JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم تحقيق اشتقاق قوي من الخلايا الجذعية المحفزة البشرية (هيبس) باستخدام فيروس سينداي غير متكامل (سيف) ناقلات بوساطة إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية. تم تنفيذ صيانة الخلايا هيبس والتوسع النسيلي باستخدام ظروف زراعة خالية من الكينو و كيميائيا مع المؤتلف الإنسان لامينين 521 (لن-521) مصفوفة و E8 الأساسية (E8) المتوسطة.

Abstract

وتعتبر الظروف الخالية من الغينو والظروف المحددة تماما معلمات أساسية للتوليد القوي والقابل للتكاثر للخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان. صيانة خلايا هيبس على الخلايا المغذية أو المصفوفات غير محددة عرضة للفروق دفعة، التلوث المسببة للأمراض وخطر المناعة. استخدام المصفوفة الإنسان لامينين 521 (لن-521) المؤتلف محددة في تركيبة مع تركيبات وسائل الإعلام خالية من شينو ومحددة يقلل من التباين ويسمح للجيل ثابت من خلايا هيبس. ناقل فيروس سينداي (سيف) هو نظام غير قائم على الحمض النووي الريبي القائم على الحمض النووي الريبي، وبالتالي التحايل على المخاوف المرتبطة التأثير المحتمل التخريبية على سلامة الجينوم نواقل دمج يمكن أن يكون. وعلاوة على ذلك، أظهرت هذه النواقل كفاءة عالية نسبيا في إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية. وبالإضافة إلى ذلك، الأنزيمية خلية واحدة تمرير الخلايا يسهل صيانة متجانسة من خلايا هيبس دون خبرة سابقة كبيرة من الجذعية سيليرة لبنانية الثقافة. نحن هنا وصف البروتوكول الذي تم اختباره على نطاق واسع وتطويرها مع التركيز على استنساخ وسهولة الاستخدام، وتوفير وسيلة قوية وعملية لتوليد وخلايا هيبس الإنسان محددة وخالية من خلايا الخلايا الليفية.

Introduction

منذ اشتقاق الأول من خطوط الخلايا هيبس تاكاهاشي وآخرون. 1 ، 2 ، وقد وفرت خلايا هيبس أداة مفيدة لنمذجة المرض، واكتشاف المخدرات وكمادة المصدر لتوليد العلاجات خلية في الطب التجديدي 3 . وقد اعتمدت ثقافة الخلايا هيبس منذ فترة طويلة على المشاركة في الثقافة مع الخلايا المغذية الليفية 4 ، 5 أو على ماتريجيل 6 ومع تركيبات وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل الأبقار الجنين (فبس). وتعتبر الفروق بين الدفعة والدفعة نتيجة شائعة للطبيعة غير المعرفة لظروف الثقافة هذه، مما يؤدي إلى تغيرات لا يمكن التنبؤ بها، وهي مساهمة رئيسية في عدم موثوقية هذه البروتوكولات 7 . تطوير وسط محدد مثل الأساسية 8 (E8) 8 والمصفوفات ثقافة الخلية المعرفة على سبيل المثال لن-521 9 ، تسمحثانية لإنشاء بروتوكولات استنساخه للغاية والمساعدات في توليد قوي وصيانة خلايا هيبس متجانسة 7 ، 8 ، 9 ، 10 .

وقد كان تطوير تقنيات إعادة البرمجة الحرة للتكامل قفزة إلى الأمام. في الأصل، إعادة البرمجة تعتمد على ناقلات الفيروسات الرجعية التي تدمج عشوائيا في الجينوم مع الآثار التخريبية على سلامة الجينومية 11 . وتشمل التطورات في منهجيات إعادة البرمجة تطوير النواقل القائمة على الحمض النووي الريبي. ناقلات الحمض النووي الريبي لديها ميزة على طريقة إعادة برمجة الحمض النووي على أساس التكامل غير مقصود من خلال إعادة التركيب الجيني غير ممكن 12 . تقدم ناقلات سيف التعبير عالية وعابرة من العوامل الخارجية من خلال الحمض النووي الريبي واحد تقطعت بهم السبل دون مرحلة الحمض النووي 11 . ناقلات إعادة البرمجة التي قدمها سيفيتم تخفيفها في جميع أنحاء التوسع الخلية وتسليط الضوء في نهاية المطاف من الثقافة توفير وسيلة الطباعة القدم الحرة لإعادة البرمجة. بعد ذلك، الحفاظ على تعدد القدرات يعتمد على التعبير الداخلي للجينات تعدد القدرات 2 .

كما بدأت الرائدة هيبس الخلايا القائمة على العلاجات للانتقال إلى التجارب السريرية، والمطالب على دفعات موحدة، استنساخ، والسلامة هي القضايا الأساسية لمعالجة 13 . ولذلك، ينبغي تجنب المنتجات ذات الأصل الحيواني. على سبيل المثال، كان استخدام المنتجات زينوجينيك مرتبطا بمخاطر التلوث غير المسببة للأمراض الممرضة. أيضا، وقد ثبت الخلايا المستزرعة في وجود مكونات الحيوانات المشتقة الحيوانية لدمج الأحماض السيلياك غير البشرية في أغشية الخلايا التي تهدد لتقديم الخلايا المستمدة المناعية 14 . وبالتالي، فإن الحاجة إلى القضاء على المنتجات زينوجينيك ضروري لأي ملاحقات السريرية في المستقبل. ينطبق هذا البروتوكول زلا حرة وتعرف الثقافة في الحفاظ على خلايا هيبس تتحرك الخلايا أقرب إلى الامتثال السريرية.

يصف هذا البروتوكول متسقة، استنساخه للغاية وسهلة الاستخدام الأسلوب الذي يولد خلايا هيبس موحدة من الخلايا الليفية. كما أنه يوفر نظام ثقافة سهل الاستعمال للحفاظ على خلايا هيبس أنشئت. وقد استخدم هذا البروتوكول لاشتقاق أكثر من 300 خطوط الخلايا هيبس في منشأة إيبس الأساسية الوطنية السويدية في معهد كارولينسكا منها بعض خطوط سبق وصفها 15 ، 16 .

Protocol

تمت الموافقة على جمع مواد المريض واشتقاق خلايا هيبس من قبل مجلس مراجعة الأخلاقيات، ستوكهولم، 28 مارس 2012، رقم التسجيل: 2012 / 208-31 / 3. وينبغي إجراء خطوات ثقافة الخلية في خزانات السلامة الأحيائية ما لم يذكر خلاف ذلك. دائما ممارسة تقنيات التعامل مع العقيمة عند العمل مع الخلايا. السماح لوسائل الإعلام، لوحات والكواشف للوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل البدء. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 في الرطوبة العالية.

1. عزل الخلايا الليفية البشرية من خزعة الجلد

  1. الاستعدادات المتوسطة الثقافة، والإنزيمات الهضمية، طلاء الأطباق وأدوات تشريح.
    1. إعداد الليفية المتوسطة: 44.5 مل إيسكوف في تعديل دولبيكو المتوسطة (إدمم)، 5 مل مصل الأبقار الجنين (فبس) و 500 ميكرولتر البنسلين / الستربتومايسين (بيست) (انظر الجدول 1 )، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    2. إعداد الانزيمات الهاضمة في تركيز العمل من 1 ملغ / مل: ويغ أليكوتس من 4 ملغ من ديسباس وكولاجيناز نوع I مسحوق في أنابيب 15 مل منفصلة وتذوب في 4 مل من دمم / F12 + 1٪ الآفات. تعقيم الحل الأنزيمي عن طريق تمريرها من خلال مصفاة 0.22 ميكرون. إعداد حلول انزيم جديدة في كل مرة.
    3. معطف بئر واحدة في 6-جيدا لوحة زراعة الأنسجة (أو 35 ملم الأنسجة طبق الثقافة) في خزعة تشريح مع 1 مل من 0.1٪ الجيلاتين في الفوسفات مخزنة المالحة (دبس). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    4. الأوتوكلاف مجموعة واحدة من مقص الجراحية وملقط في خزعة لتشريح.
  2. معالجة الخزعة
    ملاحظة: خزعة عملية في أسرع وقت ممكن بعد أن تؤخذ. تخزين في برنامج تلفزيوني + 1٪ الآفات لمدة تصل إلى 48 ساعة في 4 درجات مئوية. وينبغي أن تكون خزعة قطرها 2 - 4 مم في الحجم ووفقا لتصاريح أخلاقية.
    1. نقل الخزعة إلى طبق 35 ملم. نقل الخزعة إلى طبق جديد 35 ملم وغمر الخزعة في 2 مل من الايثانول 70٪ لمدة 30 ثانية.
    2. نقل الخزعة إلى ثلثطبق 35 ملم وغسل مع 1 مل من محلول الملح المتوازن هانك المعقم (هبس) تستكمل مع 1٪ الآفات.
    3. نقل خزعة إلى طبق الرابع 35 ملم، إضافة 1 مل من محلول ديسباس 0.1٪ الطازجة.
    4. قطع خزعة الجلد في 1-2 ملم 3 قطع في الطبق باستخدام مقص جراحي وملقط ومن ثم نقل القطع خزعة بما في ذلك حل ديسباس في أنبوب 15 مل. إضافة 2 مل إضافية من ديسباس.
    5. شطف الطبق 35 ملم مع محلول ديسباس 1 مل ونقل إلى أنبوب 15 مل.
    6. احتضان خزعة في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    7. إضافة 4 مل من 0.1٪ كولاجيناز I إلى أنبوب واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
    8. أجهزة الطرد المركزي الخلايا هضمها 300 x ج لمدة 3 دقائق، نضح طاف و ريسوسبيند الهضم في 2 مل من الألياف الليفية المتوسطة.
    9. إزالة الحل الجيلاتين من 6-جيدا لوحة زراعة الأنسجة. نقل تعليق الخلية بما في ذلك أي قطع المتبقية إلى 6 جيدا لوحة زراعة الأنسجة (أو 35 مم طبق الثقافة الأنسجة) بريكواتد مع 0.1٪ الجيلاتين في دبس.
    10. تغيير المتوسطة كل يوم ثالث.
  3. توسع الخلايا الليفية البشرية
    ملاحظة: الخلايا الليفية هي على استعداد لتمريرها إلى T25 (25 سم 2 ) قارورة زراعة الأنسجة عندما 80٪ متموجة ( الشكل 2B ). الخلايا الليفية تصل عادة 80٪ كونفلنسي في غضون 7 أيام. ومع ذلك، فإن الوقت المطلوب يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا ولكن ينبغي أن لا تتجاوز 4 أسابيع.
    1. نضح المتوسطة وغسل مرة واحدة مع 2.5 مل من دبس.
    2. إزالة دبس وإضافة 1 مل من التربسين-إدتا (0.05٪) واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى تظهر خلايا حواف مدورة والبدء في فصل.
    3. إضافة 2 مل من الخلايا الليفية المتوسطة، إذا لزم الأمر شطف الخلايا ضمان ديسوسوسياتيون السليم للخلايا. نقل محلول الخلية إلى أنبوب 15 مل وطرد مركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق.
    4. تجاهل طاف و ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل من الخلايا الليفية المتوسطة والخلايا الليفية لوحة فيعلى المغلفة الخلية زراعة الأنسجة T25 قارورة. عند توسيع الخلايا الليفية بعد هذه الخطوة، فصل كما هو موضح أعلاه والبذور 12 × 10 3 خلايا / سم 2 .
    5. مرة واحدة الخلايا متموجة جاهزة للتجميد، توسيع أو لوحة لإعادة البرمجة. تجميد أسفل جولتين من الخلايا الليفية قبل بدء أي إعادة برمجة (الرجوع إلى القسم التالي لتجميد الإجراء). كفاءة إعادة البرمجة هي عادة أعلى للالألياف الليفية مرور أقل، والخلايا في مرور 2 - 4 هو الأمثل. ومع ذلك، تمت إعادة برمجة ناجحة من الخلايا الليفية تصل إلى مرور 10 باستخدام هذا البروتوكول.
  4. تجميد والذوبان في الخلايا الليفية
    1. إعداد الخلايا الليفية الطازجة تجميد المتوسطة: 90٪ فبس + 10٪ ديميثيلسولفوكسيد (دمسو). إبقاء في 4 درجات مئوية ( الجدول 1 ). مرة واحدة متموجة، يمكن تجميدها قارورة ثقافة الأنسجة T25 في ثلاثة كريوفيالز. إعداد 500 ميكرولتر من الليفية تجميد المتوسطة في قارورة المجمدة.
    2. لتجميد الخلايا، فصل cكما هو موضح في الخطوة 1.3، عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ونقل أجزاء من 3 × 10 5 خلايا إلى أنابيب 15 مل. تدور أنابيب في 300 x ج لمدة 3 دقائق. نضح طاف.
    3. ريسوسبيند الكريات الخلية في 500 ميكرولتر من 4 ˚C الليفية تجميد المتوسطة ونقلها إلى كريوفيالز. وضع قارورة في حاوية تجميد واحتضان الخلايا في -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل نقلها إلى النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
    4. لذوبان الجليد الخلايا، غمر الجزء السفلي من كريوفيال في 37 درجة مئوية الماء. مرة واحدة المسال، ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل وإضافة 5 مل من المتوسطة الليفية. تدور الخلايا 300 x ج لمدة 3 دقائق.
    5. إزالة طاف و ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل من الألياف الليفية المتوسطة. نقل الخلايا إلى غير المغلفة T25 قارورة زراعة الأنسجة واحتضان في 37 درجة مئوية.

2. سيف ناقلات إعادة برمجة الخلايا الليفية

  1. إعداد أليكوتس ناقلات
    تنبيه: التعامل مع سيف تحت الاحتواء 2 السلامة الأحيائية. الرجوع إلى بروتوكول الشركة المصنعة والمبادئ التوجيهية المحلية 17 . عيار الفيروسات يختلف بين دفعات.
    1. قبل إعداد أليكوتس حساب كمية ناقلات اللازمة لخلايا 5 × 10 4 وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة (على سبيل المثال ، سايتوشن 2.0). عيار الفيروس يختلف عموما من 8 × 10 7 - 1.5 × 10 8 . ذوبان الجليد والجمع بين ناقلات 5: 5: 3 (كوس موي = 5، هك-ميك موي = 5 و hKlf4 = وزارة الداخلية 3). جزء المبلغ المحسوب لإعادة برمجة 5 × 10 4 خلايا في أنابيب تعقيمها 1.5 مل. تمييع فيروس قسامة مع الليفية المتوسطة إلى الحجم النهائي من 250 ميكرولتر لإعادة البرمجة.
      ملاحظة: كل قارورة صالحة لإعادة برمجة بئر واحدة من 24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة مع 5 × 10 4 الخلايا الليفية. تخزين أليكوتس الفيروس في -80 درجة مئوية.
  2. سيف، سهم التوجيه، ترانزدوكشيون
    1. نضح الخلية الخليةلتر وتغسل مع 1 مل من دبس. نضح دبس وإضافة 1 مل من التربسين-إدتا (0.05٪). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى يتم فصل الخلايا.
    2. إضافة 2 مل من الخلايا الليفية و ريسوسبيند الخلايا ونقل إلى أنبوب 15 مل. أجهزة الطرد المركزي 300 x ج لمدة 3 دقائق.
    3. نضح طاف و ريسوسبيند بيليه في 2 مل من الليفية المتوسطة.
    4. عد الخلايا الليفية باستخدام عدادة الكريات والبذور 5 × 10 4 خلايا في بئر واحدة من 24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
    5. نضح وسط ثقافة الخلية، إضافة 250 ميكرولتر من حل سيف واحتضان عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    6. تغيير المتوسطة يوميا إلى المتوسطة الليفية الطازجة. السماح الخلايا ترانسدوسد أن تنمو لمدة 7 أيام قبل أن يتم تمريرها إلى لوحات المغلفة لن-521. إعداد لوحات لن-521 في اليوم قبل مرور. راجع 2.3.1 لإجراء الطلاء.
  3. ريبلاتينغ من الخلايا الليفية ترانزدوسد
    1. إعداد LN-521 الأطباق المغلفة: تمييع لن-521 في دبس إلى تركيز النهائي من 0.63 ميكروغرام / سم 2 . ماصة 2 مل من حل لن-521 لكل 60 ملم طبق الثقافة الأنسجة. ختم 60 ملم طبق الثقافة الأنسجة باستخدام بارافيلم. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    2. إعداد أسيكتس الأساسية 8 (E8) المتوسطة لتسهيل التعامل معها: 48.5 مل من E8 المتوسطة، 1 مل من الملحق E8 و 500 ميكرولتر من الآفات ( الجدول 1 ).
    3. 7 أيام بعد تنبيغ، مرور الخلايا إلى لن-521 المغلفة 60 ملم الأنسجة طبق الثقافة. إضافة 250 ميكرولتر من التربسين-إدتا (0.05٪) واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى فصل الخلايا. إضافة 2 مل من الخلايا الليفية المتوسطة وخلايا الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 300 × ز.
    4. نضح طاف. ريسوسبيند بيليه في 2 مل من الخلايا الليفية المتوسطة وعد الخلايا في عدادة الكريات. نضح حل لن-521 من لوحة بريكوات والبذور 4 × 10 4 خلايا في 5ML المتوسطة الليفية في ل-521 بريكواتد طبق 60 ملم. إضافة رو-كيناز المانع Y-27632(روكي) إلى تركيز النهائي من 5 ميكرومتر. احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    5. الأهم من ذلك، في اليوم التالي، تغيير المتوسطة إلى E8 المتوسطة. تغيير E8 المتوسطة يوميا. ستظهر المستعمرات خلية هيبس في غضون 2-3 أسابيع.

3. اختيار المستعمرات وتوسيع الخلايا هيبس

ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية خارج مجلس الوزراء السلامة الأحيائية تحت المجهر ستيريو. ويوصى باستخدام أقنعة هيرنيت والأجراء. العمل بعناية لا تلوث ثقافة الخلية.

  1. إعداد لن-521 الثقافة الأنسجة المغلفة لوحات 24 جيدا في اليوم قبل التقاط. تمييع لن-521 في دبس 0.63 ميكروغرام / سم 2 . ماصة 250 ميكرولتر من حل لن-521 في بئر واحدة من 24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة. ختم لوحات باستخدام بارافيلم. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: المستعمرات على استعداد ليتم اختيارها عندما تصل إلى حجم> 1 ملم في القطر. وينبغي للمستعمرات عرض حواف حادة وتنمو في مون متجانسةأولايرس ( الشكل 2D ).
  2. نضح حل لن-521 وإضافة 500 ميكرولتر من E8 في بئر واحدة من 24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة.
  3. قطع المستعمرات إلى قطع أصغر مع مشرط في شبكة مثل نمط تحت ستيريوميكروسكوب. كشط ميكانيكيا صفائح الخلية من الطبق ونقل الأوراق باستخدام ماصة 200 ميكرولتر إلى جيدا أعدت ( الشكل 2D -2E ). اختيار المستعمرات في آبار منفصلة.
  4. السماح للخلايا لإرفاق دون تغيير المتوسطة لمدة 48 ساعة. بعد ذلك، تغيير E8 المتوسطة يوميا.
  5. عندما وصلت المستعمرات إلى حجم> 5 ملم، خلايا مرور الأنزيمية كخلايا واحدة لبئر جديد من لوحة المغلفة لن-521.
  6. نضح وسط زراعة الخلايا من الخلايا ويغسل مع 250 ميكرولتر من دبس.
  7. نضح دبس. إضافة 250 ميكرولتر من كاشف التفكك واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  8. لاحظ أن الخلايا قد بدأت في الاقتراب. فصلالخلايا من لوحة عن طريق الشطف الخلايا مع كاشف التفكك عدة مرات.
  9. إضافة 500 ميكرولتر من E8 المتوسطة إلى أنبوب 15 مل. نقل الخلايا في كاشف التفكك إلى أنبوب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 300 × ز.
  10. نضح حل لن-521 من بريكواتد لن-521 جيدا وإضافة 500 ميكرولتر درجة حرارة الغرفة E8 المتوسطة.
  11. نضح طاف و ريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من E8 المتوسطة.
  12. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات والبذور 2.5 × 10 4 - 5 × 10 4 خلايا في أعدت جيدا لن-521 بريكواتد جيدا (1.25 × 10 4 - 2.5 × 10 4 خلايا / سم 2 ). يمكن بسهولة تنسيق ثقافة الخلية أن تطوى لتتناسب مع الغرض المقصود.
  13. إضافة روكي إلى تركيز النهائي من 10 ميكرومتر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية.
  14. تغيير E8 المتوسطة يوميا. الخلايا عادة ما تكون جاهزة للمرور بعد 4-6 أيام. إنزيماتيكال مرور الخلايا كخلايا واحدة كما هو موضح أعلاه عندما حوالي 90٪ متموجة.
    ملاحظة: يتم تخفيف ناقلات إعادة برمجة تدريجيا خلال توسع الخلايا هيبس وغير قابل للكشف بعد مرور 12. الخلايا التي يتم برمجتها بشكل محايد تتوقف عادة تتكاثر حول مرور 6-10 أو تفقد خصائصها متعددة الخلايا الجذعية مورفولوجيا ( الشكل 3B ).
  15. تجميد وذوبان الخلايا هيبس
    1. لتجميد الخلايا، إنزيمي فصل الخلايا كخلايا واحدة كما هو موضح أعلاه، عد الخلايا في عدادة الكريات ونقل 2.5 × 10 5 خلايا إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 1 مل من E8 المتوسطة. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق. نضح طاف.
    2. ريسوسبيند بيليه الخلية في 250 ميكرولتر من 4 درجة مئوية بسك كريوميديوم ونقل إلى كريوفيال. وضع قارورة في حاوية تجميد واحتضان الخلايا في -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل نقلها إلى النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
    3. لذوبان الخلايا، وإعداد بريكواتد لن-521 جيدا من الأنسجة الأنسجة 24 جيدالوحة عن طريق الشفط حل لن-521 وإضافة 250 ميكرولتر من E8 المتوسطة. غمر الجزء السفلي من كريوفيال في 37 درجة مئوية الماء حتى يبقى سوى جليد صغير.
    4. إضافة 250 ميكرولتر من E8 المتوسطة إلى كريوفيال ونقل خلية تعليق إلى أنبوب 15 مل وإضافة 1 مل من E8 المتوسطة. تدور الخلايا 300 x ج لمدة 3 دقائق.
    5. إزالة طاف و ريسوسبيند بيليه الخلية في 250 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة E8 المتوسطة. نقل تعليق الخلية إلى بئر المعدة وإضافة 1٪ خلية تكملة بقاء أو 10 ميكرومتر روكي. احتضان لوحة زراعة الأنسجة في 37 درجة مئوية.

النتائج

من خزعة إلى خلايا هيبس

العملية برمتها من خزعة إلى خلايا هيبس أنشئت، واضحة من إعادة برمجة ناقلات وجاهزة لتوصيف، يستغرق حوالي 16 أسبوعا ( الشكل 1 ). ويرد جدول زمني أكثر تفصيلا في

Discussion

النتيجة المتوقعة من هذا البروتوكول هو الجيل الناجح لعدة خطوط الخلايا هيبس المستمدة كلونالي. الأهم من ذلك، فإن طريقة لصيانة وتوسيع خلايا هيبس أنشئت هنا هو موثوق بها ويمكن أن يؤديها مع القليل من الخبرة السابقة من ثقافة الخلايا الجذعية. ومن المعروف أن الأنزيمية خلية وا...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإبلاغ.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل من قبل سف (B13-0074) و فينوفا (2016-04134) وكلاء التمويل.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DispaseLife Technologies171105-041Biopsy digestion
CollagenaseSigmaC0130Biopsy digestion
GelatinSigmaG1393Fibroblast matrix
IMDMLife Technologies21980002-032Fibroblast medium
FBSInvitrogen10270106Fibroblast medium
Penicillin/StreptomycinLife Technologies15070-063Antibiotic
Essential 8 mediaThermFisher ScientificA1517001iPS cell culture media
LN-521BiolaminaLN521-03iPS cell culture matrix
TrypLE select 1XThermoFisher Scientific12563011Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632MilliporeSCM075Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kitLife TechnologiesA1377801Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dishSarstedt83.3900.300Cell culture
60 mm tissue culture dishesSarstedt83.3901.300Cell culture
24 well tissue culture platesSarstedt83.3922.300Cell culture
T25 tissue culture flasksVWR734-2311Cell culture
15 mL tubesCorning430791Centrifuge tubes
1.5 mL tubeEppendorf0030123.3011.5 mL tube
CoolCell cell LXBiocisionBCS-405Freezing container
DMSOSigmaD2650-100mlFibroblast freezing
Cryovials 1.8 mLVWR479-6847Cryovials
PSC Cryopreservation KitGibcoA2644601PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%)ThermoFisherScientific25300054Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12Life Technologies31331-028Digestive enzymes dilutant
DPBSLife Technologies14190-094PBS
HBSSThermoFIsher Scientific14025-050Biopsy preparation
HaemocytometerSigmaBRAND, 718920Cell counting
ParafilmVWR291-1213Sealing plates for storage

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
  3. Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
  4. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  5. Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
  6. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  7. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
  8. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
  9. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  10. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
  11. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  12. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  13. Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
  14. Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
  15. Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
  16. Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
  17. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009)
  18. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
  19. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  20. Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
  21. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
  22. . Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016)
  23. Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

125 521

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved