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摘要

在这里, 我们展示了一种新的方法, 使用高分辨率光谱域光学相干断层扫描 (hr-sd-oct), 以协助将基因治疗剂传递到视网膜下空间, 评估其区域覆盖, 并表征光感受器的活力。

摘要

hr-sd-oct 用于监测活小鼠模型中光感受器变性的进展, 评估治疗药物在视网膜下空间的传递, 并评估体内的毒性和有效性。hr-sd-oct 使用近红外光 (800-880 nm), 并具有专为鼠标眼睛独特光学器件设计的光学器件, 其轴向分辨率低于2微米。对转基因小鼠外视网膜 (光感受器) 变性和对照进行了成像, 以评估疾病进展情况。采用带状玻璃微针, 通过反层和反式脉络膜法,对腺病毒 (aav) 或纳米颗粒 (np) 进行视网膜下注射。在校准压力注射之前, 需要将针头仔细定位到视网膜下空间, 然后将液体输送到视网膜下空间。在视网膜成像系统 (ris) 上进行了实时视网膜下手术。hr-sd-oct 表现出由于毒性突变体人视紫红质 (p347s) (rhop347s) 转基因表达而逐渐变性视网膜变性。hr-sd-oct 允许对所有视网膜层进行严格的定量。外核层 (onl) 厚度和光感受器外段长度 (osl) 测量与光感受器的活力、退化或抢救相关。ris 分娩系统可实时显示新生儿 (~ p10-14) 或成年小鼠的视网膜下注射, hr-sd-oct 立即确定分娩的成功程度和地图面积。hr-sd-oct 是一个强大的工具, 可以评估小鼠视网膜下手术的成功, 以及测量光感受器在体内的活力。hr-sd-oct 还可用于识别统一的动物队列, 以评估视网膜退化的程度、毒性和治疗性抢救在临床前基因治疗研究中的应用。

引言

研究人员正在开发各种视网膜和视网膜退行性疾病的基因疗法, 希望将新的疗法转化为人类疾病的治疗方法1,2,3,4,5,6,7.,8,9,10,11. 时域或光谱域光学相干断层扫描 (sd-oct) 已被用来研究疾病 12、13、14的特定小鼠模型中视网膜外变性的各个方面.然而, hr-sd-oct 并没有被广泛用于优化小鼠模型的评价, 以确定视网膜变性的速度和空间一致性, 或者在基于基因的疗法的临床前评估中, 例如:评估救援、毒性或病媒传递的空间范围8、15、16。一旦小鼠模型被充分描述, hr-sd-oct 数据可以作为一个信息丰富和可靠的资源, 以衡量治疗方法的影响, 发挥救援或毒性的小鼠模型视网膜变性 17。许多群体使用视网膜下注射作为载体传递的方法, 因为它在转染光感受器和视网膜色素上皮 (rpe) 细胞的效率。然而, 这仍然是一个很难掌握的方法, 因为它通常是通过从角膜表面的自由手手术, 往往充满白内障, 出血, 和意外视网膜脱离发生仅仅是通过操纵后部玻璃体。许多群体仍然试图盲目地注射视网膜下注射, 并使用人工注射相对较大直径的不锈钢针头 (34g)8,17,18,19 提供病毒 20,21, 22,和一些使用光学相干断层扫描 (oct) 成像, 以确认适当的载体传递到视网膜8,17,20,22. 最近使用微机械手22驱动的微型针头描述了该方法的一些改进.

我们提出了一个综合的方法, 帮助在针的定位, 注射是由一个定制的定向立体眼镜仪设计在实验室专门为可视化内的小鼠17,23. 在使用拉玻璃微针头与立体定向微机械手相结合的情况下, 可以更好地控制针头的放置, 无需手术切除 (即通过结膜和结缔组织)。注射。使用压力调节的微注射器有助于提供一致的注射量, 并且与手持式注射器进行的手动注射相比, 注射的稳定性、精度和速度要慢得多, 从而降低了出现泡沫注射到眼睛。较小的针头有助于防止拔针后泄漏, 因为路径是自密封的。为了评估注射的程度, 许多研究小组依靠在实验结束时发现和评估视网膜中增强的绿色荧光蛋白 (egfp) 表达的区域范围 (由载体提供的表达结构)点 (安乐死) 确认注射成功11,19,20,24。这种方法 (不使用 oct) 来验证手术的成功, 浪费了大量的资源在外科手术时间和动物, 因为所有动物有 (未知) 手术失败需要保持, 其次是重复措施, 直到安乐死和眼睛收获 (当 egfp 被测量)。使用 hr-sd-oct 可以改善注射在视网膜中位置的确认, 以证明注射位于视网膜的正确层 (即视网膜下空间) 之间。hr-sd-oct 也可用于立即描述不成功的尝试 (手术失败), 以确定相关变量在实际手术时间, 以改进的方法。我们发现, HR-SD-OCT 通过允许快速定量评估视网膜外变性, 从而在临床前基因治疗研究中提供了许多优势, 从而能够识别不符合实验标准的研究动物 (例如,不正确的视网膜下注射), 并直接随访成像眼睛的区域, 其中矢量的交付 (在临床前的效果是最可能的), 以及控制区域, 其中矢量没有交付。自发展以来, sd-oct 的使用一直被眼科研究人员接受和使用, 现在被认为是小鼠或啮齿类动物模型 13,25视网膜科学研究中视网膜成像的标准。hr-sd-oct 及其软件能力以独特的综合方式被利用, 以促进小鼠模型在这一过程中的每一步成功进行定量基因治疗的目标, 包括动物模型的选择、选择中的退化特征疾病模型, 治疗传递, 病媒传递的映射, 和毒性/疗效评估。hr-sd-oct 的使用可以在整个过程的各个层面更有效地发现药物。在这里, 我们描述了这些方法, 用于我们的 rna 药物发现计划。

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研究方案

va wny hcs 机构动物护理和使用委员会和布法罗-suny 大学对动物规程进行了审查和批准。动物是根据视力和眼科研究协会 (arvo) 的规定和《赫尔辛基宣言》使用的。

1. 鼠标型号

  1. 确定要评估的鼠标模型, 包括控件。
    请注意:对 C57BL/6(J)、hcenhcne/wtmwmwwwwwwwwwt 进行了成像, 这是一种部分人性化的小鼠视网膜变性模型纯合子, 用于人类突变体 rho p3477s hc1 等体对野生类型 (wt ) 小鼠rho+/+基因型 26,27, hc1 x BL/6(J), 在 wt 鼠标 rho ++ 基因型 (hcne-/ mwtmwwwwwwwwt) 上的突变体rhop347s hc1 等体的单拷贝的部分人性化模型 (通过与 C57BL/6 交叉 hctuhc微小/wtmwwwwwwt 获得),j) 老鼠)。上述常染色体显性视网膜色素变性 (adrp) 模型是在 C57BL/6(J) 背景下。一个是纯合的小鼠模型, 为两个副本的人类wt rho基因的小鼠rho敲除背景也使用了28,29。这条线是在129sv 的背景。当这条线被越过与鼠标rho淘汰赛在129sv 背景时, 一个单一剂量的人类rho发生在鼠标rho背景上。
  2. 按照与实验设计相关的条件对动物进行维护。
    请注意:这些动物被保存在 va wny hcs 的兽医医疗单位 (vmu)。小鼠被喂进标准的实验室食物, 生长在 12 h:12 小时的光线下: 黑暗周期与软荧光头顶上的白色灯与大约300勒克斯在笼子水平在大约72°f。

2. 鼠标眼胶

  1. 准备用于视网膜成像30和外科手术的光学凝胶。
  2. 将 2mgm/wv 高分子量 (4 x10 6 gm/mol 卡波姆) 在无菌1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中结合。
  3. 在室温下混合, 直到凝胶形成粘稠的光学透明凝胶。
  4. 将凝胶转移到小的无菌瓶和离心机在一个摆动的桶桌面离心机在 350 x 克, 以消除被困的气泡。
  5. 将凝胶直接涂在角膜上, 以创建小鼠角膜和优质盖板玻璃 (18 毫米 x 18 毫米) 之间的界面。

3. hr-sd-oct 成像

  1. 请参见 hr-sd-oct 设备 (图 1)。
  2. 称量动物以确定麻醉剂的适当剂量。然后使用缓冲的 2, 2, 2, 2 -三溴醇醇 (阿维汀) 溶液的2.5% 溶液的体重25μlg 麻醉小鼠通过腹腔注射 (ip), 并添加眼药水, 以扩大瞳孔后, 动物被固定。
  3. 确认动物被脚趾捏完全麻醉, 并确保动物不会有反应。
  4. 修剪胡须, 并将鼠标放到 hr-sd-oct 雪橇上。
  5. 将鼠标的眼睛直接放在头戴镜头的前面, 并操纵舞台控制, 直到找到角膜和虹膜。用人工泪液保持角膜水分。
    请注意:hr-sd-oct 雪橇上的精细调整微机械手用于定位鼠标, 使瞳孔孔径居中和定向。然后, 光学头头被推进, 直到视网膜变得可见, 动物进一步调整, 以获得尽可能好的图像。
  6. 首先, 打开软件程序 "鼠标", 然后点击 "病人/考试"。其次, 单击 "添加患者" 并输入相关信息, 以便在新的患者窗口中识别动物, 并 "保存和退出"。第三, 点击 "添加考试", 然后点击 "开始考试"。第四, 点击 "添加自定义扫描", 然后选择 "矩形音量", 选择 "眼睛成像 od" 或操作系统, 然后点击 "添加考试"。最后, 开始瞄准仪器, 定位动物, 获得感兴趣的区域。找到正确的区域后, 在采集图像之前使用无菌棉尖施药器从眼睛表面取出多余的液体, 以进一步提高图像质量, 然后单击 "开始快照", 如果获得了良好的图像, 请单击 "保存"扫描 "。
    请注意:矩形 HR-SD-OCT 图像的典型参数为 900 a-scansn 扫描和 90 b-scansn 图像。获得的图像为1.4 毫米 x 1.4 毫米。视网膜成像的区域取决于特定的实验, 但大多数图像都以视神经头 (onh) 为中心。

4. 评估模型外视网膜退化的存在度、速率和一致性

  1. hr-sd-oct 评价视网膜外退行性模型
    1. 获取具有广泛年龄的动物, 供对照组和实验对象评估视网膜外变性的存在、速率和均匀性。
    2. 在每个年龄 (疾病和正常) 对多个动物进行 hr-sd-oct 成像。使用3.1.6 中描述的方法获取 oct 图像。
      请注意:数据可以同时从一大群动物身上收集, 这些动物的生日分布在很长一段时间 (1年), 或者一小群动物可以用来在很长一段时间 (1年) 内收集多个图像, 以获得类似的结果。
    3. 打开记录的 hr-sd-oct 矩形体积图像, 并从图像组合中识别要测量的第一个 b 扫描 (理想情况下包括 onh 或其他可识别的地标)。使用软件中的缩放功能放大图像以填充屏幕。
    4. 打开所需的卡钳数, 右键单击 b 扫描的图像, 然后点击 "卡钳", 最后点击所需的尽可能多的卡钳 (他们的编号为1到 10)。确保卡钳显示在图像的右下角。使用 "配置卡器" 功能, 在角度块列中将它们都指定为 "垂直", 并打开 "显示卡器位置", 以便在视网膜上统一放置, 最后, 单击 "应用"。
      请注意:处理眼底物右眼时, 应将 1 st 卡钳放置在图像的左侧, 在处理眼角险恶 (os) 左眼图像时 , 应将 1 st 卡钳放置在图像的右侧.这导致在绘制时, 左眼和右眼的所有数据都具有鼻到时间的方向。
    5. 使用计算机鼠标, 移动每个卡尺到所需的位置 (2.0 毫米间隔) 在 b 扫描, 确保放置一个卡钳在中心的视神经头, 在 b 扫描图像, 包括它 (设置此卡尺为零)。然后使用鼠标单击并拖动卡尺以长度来跨越感兴趣的区域。任意设置不覆盖 b 扫描的可测量区域的卡钳到最大长度, 并在数据分析过程中忽略。
    6. 使用卡尺工具测量 onl 厚度, 方法是将卡钳的顶部放置在外限膜 (elm) 处, 将卡钳底部置于外神经丛层 (opl) 底部。在视网膜上的每个卡钳以0.2 毫米的增量重复此操作。保存测量值。
    7. 在放置了所有卡钳并根据大小进行调整后, 右键单击图像并单击 "保存卡钳数据"。
    8. 在随后的 b 扫描中重复测量 (每10次扫描效果良好), 从相同的矩形体积 oct 图像跨越整个视网膜从下到优越的区域。卡钳应保持打开状态, 并位于 x 轴的同一位置。调整卡钳的长度, 而不将它们向 x 方向移动。
    9. 通过单击处理后的 b-扫描图像旁边的小文件图标打开保存数据文件, 然后单击 "转到数据"。单击 "修改日期, 根据节省的时间按顺序排列文件, 并打开每个 b 扫描测量的所有文件。
    10. 根据帧号, 按从最低到最高的顺序将每个 b 扫描中的原始数据编译为单个文件。选择数据列, 包括 "卡举名称"、"长度" 和 "中心 x"。
    11. 确保中心 x 对于为处理的每个矩形体积 oct 图像测量的所有 b 扫描都是相同的。删除卡钳中没有用于记录测量值的任何数据, 并将位于视神经头中心的卡钳设置为零。
    12. 绘制 x 与多个 y 数据集的数据, 以获得3d 绘图函数, 绘制 onl 或另一个测量视网膜层的整体厚度。
    13. 比较对照和实验动物之间的 onl 测量与相应的年龄, 以确定任何潜在的视网膜变性的速度和均匀性。
    14. 使用相同的 b 扫描图像重复 osl 测量过程。遵循用于测量 onl 的相同方法, 但在 elm 和 bruch 膜 (bm) 之间放置卡钳。
      请注意:如何放置卡钳的示例在 "代表性结果" 部分中显示 (图 3b)。这应该在图像中的缩放上完成, 以减少错误。
    15. 在每个生日为实验和控制组重复多个动物的数据分析。
  2. 使用软件卡钳工具对 onl 或 osl 厚度进行全面测量和3d 映射
    1. 查看注射后的 oct 图像, 并记下任何可识别的地标, 如在此视视网膜的 onh 或血管。然后定位鼠标, 从同一区域获取后续 sd-oct, 并确保包括相同的可识别地标。
      请注意:确保在注射 sd-oct 后的图像中识别视网膜的区域, 并将其与视网膜脱离有关。记录矩形卷 sd-oct 图像并将其保存。
    2. 按照上述步骤处理记录的图像, 4.1.3.到4.1.14 。如上所述, 保存卡钳数据和图形。
      请注意:生成的 onl 测量数组用于创建描述 onl 厚度的3d 图形。卡钳沿 x 轴的位置允许重新绘制沿 x 轴将视神经置于原点 (0) 的图形。y 轴使用 b 扫描数绘制, 然后使用视神经来定义起点, 从而使一个人能够在 y 轴上正确地定位视神经的原点。识别每个数据集中的视神经, 可以可靠地对齐后续图像。
  3. 将注射部位的范围映射到眼底图像上
    1. 执行注射后矩形体积 oct, 以确认注射的成功。遵循3.6 中描述的方法。
    2. 使用软件中的卡力功能, 从跨越整个 oct 图像的大量 b 扫描中识别分离视网膜边界上的拐点。使用该方法打开4.1.4 中描述的卡钳.
    3. 记录眼底图像与 oct b 扫描的映射位置和相应的卡尺位置在眼底图像, 这对应于其位置。
    4. 将所有眼底图像编译为复合图像, 包括卡尺位置, 从而将注入站点精确地映射到眼底图像上 (示例, "代表性结果" 部分,图 5a)。

5. 眼内注射

请注意:最近的一项研究23进一步详细阐述了区域信息系统的使用情况。

  1. 准备玻璃注射针
    1. 采用干循环, 用细丝小批量高压灭菌毛细管。
    2. 使用移液器拉拔器并设置一个程序, 该程序将产生角度最锐利、直径在2-5μm 范围内的玻璃尖端。
      请注意:表 1显示了在我们的移液器拉拔器上产生有效针头的5步程序样本。
    3. 在室温下将拉好的玻璃针头存放在无菌的移液器针罐中。
  2. 用所需的注射液填充注射针
    1. 将针头安装到针架上, 使大约 5/"突出到刀架的末端以外。
      请注意:距离小于 "/" 将使其难以到达注射溶液以填充针头, 因为针座不适合容易进入 0.2 ml 管的开口。此外, 针突出超过 "超过" 导致明显更大的振荡或进的尖端, 使实时成像困难, 因为尖端离开焦平面或视野 (fov), 同时试图刺穿眼睛。
    2. 在无菌 0.2 ml 管中准备注射溶液。在注射溶液中加入 1:10 稀释无菌荧光素硫酸盐 (1x pbs 中的 10 mgml), 以获得 1 mg/ml 的最终荧光素浓度。
      请注意:所使用的精确染料是用户特有的, 可以是任何在白光照射下肉眼无毒和可见的东西, 以帮助精确地将针尖放置在 rpe 和视网膜下空间的水平。
    3. 通过立体显微镜可视化针头, 同时使用3轴微机械手的控制旋钮来定位针头, 使其与包含用于填充针头的注射溶液的管的中心对齐。
    4. 小心地将针尖驱动到 0.2 ml 管中, 直到针尖浸入液体中。将所需的注射液 (例如1μl) 放入一次性注射所需的针头中。保持剩余的溶液放在冰中的管中。
  3. 准备注射动物
    注:     ris 显微镜保持清洁, 是一个非接触系统。加热板上覆盖着干净的吸附剂垫, 针头在被拉扯之前是高压灭菌的。当它们被经过自消毒加热的金属带拉扯后, 它们被保存在一个封闭的消毒室里, 用来固定拉的玻璃针。针头只使用戴手套的手进行处理, 并在将针头安装到支架时, 使用小心的方法防止针头接触。注射溶液是使用无菌技术制备的, 通过将病毒制剂样本撒在 lb 琼脂板上并在37°c 下夜间孵育来进行污染检测。
    1. 称量动物 (g) 以确定麻醉镇痛的适当剂量。
    2. 通过腹腔注射 (ip) 进行麻醉 (缓冲 2, 2, 2-三溴醇醇 (avertin) 的2.5% 溶液)。
    3. 立即对双眼应用抗胆碱能药物 (如环戊酸酯), 使瞳孔扩张。
    4. 修剪动物的胡须, 并使用耳拳或其他方法对动物进行编号。
    5. 用稀释的贝塔定清洗眼睛和周围地区。
      请注意:避免在鼻子周围得到任何解决方案, 因为这可能导致无意中溺水。
    6. 将鼠标放在保持在39°c 的加热垫上, 放在预先成型的建模器的粘土鼠标支架上, 眼睛将被注射到针头上。
    7. 使用后脚的夹点测试, 确保鼠标没有反应。
  4. 进行视网膜下注射
    1. 使用一对无菌钝虹膜钳轻轻诱导地球的突起, 将钳子的尖端在7点和10点钟的位置在眼睑上, 同时推动打开和向下的同时。
    2. 在注射过程中, 使用钳子哄眼底下的眼睑, 使其远离眼窝。
      请注意:10至14天大的动物往往比年龄较大的动物更容易将眼睛从插座里伸出来。
    3. 将针尖在角膜缘以下约 1-1. 5 毫米, 并小心地将其通过结膜驱动眼睛, 直到针穿透锁骨组织时形成锁骨凹陷, 并允许操纵眼睛。
    4. 用 ris 立体显微镜用微机械手向下旋转眼睛, 通过扩张的瞳孔显示锁骨凹陷。
    5. 涂抹一滴无菌眼凝胶或 1x pbs 溶液, 并用无菌覆盖片覆盖。
    6. 关注针头尖端 (2-5μm) 造成的锁骨凹陷, 并将针头向前推进, 直到注射部位形成视网膜的尖峰。
    7. 使用支架旋转针头, 直到尖端通过锁骨, 针中的荧光素在 rpe 细胞单层附近的视网膜下可见。
    8. 驱动针头的尖端, 使其与地球相切, 然后用脚踏开关激活喷油泵。
    9. 在所需体积 (0.5-1μl) 输送到视网膜下空间后, 取出针头并检查气泡是否稳定, 且流体不会泄漏出注射部位, 这是成功注射的第一个标准。
      请注意:保持适当的尖端直径 (2-5μm 直径) 对于避免注射部位泄漏至关重要。
    10. 将动物放置在 oct 仪器的成像平台上。按照 hr-sd oct 成像的说明记录矩形卷图像。
    11. 确认注入的液体位于视网膜下的空间, 并保存图像以确定泡泡的范围。
    12. 将动物从支架中取出, 并在注射的眼睛上涂抹大量的抗生素软膏。
    13. 将动物放在加热垫上, 直到它完全恢复, 然后将其放回原来的笼子里。
      请注意:我们的动物通常在断奶前注射, 因此动物需要和母亲一起返回笼子。
  5. 使用 oct 仪器软件工具绘制视网膜下泡泡的范围。
    1. 使用前面描述的方法获取矩形体积 oct 图像, 并将其放置在眼睛内, 以包括一个可识别的地标, 如 onh。
      请注意:记录 90 b 扫描可以很好地映射泡泡, 但可以根据所需的分辨率使用。
    2. 在图形中添加一个卡尺, 并将其放置在视网膜与 rpe 和脉络膜分离的拐点。
      请注意:该软件会自动将对应的点映射到表示卡尺和正在评估的 b 扫描的眼底图像上的一条线。
    3. 捕获卡钳放置后的屏幕, 并编译图像, 以有效地将注入泡沫的边框映射到眼底图像上, 从而精确地映射注入部位。保存已编译的映像以供参考, 以帮助在后续成像过程中定位感兴趣的区域。
      请注意:或者, 可以使用类似的方法保存、遵守和绘制卡钳数据, 以绘制 onl 厚度的3d 数据集。
  6. 内喷注射
    1. 将针头尖端使用类似于视网膜下注射的手术方法, 只是针头完全通过角膜缘后面约0.25 毫米的椎板上的阴囊驱动 , 进入玻璃体。
    2. 在针头放置后, 用脚踏应用注射脉冲。
      请注意:观察到荧光素染料在眼罩的整个玻璃体中的快速扩散, 用荧光填充扩张的瞳孔孔径。

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结果

模型外视网膜退化的存在性、速率和一致性评价
从 opl 到 elm 的测量记录, 使用仪器软件中提供的卡尺工具定义了 onl 的限制。目标是在部分人性化的 adrp 小鼠模型中绘制视网膜外变性的进展图。来自对照 C57BL/6(J) 小鼠和 hC1/hC1//mWT/mWT 小鼠模型的可比图像, 表达了突变的人棒蛋白 (rhop347s) 基因的两个副本, 显示出控制视网膜的发现和严重的和严?...

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讨论

hr-sd-oct 为人类疾病潜在动物模型的定性提供了一种简单的方法, 以确定它们在测试潜在疗法方面的有用性。快速可靠地描述人类疾病潜在动物模型的能力对于治疗药物发现的过程至关重要 (例如, 替代基因治疗、核酶或 shnna 敲除基因治疗、联合基因治疗)。hr-sd-oct 为评估视网膜健康提供了一种简单、快速和非侵入性的方法, 可用于描述和监测几乎所有小鼠模型中视网膜退化的进展。oct 图像可...

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披露声明

商业关系: mcb: 无;jms: 没有。本研究中使用的视网膜成像系统 (ris)23是一种新的装置, 对任何寻求在小鼠、啮齿类动物或小动物身上进行基因治疗传递研究的群体都有很大的用处。虽然提交人目前对这一装置没有任何冲突需要申报, 但 buffallou-suny 大学和退伍军人管理局对知识产权拥有权利, 今后可能寻求将这一装置商业化。

致谢

这些材料的部分依据是退伍军人事务部、退伍军人卫生管理局、研究与发展办公室 (生物医学实验室研究与开发) (退伍军人健康研究所) (退伍军人健康研究所赠款 1i01 bx000669) 所支持的工作。jms 部分由 va wny 聘为眼科工作人员医生-科学家;mcb 部分受雇于 va wny。这项研究是在纽约西部医疗系统 (纽约州布法罗) 进行的, 并得到了部分支持。内容不代表退伍军人事务部或美国政府的意见。还在很大程度上支持, NIH/NEI 授予 ey013433 (p:jms), nih变 nei r24 授予 ey016662 (ub 视觉基础设施中心, pi: m 屠宰, 目录-biophotonics 模块: jms), 向奥曼诺林大学系提供不受限制的赠款布法罗来自预防失明研究 (纽约州纽约), 以及 oishei 基金会 (纽约州布法罗) 提供的一笔赠款。我们承认 hc1 转基因rhop347s线的礼物和来自 janis lem 博士 (波士顿塔夫茨新英格兰医疗中心) 的 exon 1老鼠 rho淘汰赛的礼物, 以及 nrt-e 转基因模型在杂合状态下的天赋。鼠标外显子 2 rho 淘汰赛背景从g. 简·法拉尔博士和彼得亨弗里斯博士 (三一学院, 都柏林, 爱尔兰共和军)。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL6 (J)Jackson Laboratories664
N129R-N/AN/A
2HRho 1T/1TN/AN/A
Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT)Bioptigen90-R2200-U1-120.  
Retinal Imaging System (RIS)In-houseN/A
Stemi 2000C MicroscopeZeiss000000-1106-133
P-97 Flaming/Brown micropipette pullerSutter Instrument Cop-97
MMN-33 micro manipulator Narishige USAMMN-33
PLI-100  micro injectorHarvard Apparatus64-1736
Micropipette Holder (Rotating)In-houseN/A
Micropipette Storage ReceptacleWorld Precision Instruments Inc.E210
 Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, Harvard Apparatus30-0053
2,2,2-TribromoethanolSIGMA AldrichT48402-25G
Tert-amyl AlcoholSIGMA Aldrich240486-100ML
Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1%Akorn Inc.NDC 17478-215-05
GonioviscBioVision LimitedNDC 17238-610-15
Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP  2%Akorn Inc.NDC 17478-097-10
Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1%PerigoNDC 45802-046-35
Systane UltraAlcon Laboratories, Inc.9006619-1013
Tetracaine HydrochlorideBausch and LombNDC 24208-920-64
Ophthalmic Solution, USP 0.5%Bausch and LombNDC 24208-920-64
DPBSGibco Life Technologies14190-136
Virus PreparationsViGene /UNCN/A
Gold nanorodsNANOPARTzD12M-850-1.75
Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25%Akorn Inc.NDC 17478-250-20
CoverslipsFisher Scientific12-548-A
ForcepsMilton18-825
Needles 30 guageBeckton Dickenson  W11604
SyringesBeckton Dickenson  309659
Bioptigen software PackageBioptigenN/A
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5%Akorn Inc.NDC 17478-263-12
Windows ExcelMicrosoftN/A
Adobe IllustratorAdobe 
ScaleMettler
ScissorsWorld Precision Instruments
Ear punchNat’l band
CL 100 Light sourceWelch AllynCL100
Nitrogen GasJackson Welding SupplyN/A
Heated Water bathNeslabRTE-140
Heating plateIn HouseN/A
Heating matCincinnatti Sub Zero273
Clay mouse holderPlast.i.clay American Art Clay Co.N/A
BetadineMedLine NDC53329-938-06
Cotton Tip ApplicatorsAmerican Health ServiceCtag
EtOH 70%Fisher ScientificBP2818-100
Gloves NitrileVWR89038-272
Diagnosys ERG Color Dome instrumentDiagnosys Inc.D125
Contact lensesIn-houseN/A
Diagnosys SoftwareDiagnosys Inc.N/A
Origin 6.1 softwareOriginLab Corp.N/A
Reference electrodesOcuscienceF-Thread Electrode (DTL) 24”

参考文献

  1. Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
  2. Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations. Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).
  3. Seo, S., et al. Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).
  4. Molday, L. L., et al. RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12. Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).
  5. Pang, J. J., et al. AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).
  6. Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies. Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).
  7. Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).
  8. Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach. J. Vis. Exp. (118), e54808(2016).
  9. Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. Gene therapy for ocular angiogenesis. Clinical Science. 104, 561-575 (2003).
  10. Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy. Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).
  11. Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).
  12. Ruggeri, M., et al. In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).
  13. Berger, A., et al. Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494(2014).
  14. Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images. TVST. 4 (4), 9(2015).
  15. Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).
  16. Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J. Vis. Exp. (69), e4286(2012).
  17. Berger, A., al,, et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoSOne. 9 (5), 96494(2014).
  18. Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).
  19. Sarra, G. M., et al. Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus. Vision Res. 42, 541-549 (2002).
  20. Yan, Q. I., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).
  21. Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030(2015).
  22. Westenskow, P. D., et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247(2015).
  23. Butler, M. C., Sullivan, J. M. A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).
  24. Rolling, F., et al. Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography. Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).
  25. Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology. PLoS One. 9 (10), 111203(2014).
  26. Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).
  27. Brill, E., et al. A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).
  28. Olsson, J. E., et al. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron. 9, 815-830 (1992).
  29. Humphries, M. M., et al. Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene. Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).
  30. Hruby, K. Clinical examination of the vitreous body. Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).
  31. Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).
  32. Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).
  33. Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina. Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).
  34. Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes. Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).
  35. Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Vision Res. 48, 453-469 (2008).

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