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Resumo

Aqui vamos demonstrar uma nova abordagem para usando a tomografia de coerência óptica espectral-domínio de alta resolução (HR-SD-OCT) para auxiliar entrega de agentes de terapia do gene para o espaço subretinal, avaliar sua cobertura areal e caracterizar vitalidade fotoreceptor.

Resumo

HR-SD-OCT é utilizado para monitorar a progressão da degeneração fotorreceptoras em modelos do rato ao vivo, avaliar a entrega de agentes terapêuticos para o espaço subretinal e para avaliar a toxicidade e eficácia na vivo. HR-SD-OCT usa perto de luz infravermelha (800-880 nm) e tem ótica especificamente projetada para a única ótica do olho do rato com resolução axial mícron-sub-2. Modelos de rato transgénico da degeneração retiniana externa (fotorreceptor) e controles foram fotografados para avaliar a progressão da doença. Microagulhas puxado de vidro foram usadas para entregar sub retiniana injeções de vírus adeno-associado (AAV) ou nanopartículas (NP) através de uma abordagem trans-escleral e trans-coroide. Cuidado de posicionamento da agulha no espaço subretinal foi necessário antes uma injeção de pressão calibrado, que proporciona o fluido para o espaço da retina sub. Tempo real de cirurgia subretinal realizou-se na nossa imagem sistema (RIS) da retina. HR-SD-OCT demonstrou progressiva degeneração retinal uniforme devido a expressão de uma tóxica mutante humana mutante rodopsina (P347S) transgene (RHOP347S) em ratos. HR-SD-OCT permite a quantificação rigorosa de todas as camadas da retina. Medidas de comprimento (OSL) espessura e fotorreceptoras do segmento externo camada nuclear externa (ONL) correlacionam-se com vitalidade fotoreceptor, degeneração ou resgate. O sistema de entrega RIS permite a visualização em tempo real de injeções subretinal em neonatal (~ P10-14) ou ratos adultos e HR-SD-OCT imediatamente determina o sucesso de entrega e mapeia a extensão de areal. HR-SD-OCT é uma ferramenta poderosa que pode avaliar o sucesso da cirurgia subretinal em camundongos, além da vitalidade dos FOTORRECEPTORES em vivode medição. HR-SD-OCT também pode ser usado para identificar o uniformes coortes animais para avaliar o grau de degeneração da retina, toxicidade e resgate terapêutico em estudos de pesquisa de terapia de gene pré-clínicos.

Introdução

Os investigadores estão a desenvolver terapias do gene para uma variedade de doenças degenerativas da retina e da retina com esperanças de traduzir novas terapêuticas em tratamentos para doenças humanas1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. no domínio do tempo ou a tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) tem sido usada para investigar os aspectos da degeneração da retina exterior em modelos do rato específico de doença12,13,14 . HR-SD-OCT não, no entanto, foi extensivamente usado no contexto da otimização de avaliação dos modelos de rato para determinar a taxa e a uniformidade espacial da degeneração da retina, ou no contexto da avaliação pré-clínica do gene com base terapêutica, por exemplo, a Avalie a extensão espacial do vetor entrega8,15,16, toxicidade ou resgate. Uma vez que um modelo do rato é caracterizado inteiramente, os dados de HR-SD-OCT podem servir como um recurso informativo e confiável para medir o impacto da terapêutica de exercer o resgate ou toxicidade em modelos do rato de degeneração da retina17. Muitos grupos estão usando injeção subretinal como um método de entrega de vetor devido a sua eficiência no transducing fotorreceptores e células do epitélio (RPE) pigmento da retina. No entanto, esta continua a ser um método difícil de dominar, dado que normalmente é feito por cirurgia mão livre da superfície da córnea e muitas vezes é repleta de catarata, sangramento e não intencionais destacamentos retinal ocorrem simplesmente por manipulação de posterior vítreo. Muitos grupos ainda tentam injeções subretinal cegamente e entregam o vírus usando injeções manuais com diâmetro relativamente grande aço inoxidável agulhas (34G)8,17,18,19 ,20,21,22e alguns usos óptico tomografia de coerência (OCT) para confirmar a entrega adequada de vetor para a retina8,17, de imagem 20 , 22. algumas melhorias no método recentemente têm sido descritas usando agulhas de microescala, impulsionadas por um micromanipulador22.

Apresentamos uma abordagem integrada que auxilia no posicionamento da agulha, e as injeções são facilitadas por um oftalmoscópio estéreo dirigido personalizado projetado no laboratório especificamente para visualização dentro do olho pequeno do rato17, 23. o uso de vidro puxado micro agulhas em conjunto com o micromanipulador estereotáxica fornecem melhor controle de colocação da agulha com nenhum corte cirúrgico para baixo necessária (ou seja, através da conjuntiva e do tecido conjuntivo) antes de injeção. O uso da pressão regulada injector micro ajuda entregar volumes de injeção consistente, e a injeção pode ser feita com muito maior estabilidade, precisão e muito mais lenta do que injeções manuais realizadas por uma seringa à mão, diminuindo assim o ocorrência de injeção de bolha no olho. A agulha menor ajuda a evitar vazamentos após a retirada da agulha, porque o caminho é auto-selante. Para avaliar a extensão da injeção/entrega, muitos grupos de investigação dependem de encontrar e avaliar a extensão de areal da expressão de proteínas (EGFP) fluorescência verde reforçada na retina (construção de expressão entregada pelo vetor) na extremidade experimental ponto (eutanásia) para confirmar o sucesso injeções11,19,20,24. Esta abordagem (não utilizando OCT) para verificar o sucesso cirúrgico desperdiça uma quantidade enorme de recursos em tempo de procedimento cirúrgico e animais, uma vez que todos os animais com falhas cirúrgicas (desconhecidos) precisam ser mantida, seguido com medidas repetitivas até colheita de eutanásia e olho (quando EGFP é medido). Confirmação do local da injeção na retina pode ser melhorada usando HR-SD-OCT para demonstrar que a injeção está localizada entre as camadas corretas da retina (ou seja, o espaço subretinal). HR-SD-OCT também pode ser usado para delinear imediatamente tentativas (falhas cirúrgicas) para identificar as variáveis relevantes em tempo real cirúrgico para aperfeiçoar a abordagem. Nós achamos que HR-SD-OCT fornece inúmeras vantagens no gene pré-clínicos estudos de terapia, permitindo rápida avaliação quantitativa da degeneração da retina exterior, permitindo a identificação/abate de animais de estudo que não cumpram critérios experimentais ( por exemplo, injeção subretinal incorreta) e para direcionar o follow-up de imagem para a região do olho, onde o vetor foi entregue (onde é mais provável efeito pré-clínicos), bem como controlar as regiões onde o vetor não foi entregue. Desde o seu desenvolvimento, o uso de SD-out tem continuado a ser aceito e utilizado pelos pesquisadores de Oftalmologia e agora é considerada o padrão de imagem da retina em estudos científicos da retina no rato ou roedor modelos13,25. HR-SD-OCT e seus recursos de software foram utilizados em maneiras originais de integrada para promover o objetivo da terapia bem sucedida gene quantitativa em modelos do rato em cada etapa do processo, incluindo a seleção de modelo animal, caracterização de degeneração no escolhido modelos de doença, entrega terapêutica, mapeamento de vetor entrega e avaliação de toxicidade/eficácia. O uso de HR SD-out permite a descoberta de medicamentos mais eficiente em todos os níveis do processo. Aqui descrevemos essas abordagens que são usadas em nosso programa de descoberta de drogas de RNA.

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Protocolo

Protocolos de animais foram revistos e aprovados pelo cuidado de Animal institucional e comissões de utilização do VA porque HCS e Universidade de Buffalo-SUNY. Os animais foram utilizados de acordo com as estipulações da Associação para pesquisa em visão e oftalmologia (ARVO) e a declaração de Helsinque.

1. Mouse modelos

  1. Identifica modelos de rato a ser avaliada, incluindo controles.
    Nota: Imagem latente foi realizada por um C57BL/6(J), mWT hC1/hC1 / / / mWT, um modelo de degeneração da retina do rato parcialmente humanizado homozigoto para humano mutante RHOP347S hC1 alelos no selvagem-tipo (WT) rato RHO+ + genótipo26 , 27, hC1 x BL/6(J), um modelo humanizado parcialmente com uma única cópia do humano RHOP347S hC1 alelo mutante do mouse WT RHO+ + genótipo (hC1 /-/ / mWT/mWT) (obtidos pelo cruzamento mWT hC1/hC1 / / / mWT com (C57BL/6 Ratos de J)). O acima autossômica dominante retinite pigmentosa (adRP) modelos são no fundo C57BL/6(J). Um modelo de mouse que é homozigoto para duas cópias do gene humano do mouse fundo de nocaute RHO WT RHO foi também usado28,29. Esta linha é no fundo de 129Sv. Quando essa linha foi cruzada com um nocaute de RHO do mouse sobre o fundo de 129Sv, uma dose única de humano RHO ocorre no mouse RHO fundo.
  2. Manter os animais seguindo as condições pertinentes ao projeto experimental.
    Nota: Os animais foram mantidos em unidade médica veterinária (VMU) em o VA porque HCS. Os ratos foram alimentados com laboratório padrão chow e crescido abaixo dos 12 h:12 h luz: ciclos escuros com sobrecarga fluorescente suave branco luzes com aproximadamente 300 lux ao nível de gaiola em aproximadamente 72 ˚ f.

2. Mouse Eye Gel

  1. Prepare o gel ótico usado para a imagem da retina30 e procedimentos cirúrgicos.
  2. Combinar 2 mg/mL p/v alto peso molecular (4 x 106 g/mol carbomer em estéril 1 x salino de tampão fosfato (PBS).
  3. Misture à temperatura ambiente até que o gel forma um gel viscoso de opticamente transparente.
  4. Transferir o gel em pequenos frascos estéreis e centrifugar em uma centrífuga de mesa balançando balde a x 350 g para remover bolhas de ar aprisionado.
  5. Aplica o gel diretamente a córnea para criar uma interface entre a córnea de rato e um vidro de tampa superior (18 x 18 mm).

3. HR-SD-OCT Imaging

  1. Consulte o dispositivo HR-SD-OCT (Figura 1).
  2. Pese o animal para determinar a dose adequada de anestésico. Em seguida, anestesiar o mouse usando 25 µ l/g de peso corporal de 2,5% solução de tampão 2, 2,2-avertina álcool (Avertin) solução através de injeção intraperitoneal (IP) e adicionar que o colírio para dilatar as pupilas, depois que o animal é imobilizado.
  3. Confirmar que o animal é totalmente anestesiado por uma pitada de dedo do pé e ter a certeza de que o animal não reage.
  4. Aparar os bigodes e posicione o mouse sobre o trenó HR-SD-OCT.
  5. Posicione o olho do rato diretamente na frente da lente de capacete e manipular os controles de fase, até que a córnea e a íris estão localizados. Manter a córnea hidratada através da aplicação de lágrimas artificiais.
    Nota: Os Micromanipuladores ajuste fino no trenó HR-SD-OCT são usados para colocar o mouse de forma a abertura da pupila é centralizada e orientada. O capacete óptico é então avançado até a retina torna-se visível e o animal é mais ajustado para obter a melhor imagem possível.
  6. Primeiro, abra o programa de software "Mouse" e clique em "paciente/exame". Em segundo lugar, clique em "Adicionar o paciente" e insira as informações pertinentes para identificar o animal na janela nova do paciente e "salvar e sair". Em terceiro lugar, clique em "Adicionar exame" seguido por "Iniciar exame". Em quarto lugar, clique em "adicionar verificação personalizada" e selecione "volume retangular", escolher OD ou so para o olho sendo fotografado, clique "Adicionar exame". Finalmente, começa a apontar o instrumento e o posicionamento do animal para obter a região de interesse. Depois de encontrar a região correta, retire qualquer excesso de líquido da superfície do olho usando um algodão estéril, com ponta aplicadora apenas antes da aquisição de imagens a fim de melhorar ainda mais a qualidade de imagem e, em seguida, clique em "start instantâneo", e se é obtida uma boa imagem, clique em "salvar verificação".
    Nota: Parâmetros típicos para imagens de HR-SD-OCT retangulares são 900 a-exames/b-scan e b-exames/imagem 90. Imagens adquiridas são 1,4 x 1,4 mm. A região da retina fotografada depende da experiência específica, mas a maioria das imagens estão centradas sobre a cabeça do nervo ótico (HNO).

4. avaliar a presença, taxa e uniformidade do modelo exterior da retina Espinocerebelares

  1. Avaliação de modelo de degeneração da retina exterior pela HR-SD-outubro
    1. Obter animais com um amplo espectro de idades para o controle e disciplinas experimentais para avaliar a presença, taxa e uniformidade de degeneração da retina exterior.
    2. Execute imagem HR-SD-OCT em vários animais em cada idade de ambas as coortes (doença e normal). Use o método descrito em 3.1.6 para obter as imagens de OCT.
      Nota: Os dados podem ser coletados de uma grande coorte de animais ao mesmo tempo, que tem distribuído aniversários, abrangendo um largo período de tempo (1 ano), ou uma pequena coorte de animal pode ser usada para coletar várias imagens durante um longo período de tempo (1 ano) para obter resultados semelhantes.
    3. Abra uma imagem de volume retangular de HR-SD-OCT gravada e identificar o primeiro b-scan para ser medido (idealmente incluirá o HNO ou outro marco identificável) do conjunto de imagens. Amplie a imagem para preencher a tela usando o recurso de zoom no software.
    4. Clique com o botão direito na imagem do b-scan e em seguida, clicando em "Pinças" e finalmente clique em compassos de calibre como muitos como desejado para abrir o número desejado de pinças (eles são numerados de 1 a 10). Certifique-se de que as pinças aparecem no canto inferior direito da imagem. Usando o recurso de "Configurar Caliper", atribuí-los todos como "vertical" na coluna do bloco de ângulo e ativar o "Display Caliper local" para facilitar a colocação de uniforme através da retina e finalmente, clique em aplicar.
      Nota: 1st maxila deve ser colocada no lado esquerdo da imagem quando o olho direito oculus dexter (OD) de processamento e o 1st maxila deve ser colocado no lado direito da imagem, ao processar as imagens de olho esquerdo oculus sinistras (OS). Isso resulta em uma nasal a orientação temporal de todos os dados para ambos os olhos esquerdos e direito ao plotar.
    5. Usando o mouse do computador, movem cada pinça para o local desejado (afastados de 2,0 mm) o b-scan, certificando-se colocar uma pinça no centro da cabeça do nervo óptico, em b-scan de imagens que incluí-lo (conjunto esta pinça para zero). Em seguida, use o mouse para clicar e arrastar o compasso de calibre de comprimento para abranger a região de interesse. Arbitrariamente definido pinças que não sobreposição de regiões mensuráveis do b-scan de comprimento máximo e ignorar durante a análise de dados.
    6. Medir a espessura ONL usando as ferramentas do compasso de calibre, colocando a parte superior da maxila na membrana limitante externa (ELM) e a inferior da maxila na parte inferior da camada plexiforme externa (OPL). Repita isto para cada pinça através da retina em incrementos de 0,2 mm. Salve as medições.
    7. Depois de todos os compassos foram colocados e ajustados ao tamanho, clique com o botão direito na imagem e clique em "Salvar dados do compasso de calibre".
    8. Repita as medições na b-verificações subsequentes (cada 10th digitalizar obras bem) do mesmo volume retangular imagem OCT da retina inteira de inferior para superiores regiões de abrangência. Compassos de calibre devem permanecer aberta e no mesmo local no eixo x. Ajuste o comprimento dos compassos de calibre sem movê-los na direção X.
    9. Abra o salvar arquivos de dados, clicando no ícone de arquivo pequeno ao lado o b-scan transformado a imagem e clique em "Ir para dados". Clique em "data modificada para organizar os arquivos em ordem com base na hora de salvar e abrir todos os arquivos para cada medida b-scan.
    10. Compile os dados brutos de cada b-scan em um único arquivo em ordem do mais baixo ao mais alto com base no número do quadro. Selecione as colunas de dados, incluindo o "Nome do compasso de calibre", "Comprimento" e "Centro X".
    11. Certifique-se de que o centro de X é o mesmo para todos os b-scans medidos para cada imagem de OCT de volume retangular processada. Excluir todos os dados de pinças que não foram usadas para registrar as medições e defina a maxila localizada no centro da cabeça do nervo óptico para zero.
    12. Plotar os dados para X vs vários conjuntos de dados de Y para obter uma função plot 3D para plotar a espessura total de Oni ou outra medida camada da retina.
    13. Compare as medições ONL entre controle e animais experimentais com idades correspondentes para determinar a taxa e a uniformidade de qualquer potencial degeneração da retina.
    14. Repita o processo para medições OSL, usando as mesmas imagens de b-scan. Siga a mesma metodologia usada para medir o ONL, exceto colocação os compassos de calibre entre a membrana de Bruch e ELM (BM).
      Nota: Um exemplo de como colocar a pinça é mostrado na seção de resultados de representante (Figura 3B). Isso deve ser feito em uma imagem ampliada para diminuir o erro.
    15. Repeti a análise de dados para vários animais para cada aniversário para ambos experimental e coortes de controle.
  2. Medição abrangente e mapeamento 3D da espessura ONL ou OSL usando a ferramenta de compassos de calibre do software
    1. Rever as imagens de OCT de injeção de post e anote qualquer Marcos identificáveis, como o HNO ou vasos sanguíneos na retina. Depois, posicione o mouse para obter um SD-OCT follow-up de uma mesma região e não se esqueça de incluir os mesmos Marcos identificáveis.
      Nota: Certifique-se de que a região da retina fotografado e envolvido no descolamento de retina é identificada no post images injeção SD-OCT. Gravar uma imagem de volume retangular SD-OCT e salvá-lo.
    2. Processar as imagens gravadas, como descrito acima em etapas 4.1.3. para 4.1.14. Salve os dados de maxila e trama conforme descrito acima.
      Nota: A matriz resultante das medições ONL é usada para criar uma trama 3D retratando a espessura ONL. A posição dos compassos de calibre no eixo permitem replot o gráfico colocando o nervo óptico na origem (0) ao longo do eixo x. O eixo y é plotado usando o número de b-scan e o nervo óptico é usado para definir o ponto de partida, o que permite posicionar corretamente o nervo óptico na origem no eixo y. Identificar o nervo óptico em cada conjunto de dados permite acompanhamento imagens a serem alinhados de forma confiável.
  3. Mapeando a extensão do local da injeção para a imagem de fundo
    1. Execute o post injeção volume retangular OCT para confirmar o sucesso da injeção. Siga o método descrito no 3.6.
    2. Use o recurso de pinça no software para identificar o ponto de inflexão na fronteira do descolamento de retina de um número de b-exames abrangendo toda a imagem da OCT. Use o método para abrir os compassos de calibre descritos no 4.1.4.
    3. Grave as imagens de fundo com o local mapeado do OCT b-scan e correspondente posição de pinça na imagem do fundo, o que corresponde a sua localização.
    4. Compile todas as imagens de fundo em uma imagem composta, incluindo as posições do compasso de calibre, que resulta em um mapa preciso do local da injeção para a imagem de fundo (o exemplo na seção de resultados de representante, a Figura 5A).

5. intraocular injeções

Nota: Detalhes sobre utilização do RIS são mais elaborados em um recente estudo23.

  1. Preparando as agulhas de injeção de vidro
    1. Autoclave capilar tubos com filamentos em pequenos lotes, usando o ciclo seco.
    2. Use uma pipeta puller e set-up um programa que irá produzir uma ponta de vidro com o ângulo mais afiado e um diâmetro na faixa de 2 a 5 µm.
      Nota: Um programa de amostra 5 passos que produziu agulhas eficazes em nosso extrator de pipeta é mostrado na tabela 1.
    3. Armazene as agulhas de vidro puxado em uma jarra de agulha de pipeta estéril à temperatura ambiente.
  2. Encha a agulha de injeção com a solução desejada para injeção
    1. Monte a agulha para o suporte da agulha, deixando aproximadamente 5/8" projetando-se além do final do titular.
      Nota: A distância inferior a 5/8" irá torná-lo difícil alcançar a solução de injeção para preencher a agulha, porque o suporte da agulha não se encaixam facilmente a abertura de tubos de 0,2 mL. Além disso, ter a agulha projetam-se mais do que 5/8" resultados em significativamente maior oscilação ou precessão da ponta, dificultando de imagem em tempo real desde a ponta deixa o plano focal ou o campo de visão (FOV), ao tentar furar o olho.
    2. Prepare a solução de injeção em um tubo estéril de 0,2 mL. Adicionar um 01:10 diluição do sulfato de fluoresceína estéril (10 mg/mL de 1X PBS) para a solução de injeção para obter uma concentração final de fluoresceína em 1 mg/mL.
      Nota: O corante exato usado é específico para o usuário e pode ser qualquer coisa que é non-toxic e visível a olho nu, sob iluminação de luz branca para ajudar a facilitar a colocação precisa da ponta da agulha no nível da RPE e espaço subretinal.
    3. Visualize a agulha através do microscópio estéreo enquanto estiver usando os botões de controle do micromanipulador de 3 eixos para posicionar a agulha para que ele esteja alinhado com o centro do tubo contendo a solução de injeção para ser usado para preencher a agulha.
    4. Cuidadosamente, dirija a ponta da agulha no tubo de 0,2 mL até que a ponta da agulha está submersa no fluido. Elaborar o volume desejado de injeção líquido (por exemplo, 1 µ l) para a necessário para uma única injeção de agulha. Manter o restante da solução no tubo colocado no gelo.
  3. Preparando o animal para a injeção
    Nota:     o microscópio RIS é mantido limpo e é um sistema de não-contato. A placa de aquecimento é coberta com uma almofada de limpeza adsorvente e agulhas são esterilizados em autoclave antes de ser puxado. Depois que eles são puxados por uma tira de metal aquecida auto esterilizante, são mantidos em uma câmara fechada esterilizada projetada para armazenar agulhas de vidro puxado. As agulhas são manipuladas apenas usando as mãos enluvadas e cuidados é usado para evitar tocar a ponta da agulha ao montá-lo no suporte. As soluções injetáveis são preparadas utilizando uma técnica estéril e são testadas para a contaminação por estrias uma amostra de preparações de vírus em placas de ágar LB e incubando-os durante a noite em 37 ˚ c.
    1. Pese o animal (g) para determinar a dose adequada de analgésico anestésico.
    2. Administre o anestésico (solução de 2,5% de álcool no buffer 2, 2,2-avertina (Avertin)) através de injeção intraperitoneal (IP).
    3. Imediatamente aplica medicamentos anticolinérgicos (por exemplo, cyclopentylate) para ambos os olhos para dilatar as pupilas.
    4. Aparar os bigodes do animal e número do animal usando soco de orelha ou outro método.
    5. Lave o olho e a área circundante com betadine diluído.
      Nota: Evite qualquer solução em torno do nariz, pois isso pode resultar em afogamento acidental.
    6. Coloque o mouse sobre a almofada de aquecimento, mantida em 39 ˚ c, no suporte de rato argila do modelador pre-moldado com o olho deve ser injetado em direção a agulha.
    7. Certifique-se que o mouse está respondendo usando um teste do beliscão no pé traseiro.
  4. Realizando a injeção subretinal
    1. Use um par de pinças estéreis íris contundente para induzir suavemente proptose do globo, colocando as pontas da pinça no 7 e 10:00 posições sobre as pálpebras enquanto empurra aberto e para baixo ao mesmo tempo.
    2. Use a pinça para persuadir as pálpebras sob o globo do olho para mantê-lo da tomada durante o processo de injeção.
      Nota: Animais de 10 a 14 dias de idade, frequentemente, realizará o olho da tomada mais facilmente do que animais mais velhos.
    3. Direcionar a ponta da agulha cerca de 1-1.5 mm abaixo da borda do limbo corneal e conduzi-lo cuidadosamente para dentro do olho através da conjuntiva até que cria uma depressão escleral como a agulha penetra no tecido da esclera e permite a manipulação do olho.
    4. Gire o olho para baixo com o micromanipulador Visualizar a depressão escleral através da pupila dilatada com o microscópio estereofónico do RIS.
    5. Aplique uma gota de gel do olho estéril ou 1 x solução de PBS e cobrir com uma lamela estéril.
    6. Focar a depressão escleral criada pela ponta da agulha (2-5 µm) e dirigir a agulha para a frente até um pico afiado das formas retina no local da injeção.
    7. Gire a agulha usando o titular até a ponta entedia através da esclera e da fluoresceína na agulha é visível sob a retina na vizinhança imediata de monocamadas de células o RPE.
    8. Dirija a ponta da agulha é tangencial ao Globo e em seguida, ativar a bomba de injeção com o interruptor de pedal do pé.
    9. Após entrega o volume desejado (0,5-1 µ l) para o espaço subretinal, retirar a agulha e verifique se a bolha é estável e esse fluido não vaza fora do local da injeção, que é o primeiro critério de uma injeção de sucesso.
      Nota: Mantendo um diâmetro de ponta adequada (2-5 µm de diâmetro) é fundamental para evitar a fuga do local da injeção.
    10. Coloca o animal sobre a plataforma de imagem do instrumento OCT. Siga as instruções para HR-SD OCT Imaging para gravar uma imagem de volume retangular.
    11. Confirme se o fluido injetado é localizado no espaço subretinal e salvar as imagens para determinar a extensão da bolha.
    12. Retire o animal do porta e aplicar uma ampla quantidade de pomada antibiótica para os olhos injetados.
    13. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento até se recupera completamente, então colocá-lo de volta para a gaiola original de onde veio.
      Nota: Nossos animais são geralmente injetados antes do desmame, portanto os animais precisam ser devolvidos a gaiola com a mãe.
  5. Mapeamento da extensão da bolha subretinal usando ferramentas de software de instrumento OCT.
    1. Obter uma imagem de OCT de volume retangular, usando métodos descritos anteriormente, da bolha e posicioná-lo para incluir um marco reconhecível dentro do olho, tais como o HNO.
      Nota: 90 b-exames de gravação funciona bem para mapear a bolha, mas poderia ser usada dependendo da resolução desejada.
    2. Adicionar um compasso único para a figura e coloque-o no ponto de inflexão onde a retina separa o RPE e coroide.
      Nota: O software automaticamente mapeia um ponto correspondente a uma linha para a imagem de fundo que representam o compasso e o b-scan sendo avaliada.
    3. Capturar a tela após a colocação dos compassos de calibre e compilar as imagens para mapear efetivamente a fronteira da bolha de injeção para a imagem de fundo, que precisamente mapeia o local da injeção. Salve a imagem compilada para referência ajudar na localização das regiões de interesse durante a imagem latente de acompanhamento.
      Nota: Como alternativa, os dados da maxila podem ser salvos, respeitado e plotagem usando um método semelhante para conjuntos de dados 3D plotagem de espessura ONL.
  6. Injeção intravitreal
    1. Coloque a ponta da agulha usando uma abordagem cirúrgica semelhante como injeção da retina sub, exceto que a agulha é dirigida inteiramente através da esclera na pars plana cerca de 0,25 mm para trás ao limbo da córnea e para o vítreo.
    2. Após a colocação da agulha, aplica o pulso de injeção com o pedal.
      Nota: Observa-se uma rápida difusão do corante fluoresceína em todo o vítreo da viseira, encher a abertura pupila dilatada com fluorescência.

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Resultados

Avaliar a presença, a taxa e a uniformidade da degeneração da retina exterior do modelo
Medições de Oni foram gravadas desde o OPL para o ELM, definindo os limites da Oni usando a ferramenta paquímetro fornecida no software do instrumento. O objetivo era mapear a progressão da degeneração da retina exterior em um modelo do rato de adRP parcialmente humanizado. Imagens comparáveis de um rato C57BL/6(J) de controle e um mWT hC1/hC1 / / / modelo de mouse mWT, ex...

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Discussão

HR-SD-OCT fornece um método simples para a caracterização de potenciais modelos animais de doença humana para determinar sua utilidade na terapêutica potencial de teste. A capacidade de rapidamente e confiantemente caracterizam um potencial modelo animal de doença humana é fundamental para o processo de descoberta de drogas terapêuticas (por exemplo, terapia de substituição genética, terapia de gene "knockdown" ribozima ou shRNA, terapia genética combinada). HR-SD-OCT fornece um método simples, ráp...

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Divulgações

Relações comerciais: MCB: nenhum; JMS: nenhum. A imagem do sistema (RIS)23 utilizado neste estudo da retina é um dispositivo inovador de uso substancial a qualquer grupo buscando a realização de estudos de entrega de terapia de gene em ratos, roedores ou pequenos animais. Embora os autores não tenham nenhum conflito para declarar com relação a este dispositivo, neste momento, da Universidade de Buffalo - SUNY e a administração de veteranos têm direitos de propriedade intelectual e pode tentar comercializar este instrumento no futuro.

Agradecimentos

Este material é baseado em trabalho suportado, em parte, pelo departamento de assuntos de veteranos (VA), Veterans Health Administration, escritório de pesquisa e desenvolvimento (biomédica de laboratório de pesquisa e desenvolvimento) (VA mérito Grant 1I01BX000669). JMS é empregado, em parte, como pessoal médico-cientista, Oftalmologia, por VA porque; MCB é empregado, em parte, pela VA porque. O estudo foi realizado em e apoiado em parte, os veteranos administração Western New York Healthcare System (Buffalo, NY). Conteúdo não representam a opinião do departamento de assuntos de veteranos ou o governo dos Estados Unidos. Também apoiou, em grande parte, pelo NIH/NEI R01 conceder EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 conceder EY016662 (centro de infraestrutura de visão de UB, PI: M abate, diretor - Biophotonics módulo: JMS), uma concessão irrestrita para a departamento de Oftalmologia/Universidade Búfalo de investigação para evitar cegueira (Nova Iorque, NY) e uma bolsa da Fundação Oishei (Buffalo, NY). Reconhecemos o dom da linha deP347S de hC1 transgénica RHOe o mouse do exon 1 RHO nocaute do Dr. Janis Lem (centro médico de Tufts Nova Inglaterra, Boston, MA) e o dom do modelo no estado heterozigoto transgene NHR-E sobre o rato exon 2 RHO nocaute segundo plano de DRS G. Jane Farrar e Peter Humphries (Trinity College, Dublin, IRE).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL6 (J)Jackson Laboratories664
N129R-N/AN/A
2HRho 1T/1TN/AN/A
Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT)Bioptigen90-R2200-U1-120.  
Retinal Imaging System (RIS)In-houseN/A
Stemi 2000C MicroscopeZeiss000000-1106-133
P-97 Flaming/Brown micropipette pullerSutter Instrument Cop-97
MMN-33 micro manipulator Narishige USAMMN-33
PLI-100  micro injectorHarvard Apparatus64-1736
Micropipette Holder (Rotating)In-houseN/A
Micropipette Storage ReceptacleWorld Precision Instruments Inc.E210
 Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, Harvard Apparatus30-0053
2,2,2-TribromoethanolSIGMA AldrichT48402-25G
Tert-amyl AlcoholSIGMA Aldrich240486-100ML
Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1%Akorn Inc.NDC 17478-215-05
GonioviscBioVision LimitedNDC 17238-610-15
Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP  2%Akorn Inc.NDC 17478-097-10
Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1%PerigoNDC 45802-046-35
Systane UltraAlcon Laboratories, Inc.9006619-1013
Tetracaine HydrochlorideBausch and LombNDC 24208-920-64
Ophthalmic Solution, USP 0.5%Bausch and LombNDC 24208-920-64
DPBSGibco Life Technologies14190-136
Virus PreparationsViGene /UNCN/A
Gold nanorodsNANOPARTzD12M-850-1.75
Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25%Akorn Inc.NDC 17478-250-20
CoverslipsFisher Scientific12-548-A
ForcepsMilton18-825
Needles 30 guageBeckton Dickenson  W11604
SyringesBeckton Dickenson  309659
Bioptigen software PackageBioptigenN/A
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5%Akorn Inc.NDC 17478-263-12
Windows ExcelMicrosoftN/A
Adobe IllustratorAdobe 
ScaleMettler
ScissorsWorld Precision Instruments
Ear punchNat’l band
CL 100 Light sourceWelch AllynCL100
Nitrogen GasJackson Welding SupplyN/A
Heated Water bathNeslabRTE-140
Heating plateIn HouseN/A
Heating matCincinnatti Sub Zero273
Clay mouse holderPlast.i.clay American Art Clay Co.N/A
BetadineMedLine NDC53329-938-06
Cotton Tip ApplicatorsAmerican Health ServiceCtag
EtOH 70%Fisher ScientificBP2818-100
Gloves NitrileVWR89038-272
Diagnosys ERG Color Dome instrumentDiagnosys Inc.D125
Contact lensesIn-houseN/A
Diagnosys SoftwareDiagnosys Inc.N/A
Origin 6.1 softwareOriginLab Corp.N/A
Reference electrodesOcuscienceF-Thread Electrode (DTL) 24”

Referências

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