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要約

網膜への遺伝子治療薬の配達をお手伝いし、その地域の範囲を評価する視細胞活力を特徴付ける高分解能スペクトル領域光干渉断層法 (HR-SD-OCT) を使用してへの新しいアプローチを示します。

要約

HR-SD-10 月は、ライブ マウス モデルにおける視細胞変性の進行を監視、下腔への治療薬の配達を評価と毒性と効果体内を評価するために活用されています。HR-SD-10 月近赤外光 (800-880 nm) を使用して、具体的には光学系を持ってサブミクロン 2 軸の解像度を持つマウス眼のユニークな光学系のために設計されています。病気の進行を評価するために外側の網膜 (視細胞) 変性およびコントロールのトランスジェニック マウス モデルをイメージしました。引っ張られたガラスのニードルは、強膜とトランス脈絡膜アプローチ アデノ随伴ウイルス (aav ベクター) または経由でナノ粒子 (NP) のサブ網膜注射を提供する使用されました。下腔に針の注意位置決めがサブ網膜領域に液体を提供する校正された圧力注入前に必要でした。私たちの網膜イメージング システム (RIS) リアルタイム網膜手術を行った。HR-SD-10 月実証、有害変異人間変異型ロドプシン (P347S) 式のための進歩的な制服網膜変性マウス (RHOP347S) 遺伝子。HR-SD-10 月では、すべての網膜の層の厳密な定量化をことができます。感光体活力、変性、または救助と相関する核外層 (ONL) 厚さと視細胞外側セグメントの長さ (OSL) 測定。RIS 納品システムにより新生児に、網膜下注射のリアルタイム可視化 (~ P10 14) つまりアダルト マウス、および HR SD-10 月配信の成功を決定する地域範囲をマップし、すぐに。HR-SD-OCT は、光受容体の生体の活力を測定するさらにマウスの網膜の手術の成功を評価する強力なツールです。HR SD OCT は、網膜変性、毒性、および前臨床遺伝子治療研究で治療救助の程度を評価する制服動物コホートを識別するために使用もできます。

概要

人間の病気1,2,3,4の治療法治療薬に翻訳を期待して様々 な網膜と網膜変性疾患に対する遺伝子治療を開発している研究者,5,6,7,8,9,10,11. 時間領域またはスペクトル領域光干渉断層法 (SD-10 月) は、外側の網膜変性疾患12,13,14 の特定のマウス ・ モデルでの側面を調査する使用されています.HR-SD-10 月、しかし、されていない広範囲率と網膜変性の空間的一様性を決定するマウス モデルの評価を最適化するコンテキストで使用や遺伝子の前臨床評価のコンテキスト ベースなどの治療に救助、毒性、またはベクトル配信8,15,16の空間範囲を評価します。マウス モデルは完全に特徴と、一度 10 月 HR-SD データは救助や網膜変性17のマウス ・ モデルにおける毒性を発揮する治療薬の影響を測定する有益で信頼性の高いリソースとして使用できます。多くのグループは、その視細胞と網膜色素上皮 (RPE) 細胞の伝達効率のためベクトル配信の方法として網膜注入を使用しています。しかし、これはマスターに難しい方法のまま角膜表面から無料手の外科によって通常行われますそれは多くの場合白内障、出血、および単に後方の操作によって発生する意図しない網膜剥離に満ちていることを考える硝子体。多くのグループはまだ盲目的に網膜の注射を試みるし、比較的大径ステンレス針 (34 G)8,17,と18,19 手動の注射を使用してウイルスを提供 ,20,21,22、およびいくつかを使用して光干渉断層計 (OCT) 網膜8,17,にベクトルの適切な配信を確認するイメージング20,22。 メソッドにいくつかの改善に最近マイクロマニピュレーター22によって駆動されるマイクロ針を使用して記載されています。

針の位置で支援する統合的なアプローチを提案して注射は、特にマウス17,の小さな眼の中を可視化するラボで設計されたカスタム監督ステレオ検眼鏡によって促進されます。23. 固定装置用マイクロマニピュレーターと共に引っ張られたガラス マイクロ針の使用前に必要な (すなわち、白い部分結膜と結合組織を通じて) ダウンないメスを入れると針の配置のよりよい制御を提供します。インジェクション。圧力の使用規制マイクロ インジェクターにより配信一貫した注入量とはるかに大きい安定性、精度と比べると手持ちの注射器、減らすによって実行される手動の注射で注入を行うことができます、目に気泡注入が発生します。小さい針は、針撤退次のパスはセルフシール漏れを防ぐのに役立ちます。注入/配信の程度を評価するために多くの調査グループで検索と実験の終わりに網膜 (表現の構成要素がベクターで配信) で強化された緑の蛍光蛋白質 (EGFP) 式の面積範囲を評価するのに頼る(安楽死) をポイントすると、成功した注射11,19,20,24を確認します。これは、アプローチは、(10 月を利用していない) (不明) の手術失敗ですべての動物がまで反復的な措置に続いて、維持する必要があるので手術の手続き時間と動物、廃棄物資源の膨大な量の手術の成功を確認するには安楽死と目収穫 (EGFP を測定) する場合。網膜の注入の場所の確認は、注射が網膜 (すなわち下腔) の正しい層の間に位置することを示すに HR SD-10 月を使用して改善できます。HR-SD-10 月は、すぐにアプローチを改良する実際の手術時間で関連する変数を識別する (外科的障害) の不成功な試みを記述する使用できます。我々 が見つかりました、HR SD-10 月臨床遺伝子の多数の利点療法研究によって提供外側の網膜変性症の急速な定量的評価実験条件 (を満たしていない研究動物の同定/殺処分を許可します。例えば、不適切な網膜注入)、ベクトルが配信されなかった地域をコントロールし同様、直接フォロー アップの観察 (臨床効果は最も可能性が高い) をベクトルが配信された目の領域にして。その開発以来 SD 10 月の使用を受け入れ、眼科研究者によって使用される続けています今マウスまたは齧歯動物モデル13,25で網膜の科学的研究で眼底イメージングの標準と考えられています。HR-SD-10 月とそのソフトウェア機能が動物モデルの選択、選択の変性の評価など、プロセスのあらゆる段階でマウス モデルで成功した量的遺伝子療法の目標を促進するためのユニークな統合された方法で活かされて疾患モデル、治療薬デリバリー、ベクトル配信、および毒性/有効性評価のマッピング。HR-SD-10 月より効率的な創薬プロセスのあらゆるレベルでの使用します。ここで私たちの RNA 創薬プログラムで使用されるこれらのアプローチについて述べる.

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プロトコル

動物のプロトコルはレビューされ、機関動物ケアと VA WNY HCS、バッファロー州立大学の使用委員会によって承認されました。動物は、協会の規定による視覚と眼科 (ARVO) ・ ヘルシンキ宣言の研究に使用されました。

1. マウス モデル

  1. マウス コントロールなどの評価モデルを識別します。
    注:C57BL/6(J)、hC1/hC1//mWT のイメージングを行った mWT、部分的にヒト化マウス網膜変性モデル野生型 (WT) の変異・ ローP347S hC1 遺伝子は人間のホモ接合体マウスロー/+/+遺伝子型26,27、hC1 WT マウスRHO変異の人間ローP347S hC1 遺伝子の単一コピーを部分的にヒト化モデル BL/6(J) x+/+遺伝子型 (hC1/-//mWT/mWT) (hC1/hC1//mWT により得た/C57BL/6 (mWTJ) マウス)。常染色体優性網膜色素変性症 (adRP) 上記のモデルは C57BL/6(J) の背景に。マウスRHOノックアウト背景に WT RHO遺伝子の 2 つのコピーのホモ接合体マウス モデルはまた使用される28,29だった。この行は、129Sv の背景には。この行は、129Sv の背景にマウスRHOノックアウトと横切られました、マウスRHO背景に人間RHOの単回投与が発生します。
  2. 動物以下の実験的なデザインに関連する条件を維持します。
    注:動物は、VA WNY HCS で獣医医療ユニット (VMU) で維持されていた。マウスは、標準ラボ チョウと栽培下 12 h:12 h 光を与えられた: ソフト蛍光オーバーヘッドと暗いサイクル ホワイト ライトでは約 72 ˚F ケージ レベルで約 300 ルクス。

2. マウス アイジェル

  1. 網膜イメージング30と手術用光ゲルを準備します。
  2. 結合 2 mg/mL w/v 高分子量 (滅菌 1 リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) x 4 x 106 g/mol カルボマー。
  3. ゲルは粘性光学的に透明なゲルを形成するまで室温でミックスします。
  4. 小さな滅菌ボトルにゲルを転送し、閉じ込められた空気の泡を削除する 350 x g でスイング バケツ卓上遠心遠心分離機します。
  5. マウス角膜とプレミアム カバー グラス (18 mm × 18 mm) 間のインターフェイスを作成する角膜に直接ゲルを適用します。

3. 人事 SD OCT イメージング

  1. 10 月 HR-SD デバイス (図 1) を参照してください。
  2. 麻酔薬の適切な投与量の決定には、動物の重量を量る。25 μ L/g バッファー内 2,2,2 tribromoethyl アルコール (Avertin) ソリューションを介して腹腔内注入 (IP) の 2.5% の解決の体重を使用してマウスを麻酔し、動物を固定化後は、瞳孔を広げる目薬を追加します。
  3. 動物の麻酔完全につま先ピンチを確認し、特定の動物が反応しません。
  4. トリミングひげと人事-SD-10 月そりの上にマウスを置きます。
  5. ♥ レンズの前に直接マウスの目を置き、角膜と虹彩があるまでステージ コントロールを操作します。角膜の人工涙液を適用することによって水分補給をしてください。
    注:HR SD OCT そりで微調整マイクロマニピュレーターは、マウス ポインターを生絞りを中心とした、指向に使用されます。光 ♥ は、網膜が見えるようになり、最高画質の画像を取得する動物をさらに調整して高度な。
  6. まず、ソフトウェア プログラム「マウス」を開き、「患者/試験」をクリックします。第二に、「患者を追加する」をクリックし、新しい患者ウィンドウで動物を識別するために適切な情報を入力し、「保存と終了します」.第三に、「試験開始」に続いて「試験を追加します」をクリックしてします。第四に、「カスタム スキャンを追加"をクリックして「長方形のボリューム」を選択、イメージされている目の OD または OS を選択し、「試験を追加」をクリック。最後に、楽器を目指して、関心領域を取得する動物を配置を開始します。かどうかは、良い画像が得られます、適切な領域を見つけること、画質をさらに強化するために画像の取得の直前にアプリケーターの先端滅菌綿を使用して眼の表面から任意の余分な水分を削除し、「スナップショットを開始」をクリックとクリックして後「保存します。スキャン」。
    注:長方形の HR SD OCT 画像の典型的なパラメーターは、900 a-スキャン/b-スキャンと 90 b-スキャン/画像です。取得した画像は、1.4 × 1.4 mm です。網膜イメージの地域特定の実験によって異なりますが、ほとんどの画像が視神経乳頭 (視神経) を中心としました。

4. プレゼンス、レート、およびモデル外網膜変性の均一性を評価します。

  1. HR SD OCT による外側の網膜変性モデル評価
    1. コントロールと存在、レート、および外側の網膜変性の均一性を評価する実験科目の両方の年齢の広いスペクトルを持つ動物を取得します。
    2. 複数の動物の両方のコホート (病気と正常な) からそれぞれの年代で HR SD OCT イメージングを実行します。3.1.6 で説明されているメソッドを使用して、OCT 画像を得る。
      注:広い期間 (1 年間) にわたる誕生日を配布した、一度にすべての動物の大規模コホートからデータを収集することができます。 または動物の小さなコホートは、長期間 (1 年) と同様の結果を得るために複数の画像を収集するために使用できます。
    3. 記録された 10 月 HR-SD 長方形のボリューム イメージを開き、測定されるべき最初の b スキャンを識別 (理想的には、視神経または他の識別可能なランドマークのいずれか含まれている) 画像のアンサンブルから。ソフトウェアでズーム機能を使用して、画面に合わせて画像を拡大します。
    4. B-スキャンの画像を右クリックして、「ノギス」をクリックと必要に応じてできるだけ多くのキャリパーを最後にクリックするとキャリパーの必要な数を開く (1 10 から番号)。キャリパーはイメージの右下隅に表示されることを確認します。「キャリパーの構成」機能を使用して割り当てる角度ブロック列と網膜を横切る均一配置容易にし最後にクリックして"表示キャリパーの場所"をオンに"垂直"としてすべてが適用されます。
      注:1stキャリパーはオクルス デクスター (OD) 右目を処理するとき、画像の左側に配置必要があります、オクルス不吉な (OS) 左目の画像を処理するとき、イメージの右側にある 1stキャリパーを配置必要があります。印刷するとき、左右の目の両方のすべてのデータの時間的方向に鼻でこの結果します。
    5. 各キャリパーを b-スキャン、b スキャン画像を含めることで、視神経乳頭の中心に 1 つのキャリパーを置きしている間 (2.0 mm 離れて) の目的の場所に移動コンピューターのマウスを使用して (このキャリパーをゼロに設定)。クリックし、関心領域にまたがる長さにキャリパーをドラッグするマウスを使用します。最大長さに b-スキャンの測定可能な領域をオーバーレイし、データ解析時に無視するキャリパーを任意に設定します。
    6. 外部境界膜 (エルム) と (OPL) 外網状層の下部にキャリパー下部にキャリパーのトップを配置することによってキャリパー ツールを使用して ONL 厚さを測定します。0.2 mm 刻みで網膜を横切る各キャリパーのこの手順を繰り返します。測定値を保存します。
    7. すべてキャリパーを配置してサイズを調整した後、イメージを右クリックし、「キャリパー データの保存」をクリックして。
    8. その後 b-スキャン (すべて 10回も作品をスキャン) 同じ長方形ボリューム優れた地域に劣るから網膜全体にまたがる oct 断層像からの測定を繰り返します。キャリパーは、オープンと x 軸の同じ位置に残るべきであります。X 方向に移動せずに、キャリパーの長さを調整します。
    9. 開く保存加工 b-スキャンの横にある小さなファイルのアイコンをクリックしてデータ ファイルのイメージし、「データを行く」をクリック。クリックして"保存すると、時間に基づく順序でファイルを配置し、各 b-スキャン測定のすべてのファイルを開く日付変更。
    10. 最も高いフレーム番号に基づいての順序で単一のファイルに各 b スキャンからの生データをコンパイルします。「キャリパー名」、「長さ」と"センター X"を含むデータの列を選択します。
    11. 中央の X がすべて b スキャン処理各長方形のボリューム 10 月イメージの測定のための同じことを確認します。ノギス測定、記録する使用されていないから任意のデータを削除し、ゼロに視神経乳頭の中央にあるキャリパーを設定します。
    12. ONL の全面的な厚さをプロットする 3 D プロット関数を取得する複数の Y データ セットと X のデータをプロットまたは別は網膜層を測定しました。
    13. ONL 測定制御率、任意の潜在的な網膜変性の均一性を確認して対応する年齢で実験動物とを比較します。
    14. 同じ b スキャン画像を用いた OSL 測定のプロセスを繰り返します。エルムとブルッフ膜 (BM) のキャリパーを置くことを除いて、ONL を測定するために使用同じ方法に従ってください。
      注:代表結果] セクション (図 3B) にキャリパーを配置する方法の例を示します。これは、エラーを減らすために拡大した画像で行ってください。
    15. 各実験のための誕生日とコントロールのコホートに複数の動物のデータ解析を繰り返します。
  2. 包括的な測定とソフトウェアのキャリパー ツールを使用して ONL または OSL の厚さの 3 D マッピング
    1. ポスト噴射 OCT 画像を確認し、視神経や網膜の血管のような任意の個人を特定できるランドマークのメモしておいてください。[マウス ポインターから取得しフォロー アップの SD 10 月同じ地域、同じ明確な目標物を含めるようにしてください。
      注:ポスト噴射 SD OCT 画像のイメージし、網膜剥離に関与する網膜の領域が識別されることを確認します。長方形ボリューム SD OCT 画像を記録し、保存します。
    2. 手順で上記のように記録された画像を処理4.1.3に4.1.14。 。キャリパー データと上記のプロットを保存します。
      注:ONL 測定の結果の配列を使用して、ONL 厚さを描いた 3 D プロットを作成します。X 軸に沿ってキャリパーの位置は replot グラフの x 軸に沿って原点 (0) 視神経を配置すること。B スキャン数を使用して y 軸がプロットし、視神経を使用して、y 軸の原点の視神経を適切に位置決めすることができます開始点を定義します。各データ セットの視神経を識別するフォロー アップ画像を確実に配置することができます。
  3. 眼底画像上に注射部位の範囲をマッピング
    1. ポスト噴射長方形のボリューム 10 月注射の成功を確認するを実行します。記載されている方法に従う3.6 。
    2. B-スキャン OCT 画像を全体にまたがる数から網膜の国境で変曲点を識別するためにソフトウェアでキャリパーの機能を使用します。メソッドを使用して、記載されているキャリパーを開く4.1.4 。
    3. B-スキャン OCT と眼底画像で、その場所に対応する対応するキャリパー位置の割り当て先の場所と眼底画像を記録します。
    4. 眼底画像のすべてに、キャリパーの位置を含む複合のイメージが眼底画像 (図 5A代表 [結果] セクションの例) に注射部位の正確な地図でコンパイルします。

5. 眼内注射

注:RIS の使用の詳細については、最近研究23でさらに詳しく説明します。

  1. ガラス注射器の準備
    1. オートクレーブ キャピラリー チューブ乾燥のサイクルを使用して小さいバッチのフィラメント。
    2. ピペットの引き手とシャープな角度と直径が 2-5 μ m の範囲でガラスの先端を生成するプログラムのセットアップを使用します。
      注:私たちのピペットの引き手に効果的な針を生んだ例 5 ステップ プログラムは表 1に示します。
    3. 部屋の温度で滅菌ピペット針 jar に引っ張られたガラス針を格納します。
  2. 注射剤の目的で注射針を埋める
    1. 針を残して約 5/8"ホルダーの終わりを超えて突出針ホルダーにマウントします。
      注:A の距離 5/8"になること困難に達するより少ない針に合わせて注射液針ホルダーが 0.2 mL チューブの開口部に容易に適合しないため。また、5/8「大きく振動または困難リアルタイム イメージング先端葉フォーカル プレーンまたは視野 (FOV) 目を穿刺しようとするので先端の歳差運動の結果より突出している針を持ちます。
    2. 0.2 mL の滅菌チューブに注射液を準備します。1:10 を追加、最終濃度が 1 mg/ml フルオレセインの注射剤を無菌フルオレセイン硫酸 (1 × PBS で 10 mg/mL) の希薄化。
      注:使用される正確な染料は、ユーザー固有、非毒性と RPE と下腔のレベルで針先の正確な配置を促進するために白色光照明下で肉眼に表示される何かをすることができます。
    3. ステレオの顕微鏡を使って針を充填に使用する注入剤を含む管の中央に整列するので、針の位置に 3 軸マニピュレーターの制御ノブを使用しながら針を視覚化します。
    4. 針の先端が液中に水没するまで慎重に 0.2 mL チューブに針の先端をドライブします。単一の注入に必要な針の中に射出液 (例えば1 μ L) の音量を描画します。氷に差し込んだ管で残りの溶液を維持します。
  3. 注射用動物の準備
    注:     RIS 顕微鏡を清浄に保ち、非接触システム。加熱プレートはきれいな吸着パッドで覆われ、針が引っ張られる前にオートクレーブ。彼らは自己殺菌加熱金属ストリップでプルが後、引っ張られたガラス針を保持するために設計された閉じた滅菌チャンバー内で保持されます。針だけ手袋をはめた手を使用して処理されます、ケアがホルダーにマウントしながら針の先端に触れることを防ぐために使用されます。注入ソリューションは、生殖不能の技術を使用しております、LB 寒天培地プレート上にウイルス製剤のサンプル 37 ° C で一晩インキュベートそれらによって汚染を検査します。
    1. 麻酔鎮痛薬の適切な投与量の決定動物 (g) の重量を量る。
    2. 腹腔内注射麻酔を介して(バッファーに格納された 2,2,2 tribromoethyl アルコール (Avertin) の 2.5% 溶液) (IP) を管理します。
    3. 両方の目の瞳孔に抗コリン薬 (例えばcyclopentylate) をすぐに適用されます。
    4. 耳の穿孔器または他の方法を使用して動物の数し、動物のヒゲを除去します。
    5. 目と希釈 betadine で周辺を洗います。
      注:これは意図しない溺死につながるよう、鼻の周りの任意のソリューションを得ることを避けるため。
    6. 針に向けて注入する目であらかじめ成型モデラーズ粘土マウス ホルダーの 39 ° C で維持加熱パッドの上にマウスを置きます。
    7. マウスが応答を停止、後脚のピンチのテストを使用していることを確認します。
  4. 網膜下注入を行う
    1. そっと開くと下向き同時に 7 位と 10 位を押しながらまぶたに鉗子の先端を配置することによって世界中の眼球突出を誘発するのに滅菌鈍アイリス鉗子のペアを使用します。
    2. インジェクションのプロセス中にソケットからそれを保つために眼球の下まぶたを同軸ケーブルに鉗子を使用します。
      注:動物 10 ~ 14 日古い、しばしば目を保持ソケットからより古い動物より簡単に。
    3. 角膜輪部のエッジの下約 1 〜 1.5 mm の針の先端を直接、結膜を通して目に針、強膜の組織に浸透し、目を操作できるように、それは強膜うつ病を作成するまで慎重にドライブします。
    4. RIS のステレオ顕微鏡による強膜うつ病、瞳孔を通じてを視覚化するマニピュレーターに下方に目を回転させます。
    5. 滅菌アイジェルまたは PBS ソリューションと滅菌 coverslip カバー x 1 滴を適用します。
    6. 針は、注射部位の網膜形態の鋭いピークまで転送針 (2-5 μ m)、およびドライブのヒントによって作成された強うつ病に焦点を当てます。
    7. 先端穴強膜を介して、針のフルオレセインは RPE 細胞膜のすぐ近くで網膜の下に表示まで、ホルダーを使用して針を回転させます。
    8. 地球の接線、針の先端をドライブし、足のペダル ・ スイッチと噴射ポンプをアクティブに。
    9. 必要なボリュームが配信された後 (0.5-1 μ L) 下腔に針を撤回し、水疱が安定し成功した注入の最初の基準は、注射部位からその液体が漏れていないかどうかをご確認ください。
      注:適切な先端径を維持する (2-5 μ m 径) は、注射部位からの漏出を避けるために重要です。
    10. 10 月楽器のイメージング プラットフォームに動物を配置します。HR SD OCT イメージング長方形のボリューム イメージを記録するための指示に従ってください。
    11. 下腔で、水疱の範囲を決定するための画像を保存、注入の流体があることを確認します。
    12. 動物をホルダーから外し、注入された目に抗生物質軟膏の十分な量を適用します。
    13. それは完全に回復し、それがどこから来た元のケージに戻しまで加熱パッドの上に動物を配置します。
      注:私たちの動物は通常離乳前に注入される、したがって、動物は、母親と一緒にケージに返却する必要です。
  5. 10 月計測器ソフトウェア ツールを使用して網膜の水疱の範囲をマッピングします。
    1. 水疱の前述の方法を使用して、長方形のボリューム 10 月画像を得るし、視神経など眼球内で認識可能なランドマークを含むようにそれを配置します。
      注:90 b-スキャンを記録動作します、ブレブをマッピングするが、目的の解像度に応じて使用できます。
    2. 単一キャリパーを図に追加し、網膜が網膜色素上皮や脈絡膜からデタッチ変曲点に配置。
      注:ソフトウェアは自動的にキャリパーと b-スキャンの対象を表す眼底画像上に線に対応するポイントをマップします。
    3. ノギス、配置、次画面をキャプチャし、注射部位を正確にマップする眼底画像上に射出ブレブの境界線を効果的に画像をコンパイルします。フォロー アップ イメージ投射の間の関心領域の特定に役立てるに参考のためコンパイル済みの画像を保存します。
      注:また、キャリパー データは、保存できます、遵守、ONL 厚さのプロットの 3 D データ セットの同じような方法を使用してプロットされます。
  6. ケナコルト硝子体内注入
    1. 針は、 pars プラナ角膜輪部の背後にあると、硝子体に約 0.25 mm で強膜を介して完全に駆動は除いてサブ網膜注入と同様の手術アプローチを使用して針の先端を配置します。
    2. 針位置、足ペダルで噴射パルスを適用します。
      注:蛍光を用いた瞳孔絞りを充填アイカップの硝子を通してフルオレセイン色素の急速な普及が見られます。

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結果

プレゼンス、率およびモデル外網膜変性の均一性の評価
ONL の計測は、計測器のソフトウェアで提供されるキャリパー ツールを使用して ONL の制限の定義、elm OPL から記録されました。目標は、部分的にヒト adRP マウス モデルの外側の網膜変性の進行をマップすることでした。制御 C57BL/6(J) マウスと hC1/hC1//mWT から同等の画像コントロールの眼底所見と?...

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ディスカッション

HR-SD-10 月は、潜在的な治療のテストでその有用性を決定する人間の病気の動物モデルの潜在的な特性のための簡単な方法を提供します。迅速かつ確実に人間の病気の動物モデルすることができる (例えば、代替遺伝子治療、リボザイムや shRNA ノックダウン遺伝子療法、複合遺伝子治療) の治療薬探索プロセスに不可欠です。HR-SD-10 月は、網膜の健康を特徴付けるし、ほぼすべてのマウ?...

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開示事項

商業の関係: MCB: 何もない;JMS: どれも。イメージング システム (RIS)23本研究で使用される網膜は、実質的な使用マウス、齧歯動物、小動物の遺伝子療法配信研究を実施しようとすると、任意のグループへの新規デバイスです。著者には、この時点でこのデバイスに関して宣言する競合がない、SUNY バッファロー - と復員軍人援護局の大学は知的財産権があるし、将来的にこの楽器を実用化することを求めます。

謝辞

この素材は、一部部門のベテラン出来事 (VA)、退役軍人健康庁、室の研究と開発 (生物医学研究および開発) によってサポートされる作業に基づいて (VA メリット助成金 1I01BX000669)。JMS に採用されての一部としてスタッフ医師・科学者、眼科、VA WNY;一部では、VA WNY に MCB を採用します。研究は、行われ、退役軍人管理ウエスタン ニューヨーク医療システム (ニューヨーク州バッファロー) によって一部にはサポートします。内容は、退役軍人局やアメリカ合衆国政府の見解を表していません。サポートも主要な部分は、NIH/ネイ R01 で付与 EY013433 (PI: JMS)、NIH/ネイ R24 付与 EY016662 (UB ビジョン インフラ センター、PI: M 虐殺、ディレクター-バイオフォトニクス モジュール: JMS)、無制限で与えるに部の眼科/大学で防ぐため失明 (ニューヨーク、ニューヨーク) に研究からバッファローと Oishei 財団 (ニューヨーク州バッファロー) からの助成金。我々 博士ジャニス ・ レム (タフツ ニュー イングランド医療センター, ボストン、マサチューセッツ) からローノックアウト、ヘテロ接合の状態で NHR E 遺伝子モデルのギフトには hC1 トランスジェニックローP347Sラインとエクソン 1 マウスのギフトを認める、マウス エクソン 2 RHOノックアウト背景夫妻 G. ジェーン ・ ファラーとピーター ・ ハンフリーズ (トリニティ ・ カレッジ、ダブリン、IRE) から。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL6 (J)Jackson Laboratories664
N129R-N/AN/A
2HRho 1T/1TN/AN/A
Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT)Bioptigen90-R2200-U1-120.  
Retinal Imaging System (RIS)In-houseN/A
Stemi 2000C MicroscopeZeiss000000-1106-133
P-97 Flaming/Brown micropipette pullerSutter Instrument Cop-97
MMN-33 micro manipulator Narishige USAMMN-33
PLI-100  micro injectorHarvard Apparatus64-1736
Micropipette Holder (Rotating)In-houseN/A
Micropipette Storage ReceptacleWorld Precision Instruments Inc.E210
 Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, Harvard Apparatus30-0053
2,2,2-TribromoethanolSIGMA AldrichT48402-25G
Tert-amyl AlcoholSIGMA Aldrich240486-100ML
Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1%Akorn Inc.NDC 17478-215-05
GonioviscBioVision LimitedNDC 17238-610-15
Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP  2%Akorn Inc.NDC 17478-097-10
Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1%PerigoNDC 45802-046-35
Systane UltraAlcon Laboratories, Inc.9006619-1013
Tetracaine HydrochlorideBausch and LombNDC 24208-920-64
Ophthalmic Solution, USP 0.5%Bausch and LombNDC 24208-920-64
DPBSGibco Life Technologies14190-136
Virus PreparationsViGene /UNCN/A
Gold nanorodsNANOPARTzD12M-850-1.75
Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25%Akorn Inc.NDC 17478-250-20
CoverslipsFisher Scientific12-548-A
ForcepsMilton18-825
Needles 30 guageBeckton Dickenson  W11604
SyringesBeckton Dickenson  309659
Bioptigen software PackageBioptigenN/A
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5%Akorn Inc.NDC 17478-263-12
Windows ExcelMicrosoftN/A
Adobe IllustratorAdobe 
ScaleMettler
ScissorsWorld Precision Instruments
Ear punchNat’l band
CL 100 Light sourceWelch AllynCL100
Nitrogen GasJackson Welding SupplyN/A
Heated Water bathNeslabRTE-140
Heating plateIn HouseN/A
Heating matCincinnatti Sub Zero273
Clay mouse holderPlast.i.clay American Art Clay Co.N/A
BetadineMedLine NDC53329-938-06
Cotton Tip ApplicatorsAmerican Health ServiceCtag
EtOH 70%Fisher ScientificBP2818-100
Gloves NitrileVWR89038-272
Diagnosys ERG Color Dome instrumentDiagnosys Inc.D125
Contact lensesIn-houseN/A
Diagnosys SoftwareDiagnosys Inc.N/A
Origin 6.1 softwareOriginLab Corp.N/A
Reference electrodesOcuscienceF-Thread Electrode (DTL) 24”

参考文献

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