 إلى 10). ضمان أن الفرجار تظهر في الزاوية اليمنى السفلي للصورة. باستخدام ميزة "تكوين قدمه ذات الورنيّة"، تعيين لهم جميعا بوصفنا "عمودي" في زاوية كتلة العمود وقم بتشغيل "عرض قدمه ذات الورنيّة الموقع" تيسير التوظيف موحدة عبر الشبكية، وفي النهاية، انقر فوق تطبيق.
      ملاحظة: الفرجارش 1 ينبغي أن ينصب على الجانب الأيسر من الصورة عند معالجة كوه دكستر (OD) العين اليمنى و 1st قدمه ذات الورنيّة ينبغي أن توضع على الجانب الأيمن للصورة عند معالجة الصور العين اليسرى (OS) الشريرة كوه. يؤدي هذا الآنف التوجه الزماني لكافة البيانات لكلتا العينين اليمنى واليسرى عند التآمر.
    5. استخدام فأرة الكمبيوتر، تتحرك كل قدمه ذات الورنيّة إلى الموقع المطلوب (عدا 2.0 مم) عبر ب-المسح الضوئي، ويجري التأكد من مكان واحد قدمه ذات الورنيّة في وسط الرأس العصب البصري، وفي ب-مسح الصور التي تتضمن أنه (تعيين هذا الفرجار إلى الصفر). ثم استخدم الماوس لانقر واسحب قدمه ذات الورنيّة لطول تمتد إلى منطقة الفائدة. مجموعة تعسفاً الفرجار لا تراكب المناطق القابلة للقياس ب-المسح الضوئي إلى الحد الأقصى للطول، وتجاهل أثناء تحليل البيانات.
    6. قياس سمك ONL باستخدام أدوات قدمه ذات الورنيّة، عن طريق وضع الأعلى من قدمه ذات الورنيّة في الغشاء الحد الخارجي (الدردار) والجزء السفلي من قدمه ذات الورنيّة في الجزء السفلي من الطبقة الخارجية بليكسيفورم (المناضل). كرر ذلك لكل قدمه ذات الورنيّة عبر الشبكية في زيادات 0.2 مم. حفظ القياسات.
    7. بعد أن أدرجت جميع الفرجار وتعديلها للحجم، انقر على الحق في الصورة وانقر فوق "حفظ بيانات قدمه ذات الورنيّة".
    8. تكرار القياسات في اللاحقة ب-مسح (مسح كل 10th يعمل جيدا) من نفس الحجم مستطيلة أكتوبر الصورة التي تغطي كامل الشبكية من أدنى إلى أعلى مناطق. الفرجار ينبغي أن تظل مفتوحة وفي نفس المكان في المحور س. ضبط طول الفرجار دون تحريكها في الاتجاه-س.
    9. فتح حفظ ملفات البيانات بالنقر على أيقونة ملف صغير بجوار المجهزة ب-المسح الصورة، وانقر فوق "الانتقال إلى البيانات". انقر فوق "تاريخ التعديل ترتيب الملفات حسب الترتيب على أساس الوقت حفظ، وفتح جميع الملفات الخاصة ب-تفحص كل قياس.
    10. تجميع البيانات الأولية من كل ب-المسح الضوئي في ملف واحد بالترتيب من أدنى إلى أعلى استناداً إلى عدد الإطار. حدد الأعمدة البيانات بما في ذلك "قدمه ذات الورنيّة اسم"، "طول"، و "مركز" X ".
    11. ضمان أن المركز العاشر هو نفسه بالنسبة لجميع ب-مسح قياس لكل صورة أكتوبر حجم مستطيل معالجتها. حذف أية بيانات من الفرجار التي لم تستخدم لتسجيل القياسات، وتعيين قدمه ذات الورنيّة يقع في مركز رأس العصب البصري إلى الصفر.
    12. رسم البيانات ل X مقابل العديد من مجموعات البيانات Y للحصول على دالة مؤامرة ثلاثية الأبعاد للأرض عموما سمك ONL أو آخر قياس طبقة الشبكية.
    13. مقارنة القياسات ONL بين المراقبة والحيوانات التجريبية مع الإعمار المقابلة لتحديد معدل واتساق أي تنكس الشبكية المحتملة.
    14. كرر العملية لقياسات OSL تستخدم نفس الصور ب-المسح الضوئي. اتبع نفس المنهجية المستخدمة لقياس ONL، باستثناء وضع الفرجار بين العلم وفي Bruch الغشاء (بي أم).
      ملاحظة: مثال لكيفية وضع قدمه ذات الورنيّة يظهر في مقطع النتائج الممثل (الشكل 3ب). ينبغي أن يتم هذا المعني صورة أسرع في خفض الخطأ.
    15. كرر تحليل البيانات للحيوانات متعددة لكل عيد ميلاد لكلا تجريبية ومراقبة الأفواج.
  2. قياس شاملة ورسم خرائط ثلاثية الأبعاد لسمك ONL أو OSL باستخدام أداة الفرجار البرمجيات
    1. استعراض الصور أكتوبر حقن آخر وقم بتدوين أي معالم محددة، مثل أنه أو الأوعية الدموية في الشبكية. ثم ضع الماوس للحصول متابعة التنمية المستدامة-أكتوبر من نفس المنطقة، ومن المؤكد أن تشمل نفس معالم محددة.
      ملاحظة: كفالة التعرف على منطقة الشبكية تصويرها وتشارك في انفصال الشبكية في الصور بعد حقن SD، تشرين الأول/أكتوبر. تسجيل صورة مستطيلة حجم التنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر وحفظه.
    2. معالجة الصور المسجلة كما هو موضح أعلاه في خطوات 4.1.3. إلى 4.1.14. حفظ بيانات قدمه ذات الورنيّة والمؤامرة كما هو موضح أعلاه.
      ملاحظة: يتم استخدام المصفوفة الناتجة من القياسات ONL لإنشاء مؤامرة ثلاثية الأبعاد تصور سمك ONL. موقف الفرجار على طول المحور س تسمح واحد إلى ريبلوت الرسم البياني وضع العصب البصري في الأصل (0) على طول المحور س. المرسومة المحور الصادي استخدام عدد ب-المسح الضوئي والعصب البصري ثم يستخدم لتحديد نقطة البداية، مما يسمح بوضع العصب البصري بشكل صحيح في الأصل على المحور ص. تحديد العصب البصري في كل مجموعة بيانات يتيح متابعة الصور تكون محاذاة موثوق بها.
  3. تعيين نطاق الحقن على الصورة النظارة
    1. أداء وظيفة حقن حجم مستطيل أكتوبر لتأكيد نجاح الحقن. اتبع الطريقة الموضحة في 3.6.
    2. استخدام ميزة قدمه ذات الورنيّة في البرنامج لتحديد نقطة انعطاف في الحدود الشبكية المنفصلة من عدد من ب-مسح تمتد الصورة بأكملها في أكتوبر. استخدام الأسلوب لفتح الفرجار الموصوفة في 4.1.4-
    3. تسجيل الصور النظارة مع موقع معين المسح ب OCT وموضع قدمه ذات الورنيّة المطابق في الصورة النظارة، والذي يماثل في موقعة.
    4. ترجمة جميع الصور النظارة في صورة مركبة، بما في ذلك المواقف التي قدمه ذات الورنيّة، الذي ينتج خريطة دقيقة لموقع الحقن على الصورة النظارة (على سبيل المثال في قسم النتائج الممثل، الرقم 5ألف).

5-حقن العين

ملاحظة: هي تفاصيل حول استخدام RIS مزيد من التفصيل في دراسة الأخيرة23.

  1. إعداد الزجاج الحقن بالإبر
    1. اﻷوتوكﻻف أنابيب شعري مع خيوط في دفعات صغيرة، باستخدام دورة الجافة.
    2. استخدام ماصة ساحبة وإعداد برنامج الذي سوف ينتج تلميح زجاج بزاوية حادة، ويبلغ قطرها في حدود 2-5 ميكرومتر.
      ملاحظة: ويرد برنامج خطوة عينة 5 التي تنتجها الإبر فعالة على ساحبة ماصة لدينا في الجدول 1.
    3. تخزين الإبر سحبت الزجاج في جرة إبرة ماصة معقمة في درجة حرارة الغرفة.
  2. شغل إبرة حقن مع الحل المنشود لحقن
    1. جبل الإبرة في حامل الإبرة، ترك حوالي 5/8 "بارزة بعد نهاية الحامل.
      ملاحظة: بمسافة أقل من 5/8 "سوف تجعل من الصعب الوصول إلى الحل الحقن لشغل الإبرة، لأنه حامل الإبرة لا تنسجم مع سهولة فتح أنابيب 0.2 مل. أيضا، بعد الإبرة تبرز أكثر من 5/8 "النتائج في التذبذب أكبر بشكل ملحوظ أو الحركة البدارية لمعلومات سرية، مما يجعل الوقت الحقيقي التصوير صعبة منذ التلميح يترك المستوى البؤري أو مجال الرؤية (FOV)، أثناء محاولة ثقب العين.
    2. إعداد الحل الحقن في أنبوب معقم 0.2 مل. إضافة 01:10 إضعاف كبريتات فلوريسسين العقيمة (10 ملغ/مل في برنامج تلفزيوني 1 x) في حل الحقن للحصول على تركيز نهائي من فلوريسسين في 1 ملغ/مل.
      ملاحظة: صبغ الدقيق المستخدم الخاصة بالمستخدم ويمكن أن يكون أي شيء غير سامة ومرئية بالعين المجردة تحت إضاءة الضوء الأبيض للمساعدة في تسهيل وضع دقيق من طرف الإبرة على مستوى RPE والفضاء سوبريتينال.
    3. تصور الإبرة من خلال المجهر ستيريو أثناء استخدام مقابض التحكم من ميكرومانيبولاتور 3-المحور لوضع الإبرة بحيث أنها تتماشى مع مركز الأنبوبة التي تحتوي على الحل الحقن التي ستستخدم لشغل الإبرة.
    4. محرك الأقراص بعناية نصيحة إبرة في أنبوب 0.2 مل حتى هي مغمورة غيض الإبرة في السائل. إعداد وحدة التخزين المطلوبة لحقن السوائل (مثل 1 ميليلتر) إلى الإبرة ضرورية لحقنه واحدة. الحفاظ على الحل المتبقي في أنبوب يوضع في الجليد.
  3. إعداد الحيوان لحقن
    ملاحظة:     المجهر RIS يتم الاحتفاظ النظيفة، وهو نظام غير الاتصال. لوحة تدفئة مغطاة بوسادة الإدمصاص نظيفة والإبر يعقم قبل يجري سحبها. بعد أن هي انسحبت من قطاع معدنية ساخنة من تعقيم ذاتي، يتم الاحتفاظ بها في غرفة معقمة مغلقة مصممة لعقد الزجاج سحبت الإبر. تتم معالجة الإبر فقط استخدام الأيدي القفاز، ويستخدم الرعاية لمنع لمس غيض الإبرة بينما تصاعد أنها في الحامل. الحلول حقن تعد باستخدام تقنية تعقيم، ويتم اختبار للتلوث من streaking عينة من الأعمال التحضيرية الفيروسات على لوحات أجار رطل وتفرخ لهم طوال الليل في 37 ˚C.
    1. وزن الحيوان (ز) لتحديد الجرعة المناسبة من مسكن مخدر.
    2. إدارة (2.5% محلول الكحول مخزنة 2,2,2-تريبروموثيل (أفيرتين)) مخدر عن طريق الحقن داخل (IP).
    3. فورا تطبيق حالات المخدرات (علىسبيل المثال، سيكلوبينتيلاتي) لكلتا العينين تمدد التلاميذ.
    4. تقليم شعيرات الحيوان وعدد الحيوانات باستخدام لكمه الإذن أو أي طريقة أخرى.
    5. غسل العين والمنطقة المحيطة بها مع تدين المخفف.
      ملاحظة: تجنب الحصول على أي حل حول الآنف، كما يمكن أن ينتج هذا الغرق غير مقصود.
    6. ضع الماوس على لوحة تدفئة، الإبقاء على 39 ˚C، في طين التماثيل مصبوب مسبقاً للماوس حامل بالعين بالحقن نحو الإبرة.
    7. تأكد من أن الماوس لا يستجيب باستخدام اختبار قرصه القدم هند.
  4. إجراء حقن سوبريتينال
    1. استخدام زوج من الملقط عقيمة قزحية كليلة بلطف حمل بروبتوسيس من أنحاء العالم بوضع نصائح الملقط في 7 و 10:00 ص في المواقف على الجفون بينما يدفع مفتوحة والهبوط في نفس الوقت.
    2. استخدام الملقط لإقناع الجفون تحت العين العالم لإبقائه بعيداً عن مأخذ التوصيل أثناء عملية الحقن.
      ملاحظة: الحيوانات 10 إلى 14 يوما من العمر غالباً ما يعقد العين من مأخذ التوصيل بسهولة أكبر من الحيوانات الأكبر سنا.
    3. المباشر غيض الإبرة حوالي 1-1.5 ملم أسفل حافة ليمبوس القرنية ومحرك بعناية في العين عن طريق الملتحمة حتى يخلق اكتئاب scleral الإبرة تخترق الأنسجة الصلبة العينية، ويسمح للتلاعب بالعين.
    4. قم بتدوير العين إلى الأسفل مع ميكرومانيبولاتور لتصور الاكتئاب سكليرال عن طريق التلميذ المتوسعة مع المجهر ستيريو RIS.
    5. تطبيق قطره 1 × الحل برنامج تلفزيوني، وتغطي مع ساترة عقيمة أو هلام العين العقيمة.
    6. وتركز على الاكتئاب سكليرال التي تم إنشاؤها بواسطة طرف إبرة (2-5 ميكرومتر)، ومحرك الأقراص الإبرة إلى الأمام حتى ذروة حادة من الأشكال الشبكية في موقع الحقن.
    7. قم بتدوير الإبرة باستخدام الحامل حتى التلميح المملون من خلال الصلبة العينية وفلوريسسين بالإبرة مرئياً تحت الشبكية في الجوار المباشر لأحادي الطبقة خلية RPE.
    8. محرك غيض الإبرة حتى أنها عرضية إلى أنحاء العالم، ثم قم بتنشيط مضخة حقن مع رمز التبديل دواسة القدم.
    9. بعد أن تم تسليم وحدة التخزين المطلوبة (0.5-1 ميليلتر) إلى الفضاء سوبريتينال، سحب الإبرة والتحقق إذا بليب مستقرة ولا تسرب هذه السوائل من موقع الحقن، وهو المعيار الأول لحقنه ناجحة.
      ملاحظة: الحفاظ على قطره تلميح الصحيح (2-5 ميكرومتر القطر) أمر حاسم لتجنب التسرب من موقع الحقن.
    10. ضع الحيوان على منصة التصوير الصك OCT. اتبع الإرشادات من أجل أكتوبر HR-SD التصوير لتسجيل صورة مستطيلة وحدة تخزين.
    11. التأكد من أن السائل المحقون يقع في الفضاء سوبريتينال، وحفظ الصور من أجل تحديد مدى بليب.
    12. إزالة الحيوان من الحامل وتطبق كمية وافرة من مرهم مضاد حيوي لعيون حقن.
    13. ضع الحيوان على وسادة تدفئة حتى فإنه يسترد تماما، ثم وضعه مرة أخرى إلى القفص الأصلي من أين جاء.
      ملاحظة: عادة ما يتم حقن الحيوانات لدينا قبل الفطام، وللحيوانات تحتاج إلى أن تعاد إلى القفص مع الأم.
  5. تعيين مدى بليب سوبريتينال استخدام OCT أداة من أدوات البرمجيات.
    1. الحصول على صورة أكتوبر حجم مستطيل، باستخدام الأساليب الموضحة في وقت سابق من بليب ووضعه لتضمين علامة بارزة معترف بها داخل العين مثل أنه.
      ملاحظة: تسجيل 90 ب-المسح يعمل جيدا لرسم الخرائط بليب، ولكن يمكن استخدامها تبعاً للدقة المطلوبة.
    2. إضافة واحد قدمه ذات الورنيّة للرقم ووضعه في نقطة انعطاف حيث يفصل الشبكية من RPE والمشيميه.
      ملاحظة: البرنامج تلقائياً بتعيين نقطة مقابلة لخط على الصورة النظارة يمثلون قدمه ذات الورنيّة وب-المسح الذي يجري تقييمه.
    3. التقاط الشاشة بعد إيداع الفرجار، وتجميع الصور لفعالية تعيين حدود بليب حقن على الصورة النظارة، ودقة الخرائط في موقع الحقن. حفظ الصورة المترجمة للإشارة للمساعدة في تحديد المناطق ذات الأهمية أثناء متابعة التصوير.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، البيانات قدمه ذات الورنيّة يمكن حفظها وامتثلت، ورسمها باستخدام أسلوب مماثل لرسم مجموعات البيانات 3D لسمك ONL.
  6. الحقن بحقن
    1. مكان غيض من استخدام نفس نهج جراحية كحقن الشبكية الفرعية، إلا أن الدافع الإبرة تماما من خلال الصلبة العينية في بلانا بارس حوالي 0.25 مم خلف ليمبوس القرنية والجسم الزجاجي الإبرة.
    2. بعد وضع الإبرة، تطبيق نبض الحقن بدواسة القدم.
      ملاحظة: ويلاحظ انتشار سريع لصبغ فلوريسسين في جميع أنحاء الجسم الزجاجي لفنجان العين، ملء الفتحة التلميذ المتوسعة بالأسفار.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تقييم وجود، ومعدل وتوحيد نموذج تنكس الشبكية الخارجي
وسجلت القياسات ONL من منظمة الشعب المناضل إلى الدردار، تحديد حدود ONL باستخدام أداة قدمه ذات الورنيّة المنصوص عليها في البرنامج أداة. وكان الهدف خريطة تقدم ضمور الشبكية الخارجي في نموذج ماوس أدرب أنسنة جزئيا. ص...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر يوفر طريقة بسيطة لوصف النماذج الحيوانية المحتملة للأمراض البشرية معرفة فائدتها في اختبار العلاجات المحتملة. القدرة على تميز بسرعة وبشكل موثوق نموذج حيوان محتملة للأمراض البشرية أمر حاسم لعملية اكتشاف العقاقير العلاجية (مثلاً، استبدال العل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

العلاقات التجارية: المجلس: لا شيء؛ دائرة الخدمات الطبية المشتركة: لا شيء. الشبكية التصوير النظام (RIS)23 المستخدمة في هذه الدراسة جهاز رواية الاستخدام الكبير لأي جماعة تسعى إلى إجراء دراسات تقديم العلاج بالجينات في الفئران، والقوارض، أو الحيوانات الصغيرة. بينما أصحاب البلاغ أي تعارض إعلان فيما يتعلق بهذا الجهاز في هذا الوقت، حقوقاً في الملكية الفكرية بالجامعة في بوفالو-جامعة ولاية نيويورك وإدارة المحاربين القدماء وقد تسعى إلى تسويق هذا الصك في المستقبل.

Acknowledgements

هذه المواد ويستند إلى العمل المدعوم، في جزء منه، إدارة شؤون قدامى المحاربين (خامسا)، وقدامى المحاربين في الإدارة الصحية، ومكتب البحوث والتنمية (مختبر البحوث الطبية الحيوية والتنمية) (1I01BX000669 منحة الجدارة خامسا). دائرة الخدمات الطبية المشتركة وتستخدم، في جزء منه، كالموظفين الطبيب-عالمة، طب العيون، WNY خامسا؛ وتستخدم المجلس، في جزء منه، WNY خامسا. أجرى في الدراسة، وتدعمها جزئيا، "قدامى المحاربين في الإدارة الغربية نيويورك الرعاية الصحية منظومة" (بوفالو، نيويورك). محتويات لا تمثل وجهات نظر حكومة الولايات المتحدة أو إدارة شؤون قدامى المحاربين. يدعم أيضا، الواقع في الجزء الأكبر، من المعاهد الوطنية للصحة/نيي R01 منح EY013433 (PI: دائرة الخدمات الطبية المشتركة)، منح المعاهد الوطنية للصحة/نيي R24 EY016662 (UB رؤية مركز البنية التحتية, PI: M الذبح، مدير، وحدة بيوفوتونيك: دائرة الخدمات الطبية المشتركة)، "منحة غير مقيد" إلى قسم طب العيون/جامعة في الجاموس من البحوث "منع العمى" (نيويورك، الولايات المتحدة)، ومنحة من مؤسسة أويشي (بوفالو، نيويورك). نعترف بالهدية من الخطP347S hC1 روالمعدلة وراثيا والماوس إكسون 1 رو بالضربة القاضية من الدكتور جانيس ليم (تافتس نيو انغلاند مركز طبي، بوسطن، ماجستير)، وهدية لنموذج التحوير ه المنظمة في حالة متخالف على ماوس إكسون 2 رو خروج المغلوب الخلفية من الدكتور غ. جين فارار وبيتر همفريز (كلية ترينيتي في دبلن، غضب).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL6 (J)Jackson Laboratories664
N129R-N/AN/A
2HRho 1T/1TN/AN/A
Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT)Bioptigen90-R2200-U1-120.  
Retinal Imaging System (RIS)In-houseN/A
Stemi 2000C MicroscopeZeiss000000-1106-133
P-97 Flaming/Brown micropipette pullerSutter Instrument Cop-97
MMN-33 micro manipulator Narishige USAMMN-33
PLI-100  micro injectorHarvard Apparatus64-1736
Micropipette Holder (Rotating)In-houseN/A
Micropipette Storage ReceptacleWorld Precision Instruments Inc.E210
 Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, Harvard Apparatus30-0053
2,2,2-TribromoethanolSIGMA AldrichT48402-25G
Tert-amyl AlcoholSIGMA Aldrich240486-100ML
Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1%Akorn Inc.NDC 17478-215-05
GonioviscBioVision LimitedNDC 17238-610-15
Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP  2%Akorn Inc.NDC 17478-097-10
Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1%PerigoNDC 45802-046-35
Systane UltraAlcon Laboratories, Inc.9006619-1013
Tetracaine HydrochlorideBausch and LombNDC 24208-920-64
Ophthalmic Solution, USP 0.5%Bausch and LombNDC 24208-920-64
DPBSGibco Life Technologies14190-136
Virus PreparationsViGene /UNCN/A
Gold nanorodsNANOPARTzD12M-850-1.75
Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25%Akorn Inc.NDC 17478-250-20
CoverslipsFisher Scientific12-548-A
ForcepsMilton18-825
Needles 30 guageBeckton Dickenson  W11604
SyringesBeckton Dickenson  309659
Bioptigen software PackageBioptigenN/A
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5%Akorn Inc.NDC 17478-263-12
Windows ExcelMicrosoftN/A
Adobe IllustratorAdobe 
ScaleMettler
ScissorsWorld Precision Instruments
Ear punchNat’l band
CL 100 Light sourceWelch AllynCL100
Nitrogen GasJackson Welding SupplyN/A
Heated Water bathNeslabRTE-140
Heating plateIn HouseN/A
Heating matCincinnatti Sub Zero273
Clay mouse holderPlast.i.clay American Art Clay Co.N/A
BetadineMedLine NDC53329-938-06
Cotton Tip ApplicatorsAmerican Health ServiceCtag
EtOH 70%Fisher ScientificBP2818-100
Gloves NitrileVWR89038-272
Diagnosys ERG Color Dome instrumentDiagnosys Inc.D125
Contact lensesIn-houseN/A
Diagnosys SoftwareDiagnosys Inc.N/A
Origin 6.1 softwareOriginLab Corp.N/A
Reference electrodesOcuscienceF-Thread Electrode (DTL) 24”

References

  1. Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
  2. Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations. Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).
  3. Seo, S., et al. Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).
  4. Molday, L. L., et al. RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12. Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).
  5. Pang, J. J., et al. AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).
  6. Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies. Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).
  7. Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).
  8. Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach. J. Vis. Exp. (118), e54808(2016).
  9. Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. Gene therapy for ocular angiogenesis. Clinical Science. 104, 561-575 (2003).
  10. Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy. Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).
  11. Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).
  12. Ruggeri, M., et al. In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).
  13. Berger, A., et al. Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494(2014).
  14. Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images. TVST. 4 (4), 9(2015).
  15. Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).
  16. Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J. Vis. Exp. (69), e4286(2012).
  17. Berger, A., al,, et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoSOne. 9 (5), 96494(2014).
  18. Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).
  19. Sarra, G. M., et al. Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus. Vision Res. 42, 541-549 (2002).
  20. Yan, Q. I., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).
  21. Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030(2015).
  22. Westenskow, P. D., et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247(2015).
  23. Butler, M. C., Sullivan, J. M. A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).
  24. Rolling, F., et al. Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography. Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).
  25. Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology. PLoS One. 9 (10), 111203(2014).
  26. Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).
  27. Brill, E., et al. A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).
  28. Olsson, J. E., et al. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron. 9, 815-830 (1992).
  29. Humphries, M. M., et al. Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene. Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).
  30. Hruby, K. Clinical examination of the vitreous body. Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).
  31. Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).
  32. Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).
  33. Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina. Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).
  34. Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes. Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).
  35. Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Vision Res. 48, 453-469 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

141

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved