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Résumé

Nous démontrons une nouvelle approche à l’utilisation de tomographie à cohérence optique domaine spectral haute résolution (HR-SD-OCT) pour aider l’administration d’agents de thérapie génique dans l’espace sous-rétinienne, évaluer sa couverture areal et caractériser la vitalité des photorécepteurs.

Résumé

HR-SD-OCT est utilisé pour surveiller la progression de la dégénérescence des photorécepteurs dans des modèles de souris vivante, évaluer l’administration d’agents thérapeutiques dans l’espace sous-rétinienne et d’évaluer la toxicité et l’efficacité le in vivo. HR-SD-OCT utilise près de lumière infrarouge (800-880 nm) et a l’optique spécialement conçu pour l’unique optique de le œil de souris avec résolution axiale sub-2-micron. Modèles de souris transgéniques de dégénérescence rétinienne externe (photorécepteurs) et les contrôles ont été imagées pour évaluer la progression de la maladie. Verre tiré des micro-aiguilles servaient à administrer des injections rétinienne de sup d’adeno-associated virus (AAV) ou de nanoparticules (NP) via une approche trans-sclérale et trans-choroïdienne. Attention, positionnement de l’aiguille dans l’espace sous-rétinienne était nécessaire avant une injection pression calibrée, qui délivre le fluide dans l’espace rétinienne sub. Temps réel sous-rétinienne chirurgie a été réalisée sur notre rétine imaging system (RIS). HR-SD-OCT a démontré la dégénérescence rétinienne progressive uniforme en raison de l’expression d’un humain mutant mutante rhodopsine toxique (P347S) transgène (RHOP347S) chez la souris. HR-SD-OCT permet une quantification rigoureuse de toutes les couches des rétiniens. Couche nucléaire externe (ONL) épaisseur et photorécepteur segment externe (OSL) mesures de longueur sont corrélés avec la vitalité des photorécepteurs, dégénérescence ou de sauvetage. Le système de largage RIS permet une visualisation en temps réel des injections sous-rétinienne dans néonatale (~ P10-14) ou de souris adultes et HR-SD-OCT immédiatement détermine le succès de la livraison et cartes étendue aréale. HR-SD-OCT est un outil puissant capable d’évaluer le succès de la chirurgie sous-rétinienne chez la souris, en outre de mesurer la vitalité des photorécepteurs in vivo. HR-SD-OCT permet également d’identifier des cohortes animales uniformes pour évaluer le degré de dégénérescence rétinienne, la toxicité et sauvetage thérapeutique dans des études de recherche de thérapie génique préclinique.

Introduction

Chercheurs mettent au point des thérapies géniques pour une variété de maladies dégénératives rétiniennes et rétiniennes dans l’espoir de traduire les nouvelles thérapeutiques en traitements pour les maladies humaines1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. domaine temporel ou tomographie en cohérence optique domaine spectral (SD-OCT) a été utilisée pour étudier les aspects de la dégénérescence rétinienne externe dans des modèles de souris spécifiques de maladie12,13,14 . HR-SD-OCT n’a pas, toutefois, été largement utilisé dans le contexte de l’optimisation évaluation de modèles murins pour déterminer le taux et l’uniformité spatiale de dégénérescence rétinienne, ou dans le cadre de l’évaluation préclinique du gène basé thérapeutique, par exemple, à évaluer le sauvetage, la toxicité ou l’étendue spatiale de vecteur livraison8,15,16. Une fois un modèle de souris est entièrement caractérisé, les données RH-SD-OCT peuvent servir comme une ressource informative et fiable pour mesurer l’impact de la thérapeutique à exercer de sauvetage ou toxicité dans des modèles murins de la dégénérescence rétinienne,17. Plusieurs groupes utilisent injection sous-rétinienne comme méthode de livraison de vecteur en raison de son efficacité à transduction des photorécepteurs et les cellules (pre) de l’épithélium pigmentaire rétinien. Toutefois, cela reste une méthode difficile à maîtriser, étant donné qu’il est généralement fait en chirurgie de la main-libre de la surface de la cornée et pose souvent des cataractes, des saignements et des décollements de la rétine involontaires qui se produisent par simple manipulation de la partie postérieure vitrifiée. Beaucoup de groupes encore tente des injections sous-rétinienne aveuglément et livrer le virus en utilisant des injections manuelles avec relativement de grand diamètre en acier inoxydable aiguilles (34G)8,17,18,19 ,20,21,22et quelques usages tomographie par cohérence optique (OCT) imagerie pour confirmer la livraison appropriée de vecteur à la rétine8,17, 20 , 22. quelques améliorations dans la méthode ont été récemment décrites à l’aide d’aiguilles microscale pilotées par un micromanipulateur22.

Nous présentons une approche intégrée qui facilite le positionnement de l’aiguille, et les injections sont facilitées par un ophtalmoscope stéréo dirigé personnalisé, conçu en laboratoire spécialement pour visualiser l’intérieur de le œil petit des souris17, 23. l’utilisation d’aiguilles micro verre tiré en conjonction avec le micromanipulateur stéréotaxique fournissent un meilleur contrôle du placement de l’aiguille avec aucune chirurgie coupé requis (c.-à-d., à travers la conjonctive et du tissu conjonctif) avant injection. L’utilisation de la pression régulée volumes d’injection cohérente d’injecteur micro contribue à livrer, et l’injection peut être faite avec la plus grande stabilité, précision et beaucoup plus lente que les injections manuelles effectuées par une seringue à main, réduisant ainsi la apparition de l’injection de bulles dans le œil. La plus petite aiguille permet d’éviter les fuites après retrait de l’aiguille, car le chemin est hermétique. Pour évaluer l’ampleur de l’injection/livraison, plusieurs groupes d’enquête dépendent de trouver et d’évaluer l’étendue de l’expression de protéines (EGFP) fluorescence verte améliorée dans la rétine (construction d’expression envoyée par le vecteur) à la fin expérimentale pour confirmer les injections réussies11,19,20,24, point (euthanasie). Cette approche (ne pas en utilisant OCT) pour vérifier la réussite chirurgicale gaspille une énorme quantité de ressources temps procédure chirurgicale et des animaux, puisque tous les animaux avec des échecs chirurgicaux (inconnus) doivent être maintenus, a suivi avec des mesures répétées jusqu'à ce que euthanasie et oeil de récolte (lorsque EGFP est mesurée). Confirmation de l’emplacement de l’injection dans la rétine peut être améliorée à l’aide de HR-SD-OCT pour démontrer que l’injection est située entre les couches correctes de la rétine (c'est-à-dire l’espace sous-rétinienne). HR-SD-OCT peut également être utilisé pour délimiter immédiatement les tentatives infructueuses (échecs chirurgicaux) pour déterminer les variables pertinentes en temps réel chirurgical afin d’améliorer l’approche. Nous avons trouvé que HR-SD-OCT offre nombreux avantages gène précliniques études de thérapie en autorisant rapide évaluation quantitative de la dégénérescence rétinienne externe, permettant l’identification/abattage d’animaux, étude qui ne répondent pas aux critères expérimentaux ( par exemple, injection sous-rétinienne incorrecte) et à direct suivi d’imagerie pour la région de le œil où vecteur a été livré (effet préclinique étant probablement) ainsi que le contrôle des régions où vecteur n’a pas remis. Depuis son développement, l’utilisation du SD-OCT a continué à être accepté et utilisé par les chercheurs de l’ophtalmologie et est aujourd'hui considérée comme la norme d’imagerie rétinienne dans des études scientifiques rétiniens de souris ou les rongeurs modèles13,25. HR-SD-OCT et ses capacités de logiciels ont été utilisées de manière intégrée unique pour atteindre son objectif de réussite quantitative génothérapie dans des modèles murins à chaque étape du processus, y compris la sélection de modèle animal, caractérisation de la dégénérescence dans choisie les modèles de maladies, livraison thérapeutique, cartographie des prestation de vecteur et l’évaluation de la toxicité/efficacité. L’utilisation des ressources humaines-SD-OCT permet la découverte de médicaments plus efficace à tous les niveaux du processus. Nous décrivons ici ces approches utilisées dans notre programme de découverte de médicaments de l’ARN.

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Protocole

Protocoles animaux ont été examinés et approuvés par l’animalier institutionnel et l’utilisation des comités de la VA WNY HCS et l’Université de Buffalo-SUNY. Animaux ont été utilisés selon les stipulations de l’Association for Research in Vision et Ophthalmology (ARVO) et la déclaration d’Helsinki.

1. modèles de souris

  1. Identifier des modèles de souris pour être évalués, y compris les contrôles.
    Remarque : L’imagerie a été réalisée pour un C57BL/6(J), mWT hC1/hC1 / / / mWT, un modèle de dégénérescence rétinienne partiellement humanisés souris homozygote pour humains mutants RHOP347S hC1 allèles sur le type sauvage (WT) souris RHO+ / + génotype26 , 27, hC1 x BL/6(J), un modèle partiellement humanisé avec une seule copie de l’allèle mutant de hC1P347S humaine de RHOla souris WT RHO+ / + génotype (hC1 /-/ / mWT/mWT) (obtenu par croisement mWT hC1/hC1 / / / mWT avec (C57BL/6 Souris J)). Le ci-dessus autosomique dominante rétinite pigmentaire (PACA), les modèles sont sur le fond C57BL/6(J). Un modèle de souris qui est homozygote pour deux copies du gène WT RHO humain sur la souris fond knockout RHO a été également utilisé28,29. Cette ligne est sur le fond de 129Sv. Quand cette ligne a été croisée avec un masquage de RHO de la souris sur le fond de 129Sv, une seule dose de humaine RHO se produit sur la souris fond de RHO .
  2. Maintenir les animaux suivant les conditions pertinentes à la conception expérimentale.
    Remarque : Les animaux ont été maintenus dans l’unité médicale vétérinaire (VMU) à la VA WNY HCS. Des souris ont été nourries chow de laboratoire standard et cultivées h:12 de moins de 12 h de lumière : cycles sombres avec une surcharge fluorescente douce blanc feux avec environ 300 lux au niveau de la cage à environ 72 ° f.

2. souris Eye Gel

  1. Préparer le gel optique utilisé pour l' imagerie rétinienne30 et interventions chirurgicales.
  2. Combiner 2 mg/mL w/v haut poids moléculaire (4 x 106 g/mol carbomer stérile 1 x Phosphate Buffered Saline (PBS).
  3. Mélanger à la température ambiante jusqu'à ce que le gel forme un gel visqueux optiquement transparent.
  4. Transférer le gel dans des petites bouteilles stériles et centrifuger dans une centrifugeuse de table de seau se balançant à x 350 g pour enlever les bulles d’air piégées.
  5. Appliquer le gel directement sur la cornée afin de créer une interface entre la cornée de souris et d’un couvercle en verre premium (18 x 18 mm).

3. HR-SD-OCT imagerie

  1. Voir le dispositif HR-SD-OCT (Figure 1).
  2. Peser l’animal afin de déterminer la dose d’anesthésique. Anesthésier la souris à l’aide de 25 µL/g de poids corporel de la solution de 2,5 % de tampon 2,2,2-tribromoethyl alcool (Avertin) solution par injection intrapéritonéale (IP), puis ajouter que le collyre pour dilater les pupilles après que l’animal est immobilisé.
  3. Confirmer que l’animal est complètement anesthésié par un pincement de l’orteil et assurez-vous que l’animal ne réagit pas.
  4. Couper les moustaches et placez la souris sur le traîneau de HR-SD-OCT.
  5. Positionner l’oeil de la souris directement devant l’objectif de bandeau et manipuler les contrôles de la scène jusqu'à ce que la cornée et l’iris situent trouvent. Garder la cornée hydratée en appliquant des larmes artificielles.
    Remarque : Les micromanipulateurs de réglage fin sur le traîneau de HR-SD-OCT servent à positionner la souris tels que l’ouverture de la pupille est centrée et orienté. La pièce de tête optique est ensuite avancée jusqu'à ce que la rétine devient visible et de l’animal est plus ajustée pour obtenir la meilleure image possible.
  6. Tout d’abord, ouvrez le logiciel « Souris » et cliquez sur « patient/exam ». Ensuite, cliquez sur « Ajouter un patient » et entrez les informations pertinentes pour identifier l’animal dans la nouvelle fenêtre-patient et « save and Exit ». En troisième lieu, cliquez sur « Ajouter un examen » suivie de « démarrer exam ». Quatrièmement, cliquez sur « Ajouter un scan personnalisé » et sélectionnez « volume rectangulaire », choisissez OD ou OS pour le œil en image, puis cliquez sur « Ajouter un examen ». Enfin, démarrez visant l’instrument et le positionnement de l’animal pour obtenir la zone d’intérêt. Une fois que trouver la bonne région, retirez tout excès de liquide de la surface de le œil à l’aide d’un coton stérile à bout applicateur juste avant l’acquisition d’images afin d’améliorer encore la qualité de l’image, puis cliquez sur « Démarrer la capture instantanée », et si une bonne image est obtenue, cliquez sur « Enregistrer Scan ».
    Remarque : Des paramètres typiques pour des images de HR-SD-OCT rectangulaires sont 900 a-scans/b-scan et 90 b-scans/image. Images acquises sont 1,4 x 1,4 mm. La région de la rétine imagée dépend de l’expérience spécifique, mais la plupart des images sont centrées sur la tête du nerf optique (ONH).

4. évaluation de la présence, taux et l’uniformité des dégénérescences rétiniennes extérieur modèle

  1. Évaluation du modèle la dégénérescence rétinienne externe par HR-SD-OCT
    1. Obtenir des animaux avec un large éventail d’âges pour le contrôle et les sujets expérimentaux afin d’évaluer la présence, taux et l’uniformité de la dégénérescence rétinienne externe.
    2. Effectuer l’imagerie HR-SD-OCT sur plusieurs animaux à chaque âge des deux cohortes (maladie et normal). Utilisez la méthode décrite dans 3.1.6 afin d’obtenir les images OCT.
      Remarque : Données peuvent être recueillies d’une importante cohorte d’animaux tout à la fois, qui ont distribué des anniversaires couvrant une large période de temps (1 an), ou une petite cohorte d’animal peut être utilisée pour recueillir des images multiples sur une longue période de temps (1 an) pour obtenir des résultats similaires.
    3. Ouvrir une image de volume rectangulaire HR-SD-OCT enregistrée et d’identifier le premier b-scan à mesurer (idéalement comprendra l’ONH ou autre point de repère identifiable) de l’ensemble des images. Agrandir l’image pour remplir l’écran en utilisant la fonctionnalité de zoom dans le logiciel.
    4. Ouvrez le nombre désiré d’étriers en un clic droit sur l’image du b-scan, puis en cliquant sur « Étriers » et enfin en cliquant sur les étriers autant que désiré (elles sont numérotées de 1 à 10). Veiller à ce que les étriers apparaissent dans le coin inférieur droit de l’image. En utilisant la fonction « Configurer l’étrier », assignez-les tous comme « verticale » dans la colonne bloc angle et tourner sur « Emplacement d’étrier affichage » pour faciliter le placement uniforme sur la rétine et enfin, cliquez sur appliquer.
      Remarque : L’étrier dest 1 doit être placé sur le côté gauche de l’image lors du traitement de le œil droit de la dextre (OD) d’oculus et le 1st étrier doit être placé sur le côté droit de l’image lors du traitement d’images oeil gauche oculus sinister (OS). Cela se traduit par une nasale à orientation temporelle de toutes les données pour les deux les yeux droit et gauche lors du traçage.
    5. À l’aide de la souris d’ordinateur, traversent chaque étrier vers l’emplacement souhaité (2,0 millimètres) le b-scan, en veillant à placer au centre de la tête du nerf optique, dans les images de b-scan qui incluent un étrier (définir cet étrier à zéro). Puis utilisez la souris pour cliquer et glisser l’étrier à la longueur à couvrir la région d’intérêt. Fixé arbitrairement les étriers qui ne pas superposer les régions mesurables du b-scan à la longueur maximale et ignorer lors de l’analyse de données.
    6. Mesurer l’épaisseur de l’ONL grâce aux outils de l’étrier, en plaçant la partie supérieure de l’étrier à la membrane limitante externe (orme) et le bas de l’étrier au bas de la couche plexiforme externe (OPL). Répétez cette opération pour chaque étrier sur la rétine par incréments de 0,2 mm. Enregistrer les mesures.
    7. Une fois tous les étriers ont été placés et ajustées à la taille, faites un clic droit sur l’image et cliquez sur « Enregistrer les données de pied à coulisse ».
    8. Répéter les mesures sur b-analyses ultérieures (chaque 10th scan fonctionne bien) sur le même volume rectangulaire image OCT s’étendant sur la rétine entière d’inférieurs aux régions supérieures. Étriers doivent rester ouvert et au même endroit dans l’axe des abscisses. Ajuster la longueur des étriers de sans les déplacer dans la direction X.
    9. Ouvrez l’enregistrement des fichiers de données en cliquant sur l’icône du fichier petit à côté de la b-scan transformé image et cliquez sur « Aller à Data ». Cliquez sur « Date de modification pour organiser les fichiers de commande basée sur le gain de temps et ouvrir tous les fichiers pour chaque b-scan mesurée.
    10. Compiler les données brutes de chaque b-scan dans un seul fichier dans l’ordre du plus bas au plus élevé basé sur le numéro d’image. Sélectionnez les colonnes de données, y compris le « Nom de l’étrier », « Longueur » et « Centre X ».
    11. Veiller à ce que le centre X est le même pour tous les b-scans mesurées pour chaque volume rectangulaire OCT image traitée. Supprimer toutes les données des étriers qui n’étaient pas utilisés pour enregistrer les mesures et définir l’étrier situé au centre de la tête du nerf optique à zéro.
    12. Tracer les données pour X vs plusieurs jeux de données Y pour obtenir une fonction de terrain 3D pour tracer l’épaisseur totale de l’ONL ou une autre mesure couche rétinienne.
    13. Comparer les mesures ONL entre le contrôle et les animaux de laboratoire avec des âges correspondants pour déterminer le taux et l’homogénéité de toute éventuelle dégénérescence rétinienne.
    14. Répétez le processus pour les mesures de l’OSL en utilisant les mêmes images de b-scan. Suivre la même méthode utilisée pour mesurer l’ONL, sauf placer les étriers entre la membrane de Bruch et de ELM (BM).
      Remarque : Un exemple de comment placer l’étrier est montré dans la section représentant résultats (Figure 3B). Cela devrait se faire sur une image zoomée dans pour diminuer l’erreur.
    15. Répétez l’analyse des données pour plusieurs animaux pour chaque anniversaire à la fois expérimentale et les cohortes de contrôle.
  2. Mesure complète et cartographie en 3D de l’ONL ou OSL épaisseur à l’aide de l’outil d’étriers
    1. Revoir les images de OCT post injection et prendre note de tout repère identifiable, comme l’ONH ou les vaisseaux sanguins de la rétine. Puis placez la souris pour obtenir un suivi SD-OCT de la même région et n’oubliez pas d’inclure les mêmes repères identifiables.
      Remarque : Veiller à ce que la région de la rétine, imagé et impliqués dans le décollement de la rétine est identifiée dans les images de la post injection SD-OCT. Enregistrer une image de volume rectangulaire SD-OCT et enregistrez-le.
    2. Traiter les images enregistrées comme décrit ci-dessus aux points 4.1.3. à 4.1.14. Enregistrer les données de l’étrier et l’intrigue comme décrit ci-dessus.
      Remarque : Le tableau résultant des mesures de l’ONL est utilisé pour créer un terrain en 3D représentant l’épaisseur de l’ONL. La position des étriers sur l’axe x de permettent de replot le graphique en plaçant le nerf optique à l’origine (0) sur l’axe x. L’axe des y sont tracée à l’aide du nombre de b-scan et le nerf optique est ensuite utilisé pour définir le point de départ, ce qui permet de positionner correctement le nerf optique à l’origine sur l’axe y. Identifier le nerf optique dans chaque ensemble de données permet de suivi images doivent être alignés de manière fiable.
  3. Cartographie de l’étendue du site d’injection sur l’image du fond de œil
    1. Effectuer la post injection volume rectangulaire OCT pour confirmer la réussite de l’injection. Suivre la méthode décrite dans 3.6.
    2. Utilisez la fonctionnalité de l’étrier dans le logiciel afin d’identifier le point d’inflexion à la frontière du décollement de la rétine d’un certain nombre de b-scans s’étendant sur toute l’image du OCT. Utilisez la méthode pour ouvrir les étriers décrits dans 4.1.4.
    3. Enregistrer les images de fond d’oeil avec l’emplacement mappé de l’OCT b-scan et la position correspondante d’étrier sur l’image du fond de œil, ce qui correspond à sa situation.
    4. Compilez toutes les images de fond d’oeil en une image composite, y compris les positions de l’étrier, qui se traduit par une carte précise de l’emplacement de l’injection sur l’image de fond d’oeil (par exemple dans la section résultats représentant, Figure 5A).

5. intraoculaires Injections

Remarque : Plus de détails sur l’utilisation de la RIS sont détaillés dans une récente étude23.

  1. Préparation des aiguilles à injection verre
    1. Autoclave capillaire tubes avec des filaments en petits lots, en utilisant le programme de séchage.
    2. Utiliser une pipette puller et la mise en place un programme qui va produire une bulle de verre avec l’angle de la plus forte et un diamètre de l’ordre de 2 à 5 µm.
      Remarque : Un programme de step échantillon 5 qui produit des aiguilles efficaces sur notre extracteur de pipette est indiqué dans le tableau 1.
    3. Rangez les aiguilles de verre tiré dans un pipette stérile aiguille bocal à température ambiante.
  2. Remplir l’aiguille d’injection de la solution recherchée pour injection
    1. Monter l’aiguille sur le porte-aiguille, laissant environ 5/8" dépassent l’extrémité du porte.
      Remarque : A moins de 5/8" rendra difficile atteindre à distance la solution injectable pour remplir l’aiguille, car le porte-aiguille ne rentre pas facilement dans l’ouverture des tubes de 0,2 mL. En outre, avoir l’aiguille faire saillie de plus de 5/8" provoque significativement plus grande oscillation ou une précession de la pointe, complique l’imagerie en temps réel depuis la pointe quitte le plan focal ou le champ de vision (FOV), tout en essayant de piquer les yeux.
    2. Préparer la solution injectable dans un tube stérile 0,2 mL. Ajouter un 01:10 dilution du sulfate de fluorescéine stérile (10 mg/mL dans du PBS 1 x) à la solution d’injection pour obtenir une concentration finale de fluorescéine à 1 mg/mL.
      Remarque : La teinture exacte utilisée est spécifique à l’utilisateur et peut être quelque chose qui est non toxique et visible à le œil nu sous un éclairement lumineux blanc pour faciliter le positionnement précis de la pointe de l’aiguille au niveau de la RPE et espace sous-rétinienne.
    3. Visualiser l’aiguille à travers le microscope stéréo tout en utilisant les boutons de commande de la micromanipulateur 3 axes pour positionner l’aiguille afin qu’il soit aligné avec le centre du tube contenant la solution injectable à utiliser pour le remplissage de l’aiguille.
    4. Attentivement conduire l’extrémité de l’aiguille dans le tube de 0,2 mL jusqu'à ce que la pointe de l’aiguille est immergée dans le liquide. Dresser le volume souhaité de liquide d’injection (p. ex. 1 µL) dans l’aiguille nécessaire pour une seule injection. Maintenir la solution restante dans le tube placé dans la glace.
  3. Préparation de l’animal pour injection
    Remarque :     le microscope RIS est maintenu propre et est un système sans contact. La plaque chauffante est recouvert d’un tampon absorbant propre et aiguilles sont stérilisés à l’autoclave avant d’être tiré. Après qu’ils sont tirés par une bande de métal chauffée auto stérilisante, elles sont conservées dans une enceinte fermée stérilisée, conçue pour tenir les aiguilles de verre tiré. Les aiguilles sont contrôlés uniquement à l’aide de mains gantées et soins sont utilisé pour éviter de toucher la pointe de l’aiguille lors de le monter dans le support. Les solutions injectées sont préparées en utilisant une technique stérile et sont testées pour la contamination par un échantillon de la préparation de virus sur plaques de gélose LB des stries et incuber pendant la nuit à 37 ° c.
    1. Peser l’animal (g) afin de déterminer la dose appropriée de l’anesthésique analgésique.
    2. Administrer les anesthésiques (solution de 2,5 % d’alcool dans la mémoire tampon 2,2,2-tribromoethyl (Avertin)) par injection intrapéritonéale (IP).
    3. Appliquer immédiatement les anticholinergiques (par exemple, cyclopentylate) pour les deux yeux pour dilater les pupilles.
    4. Tailler les moustaches de l’animal et le numéro de l’animal à l’aide de perforation d’oreille ou une autre méthode.
    5. Lavez le œil et la zone environnante avec betadine diluée.
      Remarque : Évitez toute solution autour du nez, car cela pourrait provoquer la noyade accidentelle.
    6. Placez votre souris sur le coussin chauffant, maintenu à 39 ° c, dans argile souris porte-le pré-moulés modeler à l’oeil pour être injecté vers l’aiguille.
    7. Assurez-vous que la souris ne répond pas à l’aide d’un test du pincement de la patte.
  4. Effectuer l’injection sous-rétinienne
    1. Utiliser une paire de pinces stériles iris émoussé pour induire doucement proptose du globe en plaçant l’extrémité de la pince à 7 et 10:00 postes sur les paupières tout en poussant ouverte et vers le bas en même temps.
    2. Utilisez la pince pour amadouer les paupières sous le globe oculaire pour le garder hors de la prise au cours du processus d’injection.
      Remarque : Animaux âgés de 10 à 14 jours souvent tiendra le œil de la prise plus facilement que les animaux plus âgés.
    3. Diriger la pointe de l’aiguille d’environ 1 à 1,5 mm sous le bord de la limbe cornéen et conduire prudemment dans le œil à travers la conjonctive jusqu'à ce qu’il crée une dépression sclérale comme l’aiguille pénètre dans le tissu de la sclérotique et permettant la manipulation de le œil.
    4. Faites tourner le regard vers le bas avec le micromanipulateur à visualiser la dépression sclérale à travers la pupille dilatée avec le microscope stéréo de RIS.
    5. Appliquez une goutte de gel ophtalmique stérile ou 1 x solution de PBS et recouvrir d’un lamelle couvre-objet stérile.
    6. Mettre l’accent sur la dépression sclérale créée par la pointe de l’aiguille (2 à 5 µm) et continuer l’aiguille avancer jusqu'à ce qu’un pic des formes rétine au point d’injection.
    7. Tourner l’aiguille à l’aide de la titulaire jusqu'à ce que la pointe des alésages à travers la sclérotique et la fluorescéine dans l’aiguille est visible sous la rétine dans le voisinage immédiat de la monocouche de cellules RPE.
    8. Promenade de la pointe de l’aiguille est tangent à la planète et puis activer la pompe d’injection avec le commutateur de pédale de pied.
    9. Après la remise le volume souhaité (0,5-1 µL) à l’espace sous-rétinienne, retirer l’aiguille et vérifier si la cloque est stable et que le liquide ne coule pas hors du site d’injection, qui est le premier critère d’une injection réussie.
      Remarque : Maintien d’un bon diamètre (2 à 5 µm de diamètre) est essentielle pour éviter une fuite de site d’injection.
    10. Placez l’animal sur la plate-forme d’imagerie de l’instrument d’OCT. Suivre les indications pour HR-SD OCT Imaging pour enregistrer une image de volume rectangulaire.
    11. Confirmer que le fluide injecté est situé dans l’espace sous-rétinienne et enregistrer les images pour déterminer l’étendue de la cloque.
    12. Retirez l’animal du support et appliquez une quantité suffisante d’onguent antibiotique pour les yeux injectés.
    13. Placez l’animal sur un coussin chauffant jusqu'à ce qu’il récupère complètement, puis placez-le dans la cage originale d'où elle vient.
      Remarque : Nos animaux sont généralement injectés avant le sevrage, les animaux doivent donc être renvoyé à la cage avec la mère.
  5. L’étendue de la cloque sous-rétinienne OCT instrument logiciel outils de cartographie.
    1. Obtenir une image de OCT volume rectangulaire, à l’aide des méthodes décrites précédemment, de la cloque et positionnez-le afin d’inclure un point de repère reconnaissable au sein de le œil comme l’ONH.
      Remarque : 90 b-scans d’enregistrement fonctionne bien pour cartographier la cloque, mais pourrait être utilisé selon la résolution souhaitée.
    2. Ajouter un seul étrier à la figure et placez-le sur le point d’inflexion où la rétine se détache de la RPE et la choroïde.
      Remarque : Le logiciel mappe automatiquement un point correspondant à une ligne sur l’image de fond de œil représentant l’étrier et le b-scan en cours d’évaluation.
    3. Capturer l’écran après mise en place des étriers d’et compiler les images pour mapper efficacement la frontière de la cloque d’injection sur l’image du fond de œil, ce qui correspond précisément au site d’injection. Enregistrez l’image compilé pour référence aider à localiser les régions d’intérêt au cours du suivi d’imagerie.
      Remarque : Sinon, les données de l’étrier peuvent être sauvées, respecté et tracées à l’aide d’une méthode similaire pour traçage des séries de données 3D de l’épaisseur de l’ONL.
  6. Injection intravitréenne
    1. Placez la pointe de l’aiguille en utilisant une approche chirurgicale similaire en injection rétinienne sub, sauf que l’aiguille est entraîné entièrement par le biais de la sclérotique à la pars plana environ 0,25 mm derrière le limbe cornéen et dans le corps vitré.
    2. Après le placement de l’aiguille, appliquer le pouls de l’injection avec la pédale.
      Remarque : Une diffusion rapide du colorant fluorescéine dans tout le corps vitré de le œilleton est observée, remplissant l’ouverture de la pupille dilatée de fluorescence.

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Résultats

Évaluer la présence, la taux et l’homogénéité de dégénérescence rétinienne externe modèle
Mesures de l’ONL ont été enregistrés entre l’OPL et l’orme, définissant les limites de l’ONL en utilisant l’outil de l’étrier fourni dans le logiciel de l’instrument. Le but était de cartographier la progression de la dégénérescence rétinienne externe dans un modèle murin de PACA partiellement humanisés. Des images comparables d’un contrôle...

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Discussion

HR-SD-OCT fournit une méthode simple pour la caractérisation des modèles animaux de maladies humaines afin de déterminer leur utilité dans l’essai thérapeutique possible. La capacité de rapidement et sûrement caractériser un modèle animal de la maladie humaine est essentielle pour le processus de découverte de médicaments thérapeutiques (par exemple, thérapie de remplacement de gène, ribozyme ou shARN défiant thérapie génique, la thérapie génique combinée). HR-SD-OCT fournit une méthode s...

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Déclarations de divulgation

Relations commerciales : MCB : None ; JMS : aucun. La rétine imaging system (RIS)23 utilisée dans cette étude est un dispositif novateur d’utilisation importante à n’importe quel groupe qui cherchent à mener des études de livraison de thérapie génique chez des souris, rongeurs ou petits animaux. Bien que les auteurs n’aient aucun conflit de déclarer à l’égard de cet appareil en ce moment, l’Université de SUNY Buffalo - et l’Administration des anciens combattants ont des droits dans la propriété intellectuelle et peut chercher à commercialiser cet instrument à l’avenir.

Remerciements

Ce matériel est basé sur le travail soutenu, en partie, par le ministère des anciens combattants (VA), le Veterans Health Administration, le Bureau de recherche et le développement (laboratoire de recherche biomédicale et le développement) (Bourse de mérite VA 1I01BX000669). JMS travaille, en partie, comme médecin-chercheur, ophtalmologie, VA WNY ; MCB est employé, en partie, par VA WNY. L’étude a été menée à et financée en partie par le système de santé des anciens combattants Administration Western New York (Buffalo, NY). Contenu ne représente pas les vues du ministère des anciens combattants ou le gouvernement des États-Unis. Également pris en charge, en majeure partie, par le NIH/NEI R01 grant EY013433 (PI : JMS), NIH/NEI R24 accorder EY016662 (UB Vision Infrastructure Center, PI : M abattage, directeur - biophotonique Module : JMS), une subvention sans restriction pour le département d’ophtalmologie/Université à Buffalo de la recherche pour prévenir la cécité (New York, NY) et une subvention de la Fondation Oishei (Buffalo, NY). Nous reconnaissons le don de la lignée transgénique desP347S RHOhC1 et la souris de l’exon 1 knockout RHO de Dr Janis Lem (Tufts New England Medical Center, Boston, MA) et le don du transgène modèle NHR-E à l’état hétérozygote sur le la souris exon 2 RHO knockout fond de Drs G. Jane Farrar et Peter Humphries (Trinity College, Dublin, Irlande).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL6 (J)Jackson Laboratories664
N129R-N/AN/A
2HRho 1T/1TN/AN/A
Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT)Bioptigen90-R2200-U1-120.  
Retinal Imaging System (RIS)In-houseN/A
Stemi 2000C MicroscopeZeiss000000-1106-133
P-97 Flaming/Brown micropipette pullerSutter Instrument Cop-97
MMN-33 micro manipulator Narishige USAMMN-33
PLI-100  micro injectorHarvard Apparatus64-1736
Micropipette Holder (Rotating)In-houseN/A
Micropipette Storage ReceptacleWorld Precision Instruments Inc.E210
 Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, Harvard Apparatus30-0053
2,2,2-TribromoethanolSIGMA AldrichT48402-25G
Tert-amyl AlcoholSIGMA Aldrich240486-100ML
Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1%Akorn Inc.NDC 17478-215-05
GonioviscBioVision LimitedNDC 17238-610-15
Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP  2%Akorn Inc.NDC 17478-097-10
Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1%PerigoNDC 45802-046-35
Systane UltraAlcon Laboratories, Inc.9006619-1013
Tetracaine HydrochlorideBausch and LombNDC 24208-920-64
Ophthalmic Solution, USP 0.5%Bausch and LombNDC 24208-920-64
DPBSGibco Life Technologies14190-136
Virus PreparationsViGene /UNCN/A
Gold nanorodsNANOPARTzD12M-850-1.75
Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25%Akorn Inc.NDC 17478-250-20
CoverslipsFisher Scientific12-548-A
ForcepsMilton18-825
Needles 30 guageBeckton Dickenson  W11604
SyringesBeckton Dickenson  309659
Bioptigen software PackageBioptigenN/A
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5%Akorn Inc.NDC 17478-263-12
Windows ExcelMicrosoftN/A
Adobe IllustratorAdobe 
ScaleMettler
ScissorsWorld Precision Instruments
Ear punchNat’l band
CL 100 Light sourceWelch AllynCL100
Nitrogen GasJackson Welding SupplyN/A
Heated Water bathNeslabRTE-140
Heating plateIn HouseN/A
Heating matCincinnatti Sub Zero273
Clay mouse holderPlast.i.clay American Art Clay Co.N/A
BetadineMedLine NDC53329-938-06
Cotton Tip ApplicatorsAmerican Health ServiceCtag
EtOH 70%Fisher ScientificBP2818-100
Gloves NitrileVWR89038-272
Diagnosys ERG Color Dome instrumentDiagnosys Inc.D125
Contact lensesIn-houseN/A
Diagnosys SoftwareDiagnosys Inc.N/A
Origin 6.1 softwareOriginLab Corp.N/A
Reference electrodesOcuscienceF-Thread Electrode (DTL) 24”

Références

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