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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier zeigen wir einen neuartigen Ansatz zur Verwendung von hochauflösenden spectral-Domain optische Kohärenztomographie (HR-SD-OCT) Lieferung der Gen-Therapie-Agenten in den subretinalen Raum zu unterstützen, beurteilen seine areal Abdeckung und Photorezeptor Vitalität zu charakterisieren.

Zusammenfassung

HR-SD-OCT wird genutzt, um das Fortschreiten der Degeneration der Photorezeptoren in live Mausmodellen überwachen, bewerten die Lieferung von Therapeutika in den subretinalen Raum und Toxizität und Wirksamkeit in Vivozu bewerten. HR-SD-OCT in der Nähe von Infrarot-Licht (800-880 nm) verwendet und hat Optik speziell für die einzigartige Optik des Auges Maus mit Sub-µm-2 axiale Auflösung ausgelegt. Transgenen Mausmodellen der äußeren Netzhaut (Photorezeptoren) Degeneration und Steuerelemente wurden abgebildet, um das Fortschreiten der Erkrankung zu bewerten. Gezogenem Glas Mikronadeln wurden verwendet, um Sub retinalen Injektionen von Adeno-assoziierte Virus (AAV) oder Nanopartikeln (NP) über einen Trans-skleralen und Trans-choroidale Ansatz liefern. Sorgfältige Positionierung der Nadel in den subretinalen Raum bedurfte es vor einem kalibrierten Druck Injektion, die Flüssigkeit in den Sub-Netzhaut-Raum liefert. Real-Time subretinalen Chirurgie wurde auf unserer Netzhaut imaging-System (RIS) durchgeführt. HR-SD-OCT demonstriert schrittweise einheitliche Netzhautdegeneration durch Ausdruck einer toxischen mutierten menschlichen mutierten Rhodopsin (P347S) (RHOP347S) Transgene Mäuse. HR-SD-OCT ermöglicht konsequente Quantifizierung der Netzhaut Schichten. Nukleare Außenschicht (ONL) Dicke und Photorezeptor äußere Segment Länge (OSL) Messungen korrelieren mit Photorezeptor Vitalität, Degeneration oder Rettung. Die RIS-Delivery-System ermöglicht Echtzeit-Visualisierung von subretinalen Injektionen bei Neugeborenen (~ P10-14) oder erwachsener Mäuse und HR-SD-OCT sofort Karten areal Umfang und entscheidet über den Erfolg der Lieferung. HR-SD-OCT ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das den Erfolg der subretinalen Chirurgie bei Mäusen, zusätzlich zur Vitalität der Photorezeptoren in VivoMessung auswerten können. HR-SD-OCT kann auch verwendet werden, um einheitliche Tier Kohorten um das Ausmaß der Degeneration der Netzhaut, Toxizität und therapeutische Rettung in präklinischen Forschung Gentherapiestudien bewerten zu identifizieren.

Einleitung

Forscher entwickeln Gentherapien für eine Vielzahl von Netzhaut und Netzhaut degenerativen Erkrankungen mit der Hoffnung der Übersetzung neuen Therapeutika in Behandlungen für menschliche Krankheit1,2,,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. Zeitbereich oder spectral-Domain optische Kohärenztomographie (SD-OCT) verwendet wurde, um die Aspekte der äußeren Netzhautdegeneration bei bestimmten Mausmodellen Krankheit12,13,14 untersuchen . HR-SD-OCT wurde nicht jedoch ausgiebig im Zusammenhang mit der Optimierung der Bewertung von Mausmodellen verwendet, um festzustellen, die Rate und räumliche Homogenität der Netzhautdegeneration oder im Rahmen der präklinischen Bewertung des Gens basierten Therapeutika, z. B. zu bewerten Sie Rettung, Toxizität oder der räumlichen Ausdehnung der Vektor Lieferung8,15,16. Sobald ein Maus-Modell vollständig charakterisiert ist, können die HR-SD-OCT Daten als eine informative und zuverlässige Ressource, um die Auswirkungen der Therapeutika Rettungs- oder Toxizität in Mausmodellen der Netzhautdegeneration17ausüben zu dienen. Viele Gruppen nutzen subretinale Injektion als eine Methode der Vektor Lieferung aufgrund seiner Effizienz bei transducing Photorezeptoren und retinalen Pigmentepithels (RPE) Pigmentzellen. Dies bleibt jedoch eine schwierige Methode zu meistern, angesichts der Tatsache, dass es in der Regel durch frei-Hand-Chirurgie von der Hornhautoberfläche erfolgt und oft mit Katarakt ist, Blutungen und unbeabsichtigte Netzhautablösungen auftritt, einfach durch Manipulation der hinteren Glaskörper. Viele Gruppen noch versuchen subretinale Injektionen blind und liefern das Virus mit manuellen Injektionen mit relativ großem Durchmesser Edelstahl Nadeln (34G)8,17,18,19 ,20,21,22und ein paar nutzt optische Kohärenztomographie (OCT) Bildgebung zur Bestätigung der ordnungsgemäßen Auslieferung des Vektors auf die Netzhaut8,17, 20 , 22. einige Verbesserungen in der Methode haben vor kurzem mit Microscale Nadeln, angetrieben von einem Mikromanipulator22beschrieben.

Wir präsentieren einen integrierten Ansatz hilft bei der Positionierung der Nadel und die Injektionen werden erleichtert durch eine benutzerdefinierte gerichtete Stereo-Ophthalmoskop entwickelt im Labor speziell für die Visualisierung im Inneren des kleinen Auges der Maus17, 23. die Verwendung von gezogenem Glas Mikronadeln in Verbindung mit der stereotaktischen Mikromanipulator bieten bessere Kontrolle der Nadelplatzierung mit keine chirurgischen Schnitt nach unten erforderlich (z. B. durch Bindehautrötung und Bindegewebe) vor dem Injektion. Die Verwendung des Drucks geregelt Mikro Injektor hilft liefern konsistente Einspritzmengen und die Injektion möglich ist, mit wesentlich höherer Stabilität, Präzision und viel langsamer als manuelle Injektionen durchgeführt durch eine handgeführte Spritze, dadurch verringert die Auftreten von Blase Injektion in das Auge. Die kleinere Nadel verhindert Leckage nach Nadel Rückzug, da der Pfad selbstdichtend ist. Um das Ausmaß der Injektion/Lieferung bewerten, verlassen viele Ermittlungsgruppen zu finden und zu beurteilen, inwieweit der erweiterten grün fluoreszieren (EGFP) Proteinexpression in der Netzhaut (Ausdruck Konstrukt geliefert durch den Vektor) areal am experimentellen Ende Punkt (Euthanasie) zur Bestätigung der erfolgreichen Injektionen11,19,20,24. Diesen Ansatz (OCT nicht nutzen), um sicherzustellen, dass chirurgische Erfolg verschwendet eine enorme Menge an Ressourcen chirurgische Verfahren Zeit-und Tiere, da alle Tiere mit (unbekannten) chirurgische Fehler werden, gefolgt mit sich wiederholenden Maßnahmen bis gepflegt müssen Euthanasie und Auge zu ernten (wenn EGFP gemessen wird). Bestätigung des Standortes der Injektion in der Netzhaut kann mit HR-SD-OCT um zu zeigen, dass die Injektion befindet sich zwischen der korrekten Schichten der Netzhaut (d. h. den subretinalen Raum) verbessert werden. HR-SD-OCT kann auch verwendet werden, sofort erfolglose versuchen (chirurgische Fehler) relevante Variablen in realen chirurgischen Zeit Verbesserung auf dem Ansatz identifizieren abzugrenzen. Wir fanden, dass HR-SD-OCT zahlreiche Vorteile im präklinischen gen Therapiestudien stellt ermöglicht schnelle quantitative Bewertung der äußeren Netzhautdegeneration ermöglicht Identifikation/Keulung von Versuchstieren die experimentelle Kriterien ( nicht entsprechen z. B. falsche subretinale Injektion), und auf direkte Follow-up-Bildgebung in der Region des Auges, wo Vektor geliefert wurde (wobei präklinische Wirkung am wahrscheinlichsten ist) sowie die Steuern Regionen wo Vektor wurde nicht übermittelt. Seit seiner Entwicklung, die Verwendung von SD-OCT hat weiterhin akzeptiert und von Augenheilkunde Forschern genutzt werden und gilt heute als den Standard der retinale Bildgebung in der Netzhaut wissenschaftliche Studien in der Maus oder Nagetier Modelle13,25. HR-SD-OCT und seine Software-Funktionen wurden in einzigartigen integrierten Möglichkeiten, um das Ziel der erfolgreichen Quantitative Gentherapie in Mausmodellen bei jedem Schritt in diesem Prozess, einschließlich Tiermodell Auswahl, Charakterisierung der Degeneration in gewählten weiter genutzt. Krankheitsmodelle, therapeutische Lieferung, Zuordnung von Vektor-Lieferung und Beurteilung der Toxizität/Wirksamkeit. Die Verwendung von HR-SD-OCT ermöglicht eine effizientere Wirkstoffforschung auf allen Ebenen des Prozesses. Hier beschreiben wir diese Ansätze, mit denen in unserem RNA Drug Discovery-Programm.

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Protokoll

Tier-Protokolle wurden überprüft und genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Ausschüsse des VA WNY HCS und der University at Buffalo-SUNY. Tiere wurden nach den Vorgaben des Vereins for Research in Vision und Ophthalmology (ARVO) und der Deklaration von Helsinki eingesetzt.

(1) Maus-Modellen

  1. Identifizieren Sie Maus-Modellen einschließlich Kontrollen ausgewertet werden.
    Hinweis: Bildgebung erfolgte für eine C57BL/6(J), hC1/hC1 / / mWT/mWT, ein teilweise vermenschlichten Netzhautdegeneration Mausmodell homozygot für menschlichen mutierten RHOP347S hC1 Allele auf dem Wildtyp (WT) Maus RHO+ / + Genotyp26 , 27, hC1 x BL/6(J), ein teilweise vermenschlichten Modell mit einer einzigen Kopie des mutierten menschlichen RHOP347S hC1 Allels auf der WT-Maus RHO+ / + Genotyp (hC1 /-/ / mWT/mWT) (erhält man durch Kreuzung hC1/hC1 / / mWT/mWT mit C57BL/6 () J) Mäuse). Die oben autosomal dominant Retinitis Pigmentosa (AdRP) Modelle sind auf dem C57BL/6(J) Hintergrund. Ein Maus-Modell, die homozygot für zwei Kopien des Gens menschlichen WT RHO des Mausrads RHO Ko Hintergrund war auch gebrauchte28,29. Diese Linie ist auf dem 129Sv Hintergrund. Wenn diese Linie auf dem 129Sv Hintergrund mit einem Maus- RHO -Ko überschritten wurde, tritt eine Einzeldosis von menschlichen RHO des Mausrads RHO Hintergrund.
  2. Pflegen Sie die Tiere nach den Bedingungen für das experimentelle Design.
    Hinweis: Die Tiere wurden in tierärztlichen Einheit (VMU) an der VA WNY HCS beibehalten. Mäuse wurden gefüttert, standard-Lab-Chow und angebaut unter 12 H:12 h Licht: dunkle Zyklen mit weichen fluoreszierende Overhead weiße Lichter mit etwa 300 Lux auf Käfig auf etwa 72 ˚.

(2) Maus-Augengel

  1. Bereiten Sie das optische Gel für retinale Bildgebung30 und chirurgischen Eingriffen verwendet.
  2. Kombinieren Sie 2 mg/mL w/V hohes Molekulargewicht (4 x 106 g/Mol Carbomer in sterilen 1 x Phosphat Buffered Saline (PBS).
  3. Mischen Sie bei Raumtemperatur, bis das Gel ein zähflüssiges optisch transparentes Gel bildet.
  4. Übertragen Sie das Gel in sterile Fläschchen und Zentrifuge in einer schwingenden Eimer Tabletop Zentrifuge bei 350 X g, eingeschlossene Luftblasen zu entfernen.
  5. Tragen Sie das Gel direkt auf die Hornhaut eine Schnittstelle zwischen der Maus Hornhaut und ein Premium-Deckglas (18 x 18 mm) erstellen.

(3) HR-SD-OCT-Bildgebung

  1. Sehen Sie das HR-SD-OCT-Gerät (Abbildung 1).
  2. Wiegen Sie das Tier um die richtige Dosis Betäubungsmittel zu bestimmen. Dann betäuben Sie die Maus über 25 µL/g Körpergewicht von 2,5 % Lösung von gepufferten 2,2,2-Tribromoethyl Alkohol (Avertin) Lösung über intraperitoneale Injektion (IP) zu, und fügen Sie die Augentropfen, um die Schüler zu erweitern, nachdem das Tier unbeweglich ist.
  3. Bestätigen Sie, dass das Tier vollständig durch eine Prise Zehe betäubt ist, und stellen Sie sicher, dass das Tier nicht reagiert.
  4. Schneiden Sie die Schnurrhaare und platzieren Sie den Mauszeiger auf den HR-SD-OCT-Schlitten.
  5. Positionieren Sie die Maus Auge direkt vor der Linse Kopfbedeckung und manipulieren Sie die Bühne Steuerelemente zu, bis die Hornhaut und Iris befinden. Halten Sie die Hornhaut, die durch die Anwendung von künstlicher Tränen hydratisiert.
    Hinweis: Die Feineinstellung Mikromanipulatoren auf dem HR-SD-OCT-Schlitten werden verwendet, um die Maus so positionieren, dass die Schüler Blende zentriert und ausgerichtet ist. Die optische Kopfbedeckung ist dann fortgeschritten, bis die Netzhaut sichtbar wird und das Tier weiter angepasst wird, um das bestmögliche Bild erhalten.
  6. Zunächst öffnen Sie das Softwareprogramm "Maus" und klicken Sie auf "Patient/Prüfung". Zweitens, klicken Sie "Patient" und geben Sie die relevante Informationen zur Identifizierung des Tieres im neuen Fenster "Patienten" und "speichern und beenden". Drittens: Klicken Sie "Prüfung" gefolgt von "Prüfung starten". Viertens: Klicken Sie "benutzerdefinierten Scan" und wählen Sie "rechteckige Volumen", wählen Sie OD oder OS für das Auge abgebildet werden, dann klicken Sie "Prüfung". Endlich, mit dem Ziel des Instruments und die Positionierung des Tieres um die Region von Interesse zu erhalten. Nach der Suche nach der richtigen Region entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus der Augenoberfläche mit einer sterilen Baumwolle Applikator kurz vor Bildaufnahme kippte um Bildqualität zu verbessern, dann klicken Sie auf "start Snapshot", und falls Sie ein gutes Bild erhalten, klicken Sie auf "Speichern" "Scan".
    Hinweis: Typische Kennwerte für rechteckige HR-SD-OCT Bilder sind 900 a-Scans/b-Scan und 90 b-Scans/Bild. Aufgenommenen Bilder sind 1,4 x 1,4 mm. Die Region der Netzhaut abgebildet hängt von der spezifischen Experiment, aber die meisten Bilder sind mittig auf dem Sehnerv Kopf (ONH).

4. Beurteilung der Präsenz, die Rate und die Einheitlichkeit der äußeren Netzhaut-Degenerationen Modell

  1. Äußeren Netzhautdegeneration Modellevaluierung von HR-SD-OCT
    1. Erhalten Sie Tiere mit einem breiten Spektrum von Alter für die Kontrolle und die Versuchspersonen die Präsenz, die Rate und die Einheitlichkeit der äußeren Netzhautdegeneration Bewertung.
    2. Führen Sie HR-SD-OCT-Bildgebung auf mehrere Tiere in jedem Alter von beiden Kohorten (Krankheit und Normal). Verwenden Sie die Methode in 3.1.6 beschrieben, um die OCT-Bilder zu erhalten.
      Hinweis: Daten können aus einer großen Kohorte von Tieren auf einmal die Geburtstage, die über einen großen Zeitraum (1 Jahr) verteilt haben, oder eine kleinen Kohorte von Tier kann verwendet werden, um mehrere Bilder zu sammeln, über eine längere Zeit (1 Jahr), um ähnliche Ergebnisse zu erzielen.
    3. Öffnen Sie ein aufgezeichnetes Bild der HR-SD-OCT rechteckige Volumen und identifizieren die ersten b-Scan gemessen werden (idealerweise enthalten die ONH oder andere erkennbare Wahrzeichen) aus dem Ensemble von Bildern. Vergrößern Sie das Bild, um den Bildschirm mit der Zoomfunktion in die Software zu füllen.
    4. Öffnen Sie die gewünschte Anzahl der Bremssättel durch Rechtsklick auf das Bild des b-Scan und klicken Sie dann auf "Bremssättel" und klicken Sie schließlich auf soviele Bremssättel wie gewünscht (sie sind nummeriert von 1 bis 10). Stellen Sie sicher, dass die Bremssättel in der unteren rechten Ecke des Bildes auftauchen. Mit der Funktion "Konfigurieren Bremssattel" ordnen sie alle als "vertikale" im Winkel Block Spalte und schalten Sie die "Bremssattel Anzeigeort" erleichtern die gleichmäßige Platzierung über der Netzhaut und schließlich klicken Sie auf anwenden.
      Hinweis: 1St Bremssattel auf der linken Seite des Bildes platziert werden soll, bei der Verarbeitung von Oculus dexter (OD) rechten Auges und 1St Bremssattel auf der rechten Seite des Bildes platziert werden soll, bei der Verarbeitung von Oculus sinister (OS) linkes Augenbilder. Dies führt zu einen nasalen zeitliche Orientierung aller Daten für das linke und das rechte Auge beim Plotten.
    5. Mit der Computermaus bewegen jeden Bremssattel an die gewünschte Position (im Abstand von 2,0 mm) über die b-Bild, dass auf jeden Fall ein Bremssattel in der Mitte des Sehnervenkopfes, b-Scan-Bilder setzen, die es enthalten (diese Bremssattel auf Null gesetzt). Dann verwenden Sie die Maus zu klicken und ziehen den Bremssattel auf Länge des Interessenbereichs Span. Willkürlich gesetzt Bremssättel, die nicht messbare Regionen des b-Scan auf maximale Länge zu überlagern, und während der Datenanalyse zu ignorieren.
    6. Messen Sie die ONL Dicke mit den Bremssattel-Tools, indem Sie die Spitze des Sattels an die externe begrenzende Membran (ELM) und der Unterseite des Sattels an der Unterseite der äußeren plexiformen Schicht (OPL). Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Bremssattel über die Netzhaut in Schritten von 0,2 mm. Speichern Sie die Messungen.
    7. Nachdem alle Bremssättel platziert und an Größe angepasst wurden, klicken Sie rechts auf das Bild und klicken Sie auf "Save Bremssattel Data".
    8. Wiederholungsmessungen Sie auf nachfolgenden b-Scans (jede 10th scan funktioniert gut) aus der gleichen rechteckigen Menge OCT Bild überspannt die gesamte Netzhaut von überlegenen Regionen unterlegen. Bremssättel sollte offen und an der gleichen Stelle auf der X-Achse bleiben. Passen Sie die Länge der Bremssättel, ohne sie in X-Richtung bewegen.
    9. Öffnen Sie die speichern Dateien durch Klicken auf das kleine Datei-Symbol neben der verarbeiteten b-Scan Bild und klicken Sie auf "Gehe zu Daten". Klicken Sie auf "Datum geändert um ordnen Sie die Dateien in Reihenfolge basierend auf Zeitersparnis, und öffnen Sie die Dateien für jeden b-Scan gemessen.
    10. Kompilieren Sie die raw-Daten von jedem b-Scan in einer einzigen Datei in Reihenfolge von der niedrigsten zur höchsten basierend auf Frame-Nummer. Wählen Sie die Spalten von Daten, einschließlich "Bremssattel Name", "Länge" und "Center-X".
    11. Sicherstellen Sie, dass die Mitte X das gleiche für alle b-Scans gemessen für jedes rechteckige Volumen-OCT-Bild verarbeitet. Löschen Sie alle Daten aus Bremssättel, die nicht verwendet wurden, um Messungen aufzeichnen, und den Bremssattel befindet sich in der Mitte des Sehnervenkopfes auf Null gesetzt.
    12. Die Daten für X vs. mehrere Y-Datensätze zu einer 3D Plot-Funktion die Gesamtdicke der ONL Plotten Plot oder anderen gemessen retinalen Schicht.
    13. Vergleichen Sie ONL Messungen zwischen Kontrolle und Versuchstiere mit entsprechenden Alters zu bestimmen, die Rate und die Einheitlichkeit der jede mögliche Degeneration der Netzhaut.
    14. Wiederholen Sie den Vorgang für OSL-Messungen mit dem gleichen b-Scan-Bilder. Folgen Sie die gleiche Methode zur Messung der ONL, außer die Bremssättel zwischen ELM und Bruch Membran (BM) platzieren.
      Hinweis: Vertreter Ergebnisteil (Abbildung 3B) zeigt ein Beispiel dafür, wie um den Bremssattel zu platzieren. Dies sollte in einem vergrößerten Bild Fehler zu verringern.
    15. Wiederholen Sie die Datenanalyse für mehrere Tiere für jeden Geburtstag für beide experimentelle und Kontrolle Kohorten.
  2. Umfassende Messung und 3D Mapping der ONL oder OSL Dicke mit dem Softwaretool Bremssättel
    1. Überprüfen Sie die Post-Injektion-OCT-Bilder und notieren Sie sich alle identifizierbaren Sehenswürdigkeiten, wie die ONH oder Blutgefäße in der Netzhaut. Dann positionieren Sie den Mauszeiger um zu erhalten eine Follow-up-SD-OCT aus derselben Region, und achten Sie darauf, die gleichen erkennbaren Sehenswürdigkeiten gehören.
      Hinweis: Sicherstellen Sie, dass die Region der Netzhaut abgebildet und beteiligt die Netzhautablösung in den Post-Injektion SD-OCT-Bildern identifiziert wird. Eine rechteckige SD-OCT-Volumeabbild aufzeichnen und speichern.
    2. Die aufgenommenen Bilder zu verarbeiten, wie oben beschrieben 4.1.3. , 4.1.14. Sichern Sie der Bremssattel Daten und Handlung wie oben beschrieben.
      Hinweis: Das resultierende Array von ONL Messungen wird verwendet, um einen 3D Plot zeigt die ONL Dicke erstellen. Die Position der Bremssättel entlang der X-Achse erlauben es, das Diagramm platzieren des Sehnervs am Ursprung (0) entlang der X-Achse replot. Die Y-Achse wird geplottet mit der b-Scan-Nummer und der Sehnerv wird verwendet, um den Ausgangspunkt zu definieren, der es erlaubt, den Sehnerv am Ursprung auf der Y-Achse richtig zu positionieren. Ermittlung des Sehnervs in jedem Datensatz kann Follow-up-Bilder zuverlässig ausgerichtet werden.
  3. Das Ausmaß der Injektionsstelle auf das Fundus-Bild zuordnen
    1. Durchführen Sie Post-Injektion rechteckige Volumen OCT bestätigen den Erfolg der Injektion. Folgen Sie das beschriebenen Verfahren 3.6.
    2. Verwenden Sie die Bremssattel-Funktion in der Software, um den Wendepunkt an der Grenze von der abgelösten Netzhaut aus einer Reihe von b-Scans überspannt das gesamte OCT-Bild zu identifizieren. Verwenden Sie die Methode, um Bremssättel in beschrieben zu öffnen 4.1.4.
    3. Zeichnen Sie die Fundus-Bilder mit dem zugeordneten Standort der OCT b-Scan und entsprechenden Bremssattel Position auf dem Fundus-Bild, das seine Lage entspricht.
    4. Kompilieren Sie alle Fundus Bilder in ein zusammengesetztes Bild, einschließlich der Bremssattel-Positionen, die Ergebnisse in eine genaue Karte der Injektionsstelle auf das Bild des Augenhintergrundes (Beispiel im Abschnitt "Vertreter Ergebnisse", Abbildung 5A).

(5) intraokulare Injektionen

Hinweis: Details zur Verwendung von RIS sind in einer jüngsten Studie23ausgearbeitet.

  1. Vorbereitung Glas Injektionsnadeln
    1. Autoklaven Röhren die Kapillare mit Fäden in kleinen Chargen mit dem trocken-Zyklus.
    2. Verwenden Sie eine Pipette Puller und Set-up ein Programm, das einen Glas-Tipp mit den schärfsten Winkel und einem Durchmesser im Bereich von 2 bis 5 µm produzieren wird.
      Hinweis: Eine Probe 5-Schritte-Programm produziert wirksame Nadeln auf unsere Pipette Puller ist in Tabelle 1dargestellt.
    3. Lagern Sie die gezogenem Glas Nadeln in einem sterilen Pipette Nadel Glas bei Raumtemperatur.
  2. Füllen Sie die Spritze mit der gewünschten Lösung zur Injektion
    1. Montieren Sie die Nadel in den Nadelhalter, verlassen ca. 5/8" ragt über das Ende des Inhabers.
      Hinweis: A Abstand weniger als 5/8" sie schwer erreichen lässt Injektionslösung, die Nadel zu füllen, weil die Nadelhalter nicht ohne weiteres in die Öffnung von 0,2 mL Röhrchen passt. Auch, dass die Nadel ragen mehr als 5/8" führt zu deutlich größeren Oszillation oder Präzession der Spitze, was Echtzeit imaging erschwert, da die Spitze der Brennebene oder das Sichtfeld (FOV), beim Versuch hinterlässt, das Auge zu durchbohren.
    2. Bereiten Sie die Injektionslösung in einer sterilen 0,2 mL-Tube. Hinzufügen einer 01:10 Verdünnung von sterilen Fluorescein-Sulfat (10 mg/mL in 1 X PBS), die Injektionslösung, eine Endkonzentration von Fluorescein bei 1 mg/mL zu erhalten.
      Hinweis: Die genaue Färbung verwendete kann ist spezifisch für den Benutzer und alles, was ist ungiftig und für das bloße Auge unter weißen Beleuchtung zu erleichtern die präzise Platzierung von der Spitze der Nadel auf der Ebene der RPE und subretinalen Raum sichtbar.
    3. Visualisieren Sie die Nadel durch das Stereo-Mikroskop, während der Verwendung der Regler von der 3-Achsen-Mikromanipulator, um die Nadel zu positionieren, so dass es mit der Mitte des Rohres mit der Injektionslösung verwendet werden, für die Füllung der Nadelöhrs ausgerichtet ist.
    4. Fahren Sie vorsichtig die Nadelspitze in der 0,2 mL Tube, bis die Spitze der Nadel in die Flüssigkeit eingetaucht ist. Zeichnen Sie die gewünschte Lautstärke des Injektionsflüssigkeit (z. B. 1 µL) in die Nadel für eine einmalige Injektion erforderlich. Pflegen Sie die restliche Lösung in die Röhre im Eis.
  3. Das Tier vorbereitet für die Injektion
    Hinweis:     die RIS-Mikroskop ist sauber und ist ein berührungsloses System. Die Heizplatte ist mit einem sauberen Adsorbens Pad bedeckt und Nadeln sind autoklaviert vor gezogen. Nachdem sie von einem selbst sterilisieren beheizten Metallstreifen gezogen werden, bleiben sie in einer geschlossenen sterilisierte Kammer gezogenem Glas Nadeln halten soll. Die Nadeln werden nur behandelt mit behandschuhten Händen und Pflege wird verwendet, um zu verhindern, dass die Spitze der Nadel berührt, während es in die Halterung zu montieren. Die injizierten Lösungen werden mit steriler Technik zubereitet und sind für die Kontamination von Schlieren eine Probe des Virus Vorbereitungen auf LB-Agar-Platten und brüten sie über Nacht bei 37 ° c getestet.
    1. Wiegen Sie das Tier (g) um die entsprechende Dosis Betäubungsmittel Schmerzmittel zu bestimmen.
    2. Narkose (2,5 % ige Lösung von gepufferten 2,2,2-Tribromoethyl Alkohol (Avertin)) über intraperitoneale Injektion (IP) zu verwalten.
    3. Unmittelbar gelten Sie Anticholinergika (z. B. Cyclopentylate) für beide Augen, die Schülerinnen und Schüler zu erweitern.
    4. Trimmen des Tieres Schnurrhaare und die Nummer des Tieres mit Ohr Punch oder andere Methode.
    5. Waschen Sie das Auge und Umgebung mit verdünnter Betadine.
      Hinweis: Vermeiden Sie jede Lösung um die Nase, wie unbeabsichtigte Ertrinken führen kann.
    6. Platzieren Sie den Mauszeiger auf das Heizkissen auf 39 ° c, in der vor-geformten Modellierer Ton Maus Halter mit dem Auge in Richtung der Nadel injiziert werden gehalten.
    7. Stellen Sie sicher, dass die Maus nicht reagiert mit einer Prise Test des hinteren Fußes ist.
  4. Subretinale Injektion durchführen
    1. Verwenden Sie ein paar sterile stumpfen Iris Zange sanft Proptose der Globe induzieren, indem man die Spitzen der Zange auf 7 und 10:00-Positionen auf den Augenlidern drücken Sie offen und nach unten zur gleichen Zeit.
    2. Verwenden Sie die Zange, um die Augenlider unter des Augapfels zu halten während des Einspritzvorgangs aus der Steckdose zu hieven.
      Hinweis: Tiere 10 bis 14 Tage alt werden oft das Auge aus der Steckdose leichter als ältere Tiere zu halten.
    3. Richten Sie die Spitze der Nadel etwa 1-1,5 mm unter dem Rand der Hornhaut Limbus und fahren Sie es vorsichtig in das Auge durch die Bindehaut zu, bis es eine skleralen Depression schafft, wie die Nadel in das Gewebe der Lederhaut dringt und ermöglicht eine Bearbeitung des Auges.
    4. Drehen Sie das Auge nach unten mit dem Mikromanipulator, die skleralen Depression durch die Dilatierte Pupille mit dem RIS Stereo-Mikroskop zu visualisieren.
    5. Geben Sie einen Tropfen des sterilen Augengel oder 1 x PBS-Lösung und mit einem sterilen Deckgläschen abdecken.
    6. Im Mittelpunkt der skleralen Depression, erstellt von der Spitze der Nadel (2 bis 5 µm) und fahren die Nadel vor, bis eine scharfe Spitze der Netzhaut Formen an der Injektionsstelle.
    7. Drehen Sie die Nadel mit dem Halter, bis die Spitze bohrt sich durch die Sklera und Fluorescein in die Nadel unter die Netzhaut in unmittelbarer Nähe des RPE Zellen Monolage sichtbar ist.
    8. Fahren Sie die Spitze der Nadel zu, so ist es tangential an die Kugel, und aktivieren Sie die Einspritzpumpe mit Pedal Fußschalter.
    9. Nachdem die gewünschte Lautstärke geliefert wurde (0,5-1 µL) auf den subretinalen Raum ziehen Sie die Nadel heraus und prüfen Sie, ob die Blase stabil ist und die Flüssigkeit aus der Injektionsstelle, die die ersten Kriterien für eine erfolgreiche Injektion ist nicht auslaufen.
      Hinweis: Eine ordnungsgemäße Spitzendurchmesser ist (2 bis 5 µm Durchmesser) entscheidend zum Auslaufen von Injektionsstelle zu vermeiden.
    10. Legen Sie das Tier auf die imaging Plattform des Instruments OCT. Folgen Sie den Anweisungen für HR-SD-OCT-Bildgebung ein rechteckiger Volume Image aufzeichnen.
    11. Bestätigen Sie, dass die eingespritzte Flüssigkeit in den subretinalen Raum, und speichern Sie die Bilder für die Festsetzung des Umfangs der Blase befindet.
    12. Das Tier aus der Halterung zu entfernen und eine reichliche Menge an antibiotische Salbe auf die injizierten Augen anwenden.
    13. Legen Sie das Tier auf ein Heizkissen, bis es vollständig erholt, dann legen Sie sie wieder in den ursprünglichen Käfig, wo es herkommt.
      Hinweis: Unsere Tiere in der Regel vor dem Absetzen injiziert werden, daher müssen die Tiere in den Käfig mit der Mutter zurückgegeben werden.
  5. Das Ausmaß der subretinalen Lungenblase OCT Instrument Software Werkzeugen zuordnen.
    1. Erhalten Sie eine rechteckige Volumen OCT-Bild, mit Methoden, die zuvor beschriebenen, von der Blase, und positionieren Sie es um ein erkennbares Wahrzeichen im Auge wie die ONH erweitert.
      Hinweis: Aufnahme 90 b-Scans funktioniert gut für die Zuordnung der Blase, aber könnte verwendet werden, abhängig von der gewünschten Auflösung.
    2. Die Abbildung einer einzigen Bremssattel hinzu und legen Sie sie an den Wendepunkt, wo die Netzhaut vom RPE und Aderhaut löst.
      Hinweis: Die Software ordnet automatisch einen entsprechenden Punkt eine Linie auf dem Fundus aus dem Bremssattel und der b-Scan, die ausgewertet.
    3. Erfassen Sie den Bildschirm nach Platzierung der Bremssättel, und kompilieren Sie die Bilder, um effektiv die Grenze von der Injektion auf auf das Bild des Augenhintergrundes, ordnen Sie die genau die Injektionsstelle zuordnet. Speichern Sie das kompilierte Bild als Referenz zu helfen bei der Suche nach den Regionen von Interesse während der Follow-up-Bildgebung.
      Hinweis: Alternativ die Bremssattel-Daten eingespart werden erfüllt und mit einer ähnlichen Methode für Plotten 3D Datensätze ONL Dicke aufgetragen.
  6. Intravitreale Injektion
    1. Setzen Sie die Spitze der Nadel mit einem ähnlichen chirurgische Ansatz als Sub retinalen Injektion, außer dass die Nadel an der Pars Plana ca. 0,25 mm hinter der Hornhaut Limbus und in den Glaskörper vollständig durch die Sklera angetrieben wird.
    2. Gelten Sie nach Nadelplatzierung die Injektion Puls mit dem Fußpedal.
      Hinweis: Eine schnelle Verbreitung des Farbstoffes in den Glaskörper die Augenmuschel Fluorescein wird beobachtet, die erweiterten Pupille Blende mit Fluoreszenz zu füllen.

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Ergebnisse

Bewertung der Anwesenheit, Rate und Einheitlichkeit der äußeren Netzhautdegeneration Modell
Messungen der ONL waren ELM, definieren die Grenzen der ONL mit dem Bremssattel-Werkzeug in der Gerätesoftware zur Verfügung gestellt von der OPL aufgezeichnet. Ziel war es, das Fortschreiten der äußeren Netzhautdegeneration in einem Mausmodell teilweise vermenschlichten AdRP zuordnen. Vergleichbare Bilder aus einer Kontrolle C57BL/6(J) Maus und ein hC1/hC1 / / mWT/mWT-Mau...

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Diskussion

HR-SD-OCT bietet eine einfache Methode zur Charakterisierung von potenziellen Tiermodellen der Krankheit beim Menschen zu bestimmen, ihre Nützlichkeit bei der Prüfung möglicher Therapeutika. Die Fähigkeit, schnell und zuverlässig eine potenzielle Tiermodell für menschliche Krankheiten zu charakterisieren ist entscheidend für den Prozess der therapeutischen Arzneimittelforschung (z.B.gen-Ersatz-Therapie, Ribozyme oder ShRNA Knockdown Gentherapie, kombinierte Gentherapie). HR-SD-OCT bietet eine einfache, sc...

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Offenlegungen

Geschäftliche Beziehungen: MCB: keine; JMS: keiner. Das Retinal imaging System (RIS)23 in dieser Studie verwendeten ist ein neuartiges Gerät umfangreiche Verwendung keiner Gruppe Lieferung Gentherapiestudien in Mäuse, Nagetiere oder kleine Tiere durchführen wollen. Während die Autoren keine Konflikte in Bezug auf dieses Gerät zu diesem Zeitpunkt zu deklarieren haben, der University at Buffalo - SUNY und der Veterans Administration haben Rechte am geistigen Eigentum und kann versuchen, dieses Instrument in Zukunft zu vermarkten.

Danksagungen

Dieses Material basiert auf der Arbeit unterstützt, unter anderem durch das Department of Veterans Affairs (VA), Veterans Health Administration, Office of Research und Development (biomedizinische Forschung im Labor und Entwicklung) (VA Verdienst Grant 1I01BX000669). JMS ist, teilweise als Arzt-Mitarbeiterin, Augenheilkunde, VA WNY angestellt; MCB wird teilweise von VA WNY beschäftigt. Die Studie wurde an durchgeführt und teilweise von der Veterans Administration Western New York Healthcare System (Buffalo, NY) unterstützt. Inhalt repräsentieren nicht die Ansichten des Department of Veterans Affairs oder Regierung der Vereinigten Staaten. Auch unterstützt, im großen Teil durch NIH/NEI R01 gewähren EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 gewähren EY016662 (UB Vision Center Infrastruktur, PI: M Schlachtung, Generaldirektor der Biophotonik-Modul: JMS), einen uneingeschränkten Stipendiums an der Abteilung Ophthalmologie/Universität in Büffel aus der Forschung zu verhindern, dass Blindheit (New York, NY), und ein Stipendium der Oishei Stiftung (Buffalo, NY). Wir anerkennen die Gabe der hC1 transgenen RHOP347S Linie und die Exon 1 Maus RHO Knockout von Dr. Janis Lem (Tufts-New England Medical Center, Boston, MA) und das Geschenk des Modells NHR-E Transgen im heterozygoten Zustand auf die Maus Exon 2 RHO Ko-Hintergrund von DRS. G. Jane Farrar und Peter Humphries (Trinity College, Dublin, IRE).

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL6 (J)Jackson Laboratories664
N129R-N/AN/A
2HRho 1T/1TN/AN/A
Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT)Bioptigen90-R2200-U1-120.  
Retinal Imaging System (RIS)In-houseN/A
Stemi 2000C MicroscopeZeiss000000-1106-133
P-97 Flaming/Brown micropipette pullerSutter Instrument Cop-97
MMN-33 micro manipulator Narishige USAMMN-33
PLI-100  micro injectorHarvard Apparatus64-1736
Micropipette Holder (Rotating)In-houseN/A
Micropipette Storage ReceptacleWorld Precision Instruments Inc.E210
 Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, Harvard Apparatus30-0053
2,2,2-TribromoethanolSIGMA AldrichT48402-25G
Tert-amyl AlcoholSIGMA Aldrich240486-100ML
Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1%Akorn Inc.NDC 17478-215-05
GonioviscBioVision LimitedNDC 17238-610-15
Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP  2%Akorn Inc.NDC 17478-097-10
Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1%PerigoNDC 45802-046-35
Systane UltraAlcon Laboratories, Inc.9006619-1013
Tetracaine HydrochlorideBausch and LombNDC 24208-920-64
Ophthalmic Solution, USP 0.5%Bausch and LombNDC 24208-920-64
DPBSGibco Life Technologies14190-136
Virus PreparationsViGene /UNCN/A
Gold nanorodsNANOPARTzD12M-850-1.75
Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25%Akorn Inc.NDC 17478-250-20
CoverslipsFisher Scientific12-548-A
ForcepsMilton18-825
Needles 30 guageBeckton Dickenson  W11604
SyringesBeckton Dickenson  309659
Bioptigen software PackageBioptigenN/A
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5%Akorn Inc.NDC 17478-263-12
Windows ExcelMicrosoftN/A
Adobe IllustratorAdobe 
ScaleMettler
ScissorsWorld Precision Instruments
Ear punchNat’l band
CL 100 Light sourceWelch AllynCL100
Nitrogen GasJackson Welding SupplyN/A
Heated Water bathNeslabRTE-140
Heating plateIn HouseN/A
Heating matCincinnatti Sub Zero273
Clay mouse holderPlast.i.clay American Art Clay Co.N/A
BetadineMedLine NDC53329-938-06
Cotton Tip ApplicatorsAmerican Health ServiceCtag
EtOH 70%Fisher ScientificBP2818-100
Gloves NitrileVWR89038-272
Diagnosys ERG Color Dome instrumentDiagnosys Inc.D125
Contact lensesIn-houseN/A
Diagnosys SoftwareDiagnosys Inc.N/A
Origin 6.1 softwareOriginLab Corp.N/A
Reference electrodesOcuscienceF-Thread Electrode (DTL) 24”

Referenzen

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