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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui dimostriamo un nuovo approccio all'utilizzo di tomografia a coerenza ottica spectral-domain ad alta risoluzione (HR-SD-OCT) per assistere la consegna degli agenti di terapia genica nello spazio subretinal, valutare la sua copertura area e caratterizzano la vitalità del fotoricettore.

Abstract

HR-SD-OCT è utilizzata per monitorare la progressione della degenerazione dei fotorecettori in modelli murini dal vivo, valutare la consegna degli agenti terapeutici nello spazio subretinal e per valutare la tossicità e l'efficacia in vivo. HR-SD-OCT utilizza nel vicino infrarosso (800-880 nm) e ha ottica specificamente progettato per l'unica ottica dell'occhio del mouse con risoluzione assiale sub-2 micron. Modelli murini transgenici di degenerazione retinica esterna (fotorecettori) e i controlli erano imaged per valutare la progressione di malattia. Vetro tirato microaghi erano usati per fornire sub retiniche iniezioni di virus adeno-associato (AAV) o nanoparticelle (NP) tramite un approccio trans-sclerale e trans-coroideale. Attento posizionamento dell'ago nello spazio subretinal è stato richiesto prima di un'iniezione di pressione calibrata, che trasporta il fluido nello spazio retinico sub. Tempo reale subretinal chirurgia è stato condotto su nostro retinica imaging system (RIS). HR-SD-OCT ha dimostrato la progressiva degenerazione retinica uniforme dovuto l'espressione di un tossico rodopsina mutante umano mutante (P347S) (RHOP347S) transgene in topi. HR-SD-OCT permette rigorosa quantificazione di tutti gli strati della retina. Strato nucleare esterno (ONL) del fotoricettore e spessore segmento esterno (OSL) misure di lunghezza si correlano con la vitalità dei fotorecettori, degenerazione o salvataggio. Il sistema di consegna RIS consente la visualizzazione in tempo reale delle iniezioni subretinal in neonatale (~ P10-14) o topi adulti e HR-SD-OCT immediatamente determina il successo di consegna e mappe estensione areale. HR-SD-OCT è un potente strumento che può valutare il successo della chirurgia subretinal in topi, inoltre a misurare la vitalità di fotorecettori in vivo. HR-SD-OCT consente anche di identificare coorti uniforme animale per valutare l'entità della degenerazione retinica, la tossicità e soccorso terapeutico in studi di ricerca di terapia genica preclinici.

Introduzione

I ricercatori stanno sviluppando terapie geniche per una varietà di malattie degenerative della retina e della retina con la speranza di tradurre approcci terapeutici in trattamenti per la malattia umana1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. tempo dominio o tomografia a coerenza ottica dominio spettrale (SD-OCT) è stata utilizzata per indagare gli aspetti di degenerazione retinica esterna in modelli murini specifici di malattia12,13,14 . HR-SD-OCT non, tuttavia, è stato ampiamente utilizzato nel contesto della valutazione di modelli murini di ottimizzazione per determinare il tasso e l'omogeneità spaziale di degenerazione retinica, o nel contesto della valutazione preclinica di gene base terapeutica, ad esempio, a valutare l'estensione spaziale di vettore consegna8,15,16, tossicità o salvataggio. Una volta che un modello del topo è completamente caratterizzato, i dati di HR-SD-OCT possono servire come una risorsa informativa e affidabile per misurare l'impatto di terapeutica di esercitare tossicità in modelli murini di degenerazione retinica17o salvataggio. Molti gruppi sono tramite iniezione subretinal come metodo di consegna del vettore grazie alla sua efficienza alle transducing fotorecettori e cellule del pigmento retinico epitelio (RPE). Tuttavia, questo rimane un metodo difficile da padroneggiare, dato che essa viene in genere eseguita dalla chirurgia mano libera dalla superficie cornea e spesso è irto di cataratta, emorragia e le separazioni retiniche non intenzionali che accadono semplicemente tramite manipolazione del posteriore vitreo. Molti gruppi ancora tentano subretinal iniezioni ciecamente e consegnare il virus utilizzando iniezioni manuali con diametro relativamente grande in acciaio inox aghi (34G)8,17,18,19 ,20,21,22e alcuni usi tomografia a coerenza ottica (OCT) imaging per confermare la corretta consegna del vettore al retina8,17, 20 , 22. alcuni miglioramenti nel metodo recentemente sono state descritte usando gli aghi su microscala, guidati da un micromanipolatore22.

Vi presentiamo un approccio integrato che agevola il posizionamento dell'ago e le iniezioni sono facilitate da un oftalmoscopio stereo diretto personalizzato progettato in laboratorio specificamente per la visualizzazione all'interno dell'occhio piccolo del mouse17, 23. l'uso di micro aghi di vetro tirato in combinazione con il micromanipolatore stereotassiche forniscono un miglior controllo del posizionamento dell'ago con alcun taglio chirurgico giù richiesto (vale a dire, attraverso la congiuntiva e del tessuto connettivo) prima di iniezione. L'uso della pressione regolata iniettore micro aiuta a consegnare volumi di iniezione coerente, e l'iniezione può essere fatto con maggiore stabilità, precisione e molto più lenta di iniezioni manuali eseguite da una siringa portatile, diminuendo in tal modo la avvenimento di iniezione bolla nell'occhio. L'ago più piccolo aiuta a prevenire perdite dopo ritiro di ago perché il percorso è autosigillante. Per valutare la portata dell'iniezione/consegna, molti gruppi investigativi si basano sulla ricerca e la valutazione dell'estensione area di fluorescenza verde avanzata espressione della proteina (EGFP) nella retina (costrutto di espressione consegnato dal vettore) all'estremità sperimentale punto (eutanasia) per confermare il successo iniezioni11,19,20,24. Questo approccio (che non utilizzano OCT) per verificare il successo chirurgico rifiuti una quantità enorme di risorse in tempo chirurgico procedurale e gli animali, dato che tutti gli animali con guasti chirurgici (sconosciuti) devono essere mantenuti, seguita con misure ripetitive fino al eutanasia e occhio vendemmia (quando EGFP è misurata). Conferma della posizione di iniezione nella retina può essere migliorata utilizzando HR-SD-OCT per dimostrare che l'iniezione è situato tra gli strati corretti della retina (cioè lo spazio subretinal). HR-SD-OCT è utilizzabile anche per delineare immediatamente tentativi infruttuosi (guasti chirurgici) per identificare le variabili rilevanti in tempo reale chirurgico per migliorare l'approccio. Abbiamo trovato che HR-SD-OCT fornisce numerosi vantaggi nel gene preclinici terapia studi consentendo la rapida valutazione quantitativa della degenerazione retinica esterna, consentendo l'identificazione/abbattimento di animali di studio che non soddisfano i criteri sperimentali ( ad esempio, iniezione subretinal non corretto) e a dirigere la formazione immagine di follow-up nella regione dell'occhio dove il vettore è stato consegnato (dove è più probabile effetto preclinico) così come le aree dove non è stato recapitato vettoriale controlli. Dal suo sviluppo, l'uso di SD-OCT ha continuato ad essere accettati e utilizzati da ricercatori di oftalmologia ed è ora considerato lo standard di imaging retinico in studi scientifici retinici in mouse o roditore modelli13,25. HR-SD-OCT e le sue capacità di software sono stati utilizzati in modi unici integrati per portare avanti l'obiettivo di successo quantitativa di terapia genica in modelli murini in ogni fase del processo, tra cui selezione modello animale, caratterizzazione di degenerazione nella vostra modelli di malattia, consegna terapeutico, mappatura di consegna del vettore e la valutazione di efficacia/tossicità. L'uso di HR-SD-OCT permette per la scoperta di nuovi farmaci più efficiente ad ogni livello del processo. Qui descriviamo questi approcci che vengono utilizzati nel nostro programma di RNA Drug Discovery.

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Protocollo

Protocolli di animali erano esaminati e approvati dalle commissioni di utilizzo VA WNY HCS e dall'Università di Buffalo-SUNY e istituzionali Animal Care. Gli animali sono stati utilizzati secondo le disposizioni dell'associazione per la ricerca in Oftalmologia (ARVO) e la visione e la dichiarazione di Helsinki.

1. Mouse modelli

  1. Identificare i modelli di mouse da valutarsi includendo i controlli.
    Nota: Imaging è stata eseguita per un C57BL/6(J), mWT hC1/hC1 / / / mWT, un modello di degenerazione retinica parzialmente umanizzato del topo omozigotico per alleli mutanti umani hC1P347S di RHOil wild-type (WT) mouse RHO+ + genotipo26 , 27, hC1 x BL/6(J), un modello parzialmente umanizzato con una singola copia dell'allele del mutante umano RHOP347S hC1 sul mouse WT RHO+ + genotipo (hC1 /-/ / mWT/mWT) (ottenuta incrociando mWT hC1/hC1 / / / mWT con (C57BL/6 Topi J)). Il sopra pigmentosa dominante autosomal di retinite (adRP) modelli sono sullo sfondo C57BL/6(J). Un modello del mouse che è omozigotico per due copie del gene WT RHO umano del mouse sfondo knockout RHO era anche usato28,29. Questa linea è sullo sfondo 129Sv. Quando questa riga è stata attraversata con un ko di RHO del mouse sullo sfondo 129Sv, una singola dose di umana RHO si verifica sul mouse RHO sfondo.
  2. Mantenere gli animali seguendo le condizioni pertinenti al disegno sperimentale.
    Nota: Gli animali sono stati mantenuti in unità medica veterinaria (VMU) presso il VA WNY HCS. Topi sono stati alimentati lab standard chow e coltivati sotto 12 h:12 h luce: cicli scuri con lavagna luminosa fluorescente morbido bianco luci con circa 300 lux a livello della gabbia a circa 72 ˚ f.

2. Mouse Eye Gel

  1. Preparare il gel ottico utilizzato per imaging retinico30 e procedure chirurgiche.
  2. Combinare 2 mg/mL w/v ad alto peso molecolare (4 x 106 g/mol carbomer sterile 1 x soluzione salina tampone fosfato (PBS).
  3. Mescolare a temperatura ambiente fino a quando il gel forma un gel viscoso otticamente trasparente.
  4. Trasferire il gel in piccole bottiglie sterili e centrifugare in una centrifuga da tavolo oscillante di benna a 350 x g per rimuovere le bolle d'aria intrappolate.
  5. Applicare il gel direttamente alla cornea per creare un'interfaccia tra la cornea di mouse e un vetro di copertura premium (18 x 18 mm).

3. HR-SD-OCT Imaging

  1. Vedere il dispositivo HR-SD-OCT (Figura 1).
  2. Pesare l'animale per determinare la corretta dose di anestetico. Anestetizzare il mouse usando 25 µ l/g del peso corporeo della soluzione 2,5% di buffer 2,2,2-tribromo alcool (Avertin) soluzione tramite l'iniezione intraperitoneale (IP), quindi aggiungere che il collirio per dilatare le pupille dopo che l'animale è immobilizzato.
  3. Confermare che l'animale è anestetizzato completamente da un pizzico di punta ed essere certi che l'animale non reagisce.
  4. Tagliare i baffi e posizionare il mouse sulla slitta HR-SD-OCT.
  5. Posizione dell'occhio del mouse direttamente davanti all'obiettivo di copricapo e manipolare i controlli di fase fino a quando la cornea e l'iride si trovano. Mantenere la cornea idratata applicando le lacrime artificiali.
    Nota: I micromanipolatori di regolazione fine sulla slitta HR-SD-OCT vengono utilizzati per posizionare il mouse in modo tale che l'apertura della pupilla è centrato e orientato. Il copricapo ottico allora è avanzato fino a quando la retina diventa visibile e l'animale è ulteriormente regolato per ottenere la migliore immagine possibile.
  6. In primo luogo, aprire il programma software "Mouse" e fare clic su "paziente/esame". In secondo luogo, fare clic su "Aggiungi paziente" e immettere le informazioni pertinenti per identificare l'animale nella finestra del nuova paziente e "salvare e uscire". In terzo luogo, fare clic su "Aggiungi esame" seguita da "inizio esame". In quarto luogo, cliccare su "Aggiungi scansione personalizzata" e selezionare "volume rettangolare", scegliete OD e OS per l'occhio essere imaged, quindi fare clic su "Aggiungi esame". Infine, avviare con l'obiettivo dello strumento e posizionamento dell'animale per ottenere la regione di interesse. Dopo trovando la regione desiderata, rimuovere il liquido in eccesso dalla superficie dell'occhio usando un cotone sterile con punta applicatore appena prima dell'acquisizione dell'immagine al fine di migliorare ulteriormente la qualità dell'immagine, quindi fare clic su "avvia istantanea", e se si ottiene una buona immagine, fare clic su "salvare scansione".
    Nota: Parametri tipici per immagini HR-SD-OCT rettangolari sono 900 a-scansioni/b-scan e b-scansioni/immagine 90. Immagini acquisite sono 1,4 x 1,4 mm. La regione della retina imaged dipende l'esperimento specifico, ma la maggior parte delle immagini sono centrate sulla testa del nervo ottico (ONH).

4. valutare la presenza, tasso e l'uniformità delle degenerazioni retiniche esterno modello

  1. Valutazione del modello di degenerazione retinica esterna di HR-SD-OCT
    1. Ottenere gli animali con un ampio spettro di età per il controllo e soggetti sperimentali per valutare la presenza, la frequenza e l'uniformità di degenerazione retinica esterna.
    2. Eseguire imaging HR-SD-OCT sugli animali più in ogni età da entrambi coorti (malattia e normale). Utilizzare il metodo descritto in 3.1.6 per ottenere le immagini OCT.
      Nota: I dati possono essere raccolti da un grande gruppo degli animali tutti in una volta, che hanno distribuito compleanni che abbracciano un ampio periodo di tempo (1 anno), o un piccolo gruppo di animali può essere utilizzato per raccogliere più immagini per un lungo periodo di tempo (1 anno) per ottenere risultati simili.
    3. Aprire un'immagine di volume rettangolare HR-SD-OCT registrata e identificare il prima b-scan da misurare (idealmente includerà il ONH o altro punto di riferimento identificabile) dall'insieme di immagini. Ingrandire l'immagine per riempire lo schermo utilizzando la funzionalità di zoom nel software.
    4. Aprire il numero desiderato di pinze facendo clic destro sull'immagine del b-scan e poi cliccando su "Pinze" e infine su come molti calibri come desiderato (essi sono numerati da 1 a 10). Garantire che le pinze presentarsi nell'angolo inferiore destro dell'immagine. Utilizzando la funzionalità di "Configurare pinza", assegnarli tutti come "verticale" nella colonna di blocco di angolo e accendere la "Display pinza posizione" per facilitare il posizionamento uniforme in tutta la retina e infine fare clic su Applica.
      Nota: 1 pinzast deve essere posizionata sul lato sinistro dell'immagine durante l'elaborazione l'oculus dexter occhio destro (OD) e l'1st pinza deve essere collocato sul lato destro dell'immagine durante l'elaborazione di immagini oculus sinistre (OS) occhio di sinistra. Questo provoca una nasale all'orientamento temporale di tutti i dati per entrambi gli occhi destro e sinistro durante la stampa.
    5. Utilizzando il mouse del computer, spostare ciascuna pinza nella posizione desiderata (distanza 2,0 mm) attraverso il b-scan, assicurandosi di posizionare una pinza al centro della testa del nervo ottico, in b-scan immagini che includono (impostare questa pinza a zero). Quindi utilizzare il mouse per fare clic e trascinare la pinza alla lunghezza per estendere l'area di interesse. Fissato arbitrariamente pinze che non misurabili regioni della b-scansione alla massima lunghezza di sovrapposizione e ignorare durante l'analisi dei dati.
    6. Misurare lo spessore ONL utilizzando gli strumenti di pinza, posizionando la parte superiore della pinza la membrana di limitazione esterna (olmo) e parte inferiore della pinza nella parte inferiore dello strato plexiform esterno (OPL). Ripetere questa operazione per ogni pinza attraverso la retina a incrementi di 0,2 mm. Salvare le misurazioni.
    7. Dopo tutte le pinze sono state posizionate e regolate alla dimensione, fare clic con il pulsante destro sull'immagine e scegliere "Salva dati pinza".
    8. Ripetere le misurazioni su b-scansioni successive (ogni 10th scansione funziona bene) dallo stesso volume rettangolare immagine OCT che abbracciano l'intera retina da inferiore a superiore regioni. Pinze dovrebbero rimanere aperta e nella stessa posizione nell'asse x. Regolare la lunghezza delle pinze senza spostarli in direzione X.
    9. Aprire il salvataggio file di dati facendo clic sull'icona di file di piccole dimensioni accanto la trasformati b-scansione immagine e clicca su "Vai ai dati". Fare clic su "modifica data per organizzare i file in ordine basato su tempo risparmiato e aprire tutti i file per ogni b-scan misurato.
    10. Compilare i dati grezzi da ogni b-scansione in un unico file in ordine dal più basso al più alto basato sul numero di telaio. Selezionare le colonne di dati tra cui "Nome di pinza", "Lunghezza" e "Centro X".
    11. Assicurarsi che il centro X è lo stesso per tutti i b-scan misurato per ogni volume rettangolare OCT immagine elaborata. Elimina tutti i dati dai calibri che non erano abituati a registrare misurazioni e impostare la pinza che si trova al centro della testa del nervo ottico a zero.
    12. Tracciare i dati per X vs più set di dati di Y per ottenere una funzione 3D trama per tracciare lo spessore complessivo della ONL o altro misurato strato retinico.
    13. Confrontare le misure ONL tra controllo e animali da esperimento con età corrispondente per determinare il tasso e l'omogeneità di qualsiasi potenziale degenerazione retinica.
    14. Ripetere il processo per misurazioni di OSL utilizzando le stesse immagini b-scan. Seguire la stessa metodologia utilizzata per misurare la ONL, ad eccezione di immissione le pinze tra ELM e di Bruch membrana (BM).
      Nota: Nella sezione risultati rappresentante (Figura 3B) è riportato un esempio di come posizionare la pinza. Questo dovrebbe essere fatto su un'immagine ingrandita per diminuire l'errore.
    15. Ripetere l'analisi dei dati per più animali per ogni compleanno per entrambi sperimentale e coorti di controllo.
  2. Misurazione completa e mappatura 3D dello spessore ONL o OSL utilizzando lo strumento software di pinze
    1. Rivedere le immagini OCT di post iniezione e prendere nota di qualsiasi identificabili luoghi d'interesse, come il ONH o vasi sanguigni nella retina. Quindi posizionare il mouse per ottenere un follow-up SD-OCT dalla stessa regione e assicurarsi di includere i punti di riferimento stessi identificabili.
      Nota: Assicurarsi che la regione della retina imaged e coinvolti nella separazione retinica viene identificata nelle immagini post iniezione SD-OCT. Registrare un'immagine di volume rettangolare SD-OCT e salvarlo.
    2. Elaborare le immagini registrate come descritto in precedenza nei passaggi 4.1.3. per 4.1.14. Salvare i dati di pinza e trama come descritto sopra.
      Nota: La matrice risultante delle misurazioni ONL è utilizzata per creare una trama 3D raffigurante lo spessore ONL. La posizione delle pinze lungo l'asse x permettono di replot grafico ponendo il nervo ottico all'origine (0) lungo l'asse x. L'asse y viene tracciata utilizzando il numero di b-scan e il nervo ottico viene quindi utilizzato per definire il punto di partenza, che permette di posizionare correttamente il nervo ottico all'origine sull'asse y. Identificare il nervo ottico in ogni set di dati consente di follow-up immagini essere allineati in modo affidabile.
  3. Mappatura nella misura dell'iniezione sull'immagine del fondo
    1. Eseguire post iniezione volume rettangolare OCT per confermare il successo dell'iniezione. Seguire il metodo descritto 3.6.
    2. Utilizzare la funzionalità di pinza nel software per identificare il punto di flesso al bordo della retina distaccata da un certo numero di b-scan che abbracciano l'intera immagine OCT. Utilizzare il metodo per aprire pinze descritti 4.1.4.
    3. Registrare le immagini del fondo con percorso mappato del OCT b-scan e posizione di corrispondente pinza sull'immagine del fondo, che corrisponde alla sua posizione.
    4. Compilare tutte le immagini del fondo in un'immagine composita, incluse le posizioni di pinza, che si traduce in una mappa precisa del sito di iniezione, sull'immagine del fondo (esempio nella sezione risultati rappresentante Figura 5A).

5. intraoculare iniezioni

Nota: Dettagli sull'uso del RIS sono ulteriormente elaborate in un recente studio23.

  1. Preparazione di vetro aghi per iniezione
    1. Autoclave capillare tubi con filamenti in piccoli lotti, utilizzando il ciclo asciutto.
    2. Utilizzare una pipetta puller e messa a punto un programma che produrrà una punta di vetro con l'angolo più tagliente e un diametro nella gamma di 2-5 µm.
      Nota: Un programma di passaggio di campione 5 che prodotto efficaci aghi sul nostro estrattore pipetta è mostrato nella tabella 1.
    3. Conservare gli aghi di vetro tirato in un vaso di ago pipetta sterile a temperatura ambiente.
  2. Riempire l'ago per iniezione con la soluzione desiderata per iniezione
    1. Montare l'ago nel supporto dell'ago, lasciando circa 5/8" che si sporgono oltre l'estremità del supporto.
      Nota: A distanza inferiore a 5/8" renderà difficile raggiungere la soluzione di iniezione per riempire l'ago, perché il supporto dell'ago non si adatta facilmente nell'apertura di provette da 0,2 mL. Inoltre, avendo l'ago sporgere più di 5/8" risultati significativamente più grande oscillazione o precessione della punta, rendendo tempo reale imaging difficile dato che la punta lascia il piano focale o il campo visivo (FOV), durante il tentativo di bucare l'occhio.
    2. Preparare la soluzione per iniezione in una provetta sterile 0,2 mL. Aggiungere un 01:10 diluizione di solfato sterile della fluorescina (10 mg/mL in PBS 1X) per la soluzione di iniezione per ottenere una concentrazione finale di fluorescina a 1 mg/mL.
      Nota: L'esatto colorante usato è specifico per l'utente e può essere tutto ciò che è non tossico e visibile ad occhio nudo sotto illuminazione a luce bianca per facilitare il posizionamento preciso della punta dell'ago a livello del RPE e spazio subretinal.
    3. Visualizzare l'ago attraverso il microscopio stereo mentre usando le manopole di controllo del micromanipolatore di 3 assi per posizionare l'ago in modo che è allineato con il centro del tubo contenente la soluzione di iniezione per essere utilizzato per riempire l'ago.
    4. Guidare con attenzione la punta dell'ago nel tubo di 0,2 mL fino a quando la punta dell'ago è sommerso nel liquido. Aspirare il volume desiderato di iniezione liquido (ad es. 1 µ l) nell'ago necessaria per una singola iniezione. Mantenere la soluzione rimanente nel tubo messo in ghiaccio.
  3. Preparare l'animale per l'iniezione
    Nota:     il microscopio RIS è tenuto pulito ed è un sistema senza contatto. La piastra riscaldante è coperto con un tampone pulito adsorbente e gli aghi sono sterilizzati in autoclave prima di essere tirato. Dopo che sono tirati da una striscia di metallo riscaldata auto-sterilizzazione, sono tenuti in una camera sterile chiusa progettata per contenere aghi di vetro tirato. Gli aghi sono curati solo con le mani guantate e cura viene utilizzato per evitare di toccare la punta dell'ago mentre montarlo con il titolare. Le soluzioni iniettate sono preparate utilizzando una tecnica sterile e sono testate per contaminazione da striature un campione delle preparazioni virus su piastre di agar LB e incubarle tutta la notte a 37 ˚ c.
    1. Pesare l'animale (g) per determinare la dose appropriata di anestetico analgesico.
    2. Amministrare anestetico (soluzione al 2,5% di alcool nel buffer 2,2,2-tribromo (Avertin)) tramite l'iniezione intraperitoneale (IP).
    3. Applicare immediatamente le droghe anticolinergiche (ad esempio, cyclopentylate) in entrambi gli occhi per dilatare le pupille.
    4. Tagliare i baffi dell'animale e l'animale usando orecchio punch o altro metodo il numero.
    5. Lavare l'occhio e la zona circostante con betadine diluito.
      Nota: Evitare che qualsiasi soluzione intorno al naso, poiché ciò può comportare annegamento accidentale.
    6. Posizionare il mouse sul tappetino riscaldamento, mantenuto a 39 ˚ c, in tasca per mouse argilla di modeler pre-modellato con l'occhio deve essere iniettato verso l'ago.
    7. Assicurarsi che il mouse non risponde usando una prova di pizzico del piede posteriore.
  4. Esecuzione di iniezione subretinal
    1. Usare un paio di pinze sterili iris smussato per indurre delicatamente la proptosi del globo posizionando le punte della pinza alle 7 e 10 posizioni sulle palpebre mentre si spinge verso il basso e aperto allo stesso tempo.
    2. Utilizzare le pinze per persuadere le palpebre sotto il globo oculare a tenerlo fuori dalla presa di corrente durante il processo di iniezione.
      Nota: Animali 10 a 14 giorni di vita spesso tenere l'occhio dalla presa di corrente più facilmente di più vecchi animali.
    3. Dirigere la punta dell'ago circa 1-1,5 mm sotto il bordo del limbus corneale e guidare con attenzione nell'occhio attraverso la congiuntiva fino a quando crea una depressione sclerale come l'ago penetra nel tessuto della sclera e consente la manipolazione dell'occhio.
    4. Ruotare l'occhio verso il basso con il micromanipolatore visualizzare la depressione sclerale attraverso la pupilla dilatata con il microscopio stereo di RIS.
    5. Applicare una goccia di gel occhi sterile o 1 x soluzione PBS e coprire con un vetrino coprioggetto sterile.
    6. Concentrarsi sulla depressione scleral creata dalla punta dell'ago (2-5 µm) e unità l'ago avanti fino a un picco acuto delle forme retina al sito di iniezione.
    7. Ruotare l'ago utilizzando il titolare fino a quando la punta di fori attraverso la sclera e la fluoresceina nell'ago è visibile sotto la retina nelle immediate vicinanze del monostrato di cellule RPE.
    8. Guidare la punta dell'ago, quindi è tangente al globo e quindi attivare la pompa di iniezione con il pedale footswitch.
    9. Dopo che è stato consegnato il volume desiderato (0,5-1 µ l) per lo spazio subretinal, ritirare l'ago e controllare se la vescichetta è stabile e che il fluido non ci siano perdite fuori del sito di iniezione, che è il primo criterio di un'iniezione di successo.
      Nota: Mantenere un diametro di punta adeguata (2-5 micron di diametro) è fondamentale per evitare perdite dal sito di iniezione.
    10. Posizionare l'animale sulla piattaforma imaging dello strumento OCT. Seguire le indicazioni per HR-SD OCT Imaging per registrare un'immagine di volume rettangolare.
    11. Confermare che il liquido iniettato si trova nello spazio subretinal e salvare le immagini per la determinazione del limite della vescichetta.
    12. Rimuovere l'animale dal supporto e applicare un'ampia quantità di pomata antibiotica agli occhi iniettati.
    13. Metti l'animale su un blocchetto di riscaldamento fino a quando non recupera completamente, quindi inserire nuovamente la gabbia originale da dove venisse.
      Nota: I nostri animali sono solitamente iniettati prima dello svezzamento, pertanto gli animali devono essere restituiti alla gabbia con la madre.
  5. L'entità della vescichetta subretinal utilizzando strumenti di OCT strumento software di mappatura.
    1. Ottenere un'immagine di volume rettangolare OCT, utilizzando i metodi descritti in precedenza, della vescichetta e posizionarlo per includere un simbolo riconoscibile all'interno dell'occhio come la ONH.
      Nota: Registrazione 90 b-scan funziona bene per il mapping la vescichetta, ma poteva essere utilizzati a seconda della risoluzione desiderata.
    2. Aggiungere una singola pinza alla figura e posizionarlo presso il punto di flesso dove la retina si stacca dalla RPE e coroide.
      Nota: Il software esegue automaticamente il mapping di un punto corrispondente ad una linea sull'immagine del fondo che rappresenta la pinza e il b-scan in corso di valutazione.
    3. Catturare lo schermo dopo la disposizione delle pinze e compilare le immagini per mappare in modo efficace il bordo della vescichetta di iniezione sull'immagine del fondo, che associa proprio il sito di iniezione. Salvare l'immagine compilata per riferimento aiutare a localizzare le regioni di interesse durante la formazione immagine di follow-up.
      Nota: In alternativa, i dati di pinza possono essere salvati, rispettato e tracciati utilizzando un metodo simile per set di dati 3D plotting di spessore ONL.
  6. Iniezione intravitreale
    1. Posizionare la punta dell'ago usando un simile approccio chirurgico come iniezione retinica sub, tranne per il fatto che l'ago è guidato interamente attraverso la sclera a pars plana circa 0,25 mm dietro il limbus cornea e nel corpo vitreo.
    2. Dopo il posizionamento dell'ago, è possibile applicare l'impulso di iniezione con il comando a pedale.
      Nota: Si osserva una rapida diffusione del colorante fluoresceina in tutto il vitroso dell'oculare, riempiendo l'apertura della pupilla dilatata con fluorescenza.

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Risultati

Valutazione della presenza, tasso e uniformità del modello di degenerazione retinica per esterno
Misurazioni della ONL sono stati registrati dall'OPL a Olmo, definire i limiti di ONL utilizzando lo strumento pinza fornito nel software dello strumento. L'obiettivo era di mappare la progressione della degenerazione retinica esterna in un modello murino di adRP parzialmente umanizzato. Immagini comparabili da un C57BL/6(J) di controllo mouse e un mWT hC1/hC1 / / / modell...

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Discussione

HR-SD-OCT fornisce un metodo semplice per la caratterizzazione dei potenziali modelli animali della malattia umana per determinare la loro utilità nella prova terapeutica potenziale. La capacità di rapido e affidabile caratterizzano un potenziale modello animale della malattia umana è fondamentale per il processo di scoperta della droga terapeutica (ad es., sostituzione terapia genica, la terapia genica atterramento ribozima o shRNA, terapia genica combinato). HR-SD-OCT fornisce un metodo semplice, rapido e n...

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Divulgazioni

Rapporti commerciali: MCB: nessuno; JMS: nessuno. L'imaging system (RIS)23 utilizzato in questo studio di retinico è un nuovo dispositivo di notevole utilità per qualsiasi gruppo che cerca di condurre studi di consegna di terapia genica in topi, roditori o piccoli animali. Mentre gli autori non hanno nessun conflitto di dichiarare nei confronti di questo dispositivo in questo momento, l'Università di Buffalo - SUNY e il Veterans Administration dispone dei diritti di proprietà intellettuale e può cercare di commercializzare questo strumento in futuro.

Riconoscimenti

Questo materiale si basa su lavori sostenuta, in parte, dal Department of Veterans Affairs (VA), Veterans Health Administration, ufficio di ricerca e sviluppo (laboratorio ricerca e sviluppo biomedico) (Grant Merit VA 1I01BX000669). JMS è impiegato, in parte, come il personale medico-scienziato, oftalmologia, da WNY VA; MCB è impiegato, in parte, da VA WNY. Lo studio è stato condotto presso e in parte supportato da, il sistema del Healthcare di New York di Veterans Administration Western (Buffalo, NY). Contenuti non rappresentano le opinioni di Department of Veterans Affairs o di governo degli Stati Uniti. Supportati anche, in gran parte, di NIH/nia R01 concedere EY013433 (PI: JMS), NIH/nia R24 concedere EY016662 (UB Vision infrastruttura Center, PI: M macellazione, direttore - biofotonica modulo: JMS), una sovvenzione illimitata per il dipartimento di Oftalmologia/Università presso Buffalo da ricerca per prevenire la cecità (New York, NY) e una sovvenzione dalla Fondazione Oishei (Buffalo, NY). Riconosciamo il dono di hC1 transgenici RHOP347S linea e il mouse dell'esone 1 RHO knockout da Dr. Janis Lem (Tufts New England Medical Center, Boston, MA) e il dono del modello transgene NHR-E nella condizione eterozigotica sul esone 2 RHO knockout priorità bassa del mouse dalla d. ssa G. Jane Farrar e Peter Humphries (Trinity College, Dublino, IRE).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL6 (J)Jackson Laboratories664
N129R-N/AN/A
2HRho 1T/1TN/AN/A
Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT)Bioptigen90-R2200-U1-120.  
Retinal Imaging System (RIS)In-houseN/A
Stemi 2000C MicroscopeZeiss000000-1106-133
P-97 Flaming/Brown micropipette pullerSutter Instrument Cop-97
MMN-33 micro manipulator Narishige USAMMN-33
PLI-100  micro injectorHarvard Apparatus64-1736
Micropipette Holder (Rotating)In-houseN/A
Micropipette Storage ReceptacleWorld Precision Instruments Inc.E210
 Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, Harvard Apparatus30-0053
2,2,2-TribromoethanolSIGMA AldrichT48402-25G
Tert-amyl AlcoholSIGMA Aldrich240486-100ML
Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1%Akorn Inc.NDC 17478-215-05
GonioviscBioVision LimitedNDC 17238-610-15
Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP  2%Akorn Inc.NDC 17478-097-10
Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1%PerigoNDC 45802-046-35
Systane UltraAlcon Laboratories, Inc.9006619-1013
Tetracaine HydrochlorideBausch and LombNDC 24208-920-64
Ophthalmic Solution, USP 0.5%Bausch and LombNDC 24208-920-64
DPBSGibco Life Technologies14190-136
Virus PreparationsViGene /UNCN/A
Gold nanorodsNANOPARTzD12M-850-1.75
Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25%Akorn Inc.NDC 17478-250-20
CoverslipsFisher Scientific12-548-A
ForcepsMilton18-825
Needles 30 guageBeckton Dickenson  W11604
SyringesBeckton Dickenson  309659
Bioptigen software PackageBioptigenN/A
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5%Akorn Inc.NDC 17478-263-12
Windows ExcelMicrosoftN/A
Adobe IllustratorAdobe 
ScaleMettler
ScissorsWorld Precision Instruments
Ear punchNat’l band
CL 100 Light sourceWelch AllynCL100
Nitrogen GasJackson Welding SupplyN/A
Heated Water bathNeslabRTE-140
Heating plateIn HouseN/A
Heating matCincinnatti Sub Zero273
Clay mouse holderPlast.i.clay American Art Clay Co.N/A
BetadineMedLine NDC53329-938-06
Cotton Tip ApplicatorsAmerican Health ServiceCtag
EtOH 70%Fisher ScientificBP2818-100
Gloves NitrileVWR89038-272
Diagnosys ERG Color Dome instrumentDiagnosys Inc.D125
Contact lensesIn-houseN/A
Diagnosys SoftwareDiagnosys Inc.N/A
Origin 6.1 softwareOriginLab Corp.N/A
Reference electrodesOcuscienceF-Thread Electrode (DTL) 24”

Riferimenti

  1. Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
  2. Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations. Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).
  3. Seo, S., et al. Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).
  4. Molday, L. L., et al. RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12. Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).
  5. Pang, J. J., et al. AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).
  6. Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies. Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).
  7. Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).
  8. Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach. J. Vis. Exp. (118), e54808(2016).
  9. Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. Gene therapy for ocular angiogenesis. Clinical Science. 104, 561-575 (2003).
  10. Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy. Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).
  11. Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).
  12. Ruggeri, M., et al. In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).
  13. Berger, A., et al. Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494(2014).
  14. Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images. TVST. 4 (4), 9(2015).
  15. Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).
  16. Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J. Vis. Exp. (69), e4286(2012).
  17. Berger, A., al,, et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoSOne. 9 (5), 96494(2014).
  18. Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).
  19. Sarra, G. M., et al. Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus. Vision Res. 42, 541-549 (2002).
  20. Yan, Q. I., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).
  21. Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030(2015).
  22. Westenskow, P. D., et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247(2015).
  23. Butler, M. C., Sullivan, J. M. A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).
  24. Rolling, F., et al. Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography. Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).
  25. Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology. PLoS One. 9 (10), 111203(2014).
  26. Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).
  27. Brill, E., et al. A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).
  28. Olsson, J. E., et al. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron. 9, 815-830 (1992).
  29. Humphries, M. M., et al. Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene. Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).
  30. Hruby, K. Clinical examination of the vitreous body. Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).
  31. Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).
  32. Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).
  33. Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina. Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).
  34. Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes. Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).
  35. Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Vision Res. 48, 453-469 (2008).

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