Интеграция свободной деривации индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток с использованием матрицы Laminin 521

Резюме

Надежный вывод клеток, индуцированных человеком, с плюрипотентными стволовыми клетками (hiPS), был достигнут за счет использования неинтегрирующего вектора передачи вируса Сендай (SeV), опосредованного перепрограммированием дермальных фибробластов. Поддержание клеток hiPS и расширение клона было выполнено с использованием безсеносных и химически определенных условий культивирования с рекомбинантной матрицей ламинана человека 521 (LN-521) и средой Essential E8 (E8).

Аннотация

Ксено-свободные и полностью определенные условия являются ключевыми параметрами для надежной и воспроизводимой генерации однородных человеческих клеток с плюрипотентными стволовыми клетками (hiPS). Обслуживание клеток hiPS на фидерных клетках или неопределенных матрицах восприимчиво к периодическим отклонениям, патогенному загрязнению и риску иммуногенности. Использование определенной рекомбинантной матрицы человеческого laminin 521 (LN-521) в сочетании с безсеноновыми и определенными рецептурами среды снижает вариабельность и позволяет обеспечить последовательную генерацию клеток hiPS. Вектор вируса Сендай (SeV) представляет собой неинтегрирующую систему на основе РНК, поэтому можно обойти проблемы, связанные с потенциальным разрушительным эффектом на интеграционные векторы целостности генома. Кроме того, эти векторы продемонстрировали относительно высокую эффективность в перепрограммировании дермальных фибробластов. Кроме того, ферментативный односегментный пассаж клеток облегчает гомогенное поддержание клеток hiPS без существенного предшествующего опыта стволовых клетокКультуру. Здесь мы описываем протокол, который был широко протестирован и разработан с акцентом на воспроизводимость и простоту использования, обеспечивая надежный и практичный способ создания определенных и безсеносных человеческих hiPS-клеток из фибробластов.

Введение

Поскольку первый вывод клеточных линий hiPS по Takahashi et al. ^{1 , 2} , hiPS-клетки предоставили полезный инструмент для моделирования болезней, обнаружения лекарств и в качестве исходного материала для создания клеточной терапии в регенеративной медицине. ³ . Культура клеток hiPS уже давно зависит от совместной культивирования с фибробластовыми фидерными клетками ^{4 , 5} или Matrigel ⁶ и со средними препаратами, содержащими фетальную бычью сыворотку (FBS). Отклонения от партии к партии являются общим следствием неопределенного характера этих условий культуры, что приводит к непредсказуемым изменениям, что является основным фактором ненадежности этих протоколов ⁷ . Разработка определенной среды, такой как Essential 8 (E8) ⁸ и определенные матрицы клеточной культуры, например LN-521 ⁹ , позволяютS для установления высоковоспроизводимых протоколов и помощи в надежной генерации и поддержании гомогенных клеток hiPS ^{7 , 8 , 9 , 10} .

Развитие методов бесплатного перепрограммирования интеграции было скачком вперед. Первоначально перепрограммирование зависело от ретровирусных векторов, которые случайным образом интегрировались в геном с разрушительным воздействием на геномную целостность ¹¹ . Достижения в методологиях перепрограммирования включают разработку векторов на основе РНК. РНК-векторы имеют преимущество перед методом репрограммирования на основе ДНК, поскольку непреднамеренная интеграция через геномную рекомбинацию невозможна ¹² . SEV-векторы обеспечивают высокую и временную экспрессию экзогенных факторов посредством одноцепочечной РНК без ДНК-фазы ¹¹ . Перепрограммирующие векторы, поставляемые SeVРазводят по всему клеточному расширению и, в конце концов, избавляются от культуры, обеспечивая свободный способ перепрограммирования. После этого поддержание плюрипотентности зависит от эндогенной экспрессии плюрипотентных генов ² .

Поскольку новаторские методы терапии на основе hiPS начинают переходить в клинические испытания, требования к стандартизованным партиям, воспроизводимости и безопасности являются важными проблемами для решения проблемы ¹³ . Поэтому следует избегать продуктов животного происхождения. Например, использование ксеногенных продуктов связано с риском заражения нечеловеческим патогеном. Было показано, что клетки, культивируемые в присутствии компонентов культуры животного происхождения, включают в себя нечеловеческие силикатные кислоты в клеточные мембраны, которые угрожают сделать производные клетки иммуногенными ¹⁴ . Следовательно, необходимость устранения ксеногенных продуктов необходима для любых будущих клинических занятий. Этот протокол применяется xeБесплодная и определенная культура в поддержании клеток hiPS, перемещающих клетки ближе к клиническому соблюдению.

Этот протокол описывает последовательный, очень воспроизводимый и простой в использовании метод, который генерирует стандартизованные клетки hiPS из фибробластов. Он также предлагает удобную систему культивирования для обслуживания установленных hiPS-камер. Этот протокол был использован для получения более 300 линий клеточных линий hiPS на шведском национальном объекте iPS Core человека в Каролинском институте, из которых некоторые линии ранее были описаны ^{15 , 16} .

протокол

Сбор материала пациента и вывод клеток hiPS утверждается Советом по обзору этики, Стокгольм, 28 марта 2012 года, Регистрационный номер: 2012 / 208-31 / 3. Этапы клеточной культуры должны выполняться в шкафах биобезопасности, если не указано иное. При работе с клетками всегда применяйте методы стерильной обработки. Перед запуском дайте медикаментам, планшетам и реагентам достичь комнатной температуры. Инкубируйте клетки при 37 ° С, 5% СО ₂ при высокой влажности.

1. Выделение фибробластов человека из дермальной биопсии

1. Препараты культуральной среды, пищеварительные ферменты, покрытие посуды и инструменты для рассечения.
   1. Подготовьте среду фибробластов: 44,5 мл модифицированной среды Ивальсона (IMDM), 5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 500 мкл пенициллина / стрептомицина (PEST) (см. Таблицу 1 ), хранят при 4 ° C.
   2. Подготовьте пищеварительные ферменты при рабочей концентрации 1 мг / мл: weiGh аликвоты 4 мг порошка и коллагеназы типа I в отдельных 15-мл пробирках и растворяют в 4 мл DMEM / F12 + 1% PEST. Стерилизуйте ферментативный раствор, пропустив его через фильтр 0,22 мкм. Подготавливайте свежие ферментные растворы каждый раз.
   3. Покройте одну лунку в 6-луночной планшете для культивирования ткани (или 35-миллиметровой чашке для культивирования ткани) на биопсию, которую разрезают 1 мл 0,1% желатина в забуференном фосфатом физиологическом растворе (DPBS). Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 мин.
   4. Автоклавируйте один набор хирургических ножниц и щипцов для биопсии для вскрытия.
2. Биопсия
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс биопсии как можно быстрее после взятия. Хранить в PBS + 1% PEST в течение 48 часов при температуре 4 ° C. Биопсия должна иметь диаметр 2-4 мм в диаметре и в соответствии с этическими разрешениями.
   1. Передайте биопсию в 35-миллиметровое блюдо. Переместите биопсию на новую 35-миллиметровую тарелку и погрузите биопсию в 2 мл 70% этанола в течение 30 с.
   2. Переместите биопсию на третью35-миллиметровую посуду и промыть 1 мл стерильного сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS), дополненного 1% PEST.
   3. Перенесите биопсию на четвертую 35-миллиметровую чашку, добавьте 1 мл свежеприготовленного 0,1% раствора для дозирования.
   4. Вырежьте биопсию кожи на 1 - 2 мм ³ части в чашке, используя хирургические ножницы и щипцы, а затем передайте фрагменты биопсии, включая раствор для дозирования, в 15-мл пробирку. Добавьте еще 2 мл дозирования.
   5. Прополощите 35-миллиметровое блюдо с 1 мл раствора для дозирования и перенесите в 15-мл пробирку.
   6. Инкубируйте биопсию при 4 ° C в течение ночи.
   7. Добавьте 4 мл 0,1% коллагеназы I в пробирку и инкубируйте при 37 ° C в течение 4 часов.
   8. Центрифугировать расщепленные клетки 300 мкг в течение 3 мин, аспирировать супернатант и ресуспендировать переваривание в 2 мл фибробластной среды.
   9. Удалите раствор желатина из 6-луночного планшета для культивирования ткани. Перенесите клеточную суспензию, включая любые оставшиеся части, на 6-луночный планшет для культивирования тканей (или 35-метровыйM), предварительно покрытый 0,1% желатином в DPBS.
   10. Меняйте среду каждый третий день.
3. Расширение человеческих фибробластов
   ПРИМЕЧАНИЕ. Фибробласты готовы к пассированию в колбу для тканевой культуры T25 (25 см ² ), когда 80% конфлюентны ( рис. 2В ). Фибробласты обычно достигают 80% слияния в течение 7 дней. Однако требуемое время может сильно различаться, но должно быть не более 4 недель.
   1. Аспирируют среду и промывают один раз 2,5 мл DPBS.
   2. Удалите DPBS и добавьте 1 мл трипсина-EDTA (0,05%) и инкубируйте при 37 ° C в течение 5 минут или пока клетки не покажут закругленные края и не начнут отсоединяться.
   3. Добавьте 2 мл фибробластной среды, при необходимости промойте клетки, обеспечивающие надлежащую дезассоциацию клеток. Перенесите раствор клетки в 15-мл пробирку и центрифугируйте при 300 × g в течение 3 мин.
   4. Удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 5 мл фибробластной среды и пластинчатых фибробластах вНа колбасе T25 на клеточной ткани. При расширении фибробластов после этой стадии диссоциировать, как описано выше, и затравливать 12 × 10 ³ клеток / см ² .
   5. После того, как конфлюентные клетки готовы к замораживанию, расширьте или перепроверьте планшет. Заморозьте два раунда фибробласта до начала любого перепрограммирования (см. Следующий раздел для процедуры замораживания). Эффективность перепрограммирования, как правило, выше для фибробластов нижних проходов, клетки в проходе 2-4 являются оптимальными. Однако успешное перепрограммирование фибробластов до прохода 10 было проведено с использованием этого протокола.
4. Замораживание и оттаивание фибробластов
   1. Подготовьте свежую среду для замораживания фибробластов: 90% FBS + 10% диметилсульфоксид (ДМСО). Хранить при температуре 4 ° C ( таблица 1 ). После конфлюэнта колбу для культивирования ткани T25 можно заморозить на три криолителя. Подготовьте 500 мкл среды для замораживания фибробластов на замороженный флакон.
   2. Чтобы заморозить клетки, диссоциировать cКак описано в шаге 1.3, подсчитывают клетки с использованием гемоцитометра и переносят порции 3 × 10 ⁵ клеток в 15-миллилитровые пробирки. Спиновые трубки при 300 xg в течение 3 мин. Супернатант аспирата.
   3. Ресуспендируют клеточные гранулы в 500 мкл 4 ˚C фибробластов замерзающей среды и переносят в криогенные сосуды. Поместите флаконы в морозильный контейнер и инкубируйте клетки при -80 ° C в течение 24 часов, прежде чем переносить их в жидкий азот для длительного хранения.
   4. Чтобы оттереть клетки, погрузите нижнюю часть криовиальной воды в 37 ° C. После сжижения переносите суспензию клеток в 15-мл пробирку и добавьте 5 мл фибробластной среды. Спиновые клетки 300 мкг в течение 3 мин.
   5. Удаляют супернатант и ресуспендируют клеточный осадок в 5 мл фибробластной среды. Перенесите клетки в непрозрачную колбу для культуры ткани T25 и инкубируйте при 37 ° C.

2. SeV Vector Перепрограммирование фибробластов

1. Получение векторных аликвот
   ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Обращайтесь с SeV в соответствии с защитой уровня 2 биобезопасности. См. Протокол изготовителя и местные рекомендации ¹⁷ . Тираж вируса варьируется между партиями.
   1. Перед приготовлением аликвоты рассчитывают количество вектора, необходимого для 5 × 10 ⁴ клеток в соответствии с протоколом производителя ( например , CytoTune 2.0). Титр вируса обычно изменяется от 8 × 10 ⁷ - 1,5 × 10 ⁸ . Оттепель и комбинированные векторы 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 и hKlf4 = MOI 3). Порцию количество, рассчитанное для перепрограммирования 5 × 10 ⁴ клеток в автоклавированные трубки объемом 1,5 мл. Разбавьте аликвоты вируса с фибробласт-средой до конечного объема 250 мкл для перепрограммирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Каждый флакон действителен для перепрограммирования одной лунки 24-луночного планшета для культуры тканей с 5 × 10 ⁴ фибробластами. Хранить аликвоты вируса при -80 ° C.
2. SeV Векторная трансдукция
   1. Аспирируйте ячейку cuLt; lt; lt; lt; Аспирируйте DPBS и добавьте 1 мл трипсина-ЭДТА (0,05%). Инкубируйте при 37 ° С в течение 5 мин или до отделения клеток.
   2. Добавьте 2 мл фибробластной среды и ресуспендируйте клетки и перенесите в 15-мл пробирку. Центрифуга 300 xg в течение 3 мин.
   3. Аспирируют супернатант и ресуспендируют гранулу в 2 мл фибробластной среды.
   4. Подсчитайте фибробласты, используя гемоцитометр и семена 5 × 10 ⁴ клеток в одной лунке 24-луночного планшета для культуры тканей. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение ночи.
   5. Аспирирующую среду для культивирования клеток, добавьте 250 мкл раствора SeV и инкубируйте при 37 ° С в течение ночи.
   6. Ежедневно меняйте среду на свежий фибробласт. Разрешить трансдуцированным клеткам расти в течение 7 дней перед пассированием на покрытые LN-521 пластины. Подготовьте пластины LN-521 за день до прохода. См. 2.3.1 для процедуры нанесения покрытия.
3. Репликация трансдуцированных фибробластов
   1. Получение LN-521: разбавить LN-521 в DPBS до конечной концентрации 0,63 мкг / см ² . Пипетируют 2 мл раствора LN-521 на 60-миллиметровой чашке для культивирования ткани. Уплотните 60-миллиметровое блюдо для культивирования ткани, используя парафильм. Инкубируйте в течение ночи при 4 ° C.
   2. Подготовьте аликвоты Essential 8 medium (E8) для облегчения обработки: 48,5 мл среды E8, 1 мл добавки E8 и 500 мкл PEST ( таблица 1 ).
   3. Через 7 дней после трансдукции пропускают клетки в чашку для культивирования ткани размером 60 мм, покрытую LN-521. Добавить 250 мкл трипсина-ЭДТА (0,05%) и инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин или до отделения клеток. Добавьте 2 мл фибробластной среды и центрифужных клеток в течение 3 мин при 300 × g.
   4. Аспирируйте супернатант. Ресуспендируют гранулу в 2 мл фибробластной среды и подсчитывают клетки в гемоцитометре. Аспирируйте раствор LN-521 из предварительно покрытой пластины и семян 4 × 10 ⁴ клеток в 5 мл фибробластной среды в предварительно наготовленной 60-миллиметровой тарелке LN-521. Добавить ингибитор Rho-киназы Y-27632(ROCKi) до конечной концентрации 5 мкМ. Инкубируйте при 37 ° С в течение ночи.
   5. Важно отметить, что на следующий день измените среду на среду E8. Ежедневно меняйте E8. Колонии клеток hiPS появятся в течение 2 - 3 недель.

3. Сбор колоний и расширение клеток hiPS

ПРИМЕЧАНИЕ. Следующие шаги выполняются за пределами шкафа биобезопасности под стереомикроскопом. Рекомендуется использовать маски для волос и процедуры. Тщательно старайтесь не загрязнять клеточную культуру.

1. Подготовьте 24-луночные планшеты с тканевой культурой, покрытые LN-521, за день до сбора. Разбавьте LN-521 в DPBS 0,63 мкг / см ² . Пипетируют 250 мкл раствора LN-521 в одну лунку 24-луночного планшета для культивирования ткани. Уплотнения с использованием парафильма. Инкубируйте в течение ночи при 4 ° C.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Колонии готовы к сборке, когда они достигают размера> 1 мм в диаметре. Колонии должны отображать острые края и расти в однородном( Рисунок 2D ).
2. Аспирируйте раствор LN-521 и добавьте 500 мкл E8 в одну лунку 24-луночного планшета для культуры тканей.
3. Сократите колонии на более мелкие кусочки с помощью скальпеля в сетке, подобной рисунку под стереомикроскопом. Механически очистите клеточные листы от тарелки и перенесите листы с помощью пипетки 200 мкл в подготовленную лунку ( рис. 2D -2E ). Выбирайте колонии в отдельные колодцы.
4. Разрешить прикрепление ячеек без изменения среды в течение 48 часов. После этого ежедневно меняйте среду E8.
5. Когда колонии достигли размера> 5 мм, ферментативно просачивают клетки в виде отдельных клеток в новую лунку покрытой LN-521 пластины.
6. Аспирируют клеточную культуральную среду из клеток и промывают 250 мкл DPBS.
7. Аспирируйте DPBS. Добавить 250 мкл диссоциативного реагента и инкубировать в течение 3 мин при 37 ° С.
8. Обратите внимание, что клетки начали округлять. отрыватьКлеток из пластинки, промывая клетки реагентом диссоциации несколько раз.
9. Добавить 500 мкл среды E8 в 15-мл пробирку. Перенесите клетки в реагент диссоциации в пробирку и центрифугируйте в течение 3 мин при 300 × g.
10. Аспирируйте раствор LN-521 из предварительно залитой лунки LN-521 и добавьте 500 мкл комнатной температуры E8.
11. Аспирируют супернатант и ресуспендируют клеточный осадок в 500 мкл среды E8.
12. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и семян 2,5 × 10 ⁴ - 5 × 10 ⁴ клеток в подготовленной лунке с предварительным покрытием LN-521 (1,25 × 10 ⁴ - 2,5 × 10 ⁴ клеток / см ² ). Формат культуры клеток можно легко масштабировать в соответствии с назначением.
13. Добавить ROCKi до конечной концентрации 10 мкМ. Инкубируйте клетки при 37 ° C.
14. Ежедневно меняйте E8. Клетки обычно готовы к прохождению через 4 - 6 дней. Ферментативно прохожущие клетки в виде отдельных клеток, как описано выше, когда около 90% конфлюентных,
    ПРИМЕЧАНИЕ: векторы перепрограммирования постепенно разводятся во время расширения ячейки hiPS и не обнаруживаются после прохождения 12. Ячейки, которые беспристрастно перепрограммируются, обычно перестают размножаться вокруг прохода 6-10 или теряют свою характерную полипотентную морфологию стволовых клеток ( рисунок 3B ).
15. Замораживание и оттаивание hiPS-клеток
    1. Чтобы заморозить клетки, ферментативно диссоциировать клетки как отдельные клетки, как описано выше, подсчитать клетки в гемоцитометре и перенести 2,5 × 10 ⁵ клеток в 15-мл пробирку, содержащую 1 мл среды E8. Центрифуга при 300 мкг в течение 3 мин. Аспирируйте супернатант.
    2. Ресуспендируют клеточный осадок в 250 мкл 4 ° C PSC криомедиума и переносят в криовальную. Поместите флакон в морозильный контейнер и инкубируйте клетки при -80 ° C в течение 24 часов, прежде чем переносить их в жидкий азот для длительного хранения.
    3. Для оттаивания клеток готовят предварительно окрашенную лунку LN-521 в 24-луночной тканиПластины путем аспирации раствора LN-521 и добавления 250 мкл среды E8. Погрузите нижнюю часть криовиальной воды в 37 ° C до тех пор, пока не останется только небольшая сосулька.
    4. Добавьте 250 мкл среды E8 в криовальную систему и перенесите суспензию клеток в 15-мл пробирку и добавьте 1 мл среды E8. Спиновые клетки 300 мкг в течение 3 мин.
    5. Удаляют супернатант и ресуспендируют клеточный осадок в 250 мкл среды E8 комнатной температуры. Перенесите суспензию клеток в подготовленную лунку и добавьте 1% -ную добавку жизнеспособности клеток или 10 мкМ ROCKi. Инкубируйте планшет для тканевой культуры при 37 ° C.

Результаты

От биопсии до клеток hiPS

Весь процесс от биопсии к установленным клеткам hiPS, свободный от вектора перепрограммирования и готовый к характеристике, занимает приблизительно 16 недель ( рис. 1 ). Более подробная временная шкал...

Обсуждение

Ожидаемым результатом этого протокола является успешное создание нескольких клонированных клеточных линий hiPS. Важно отметить, что способ поддержания и расширения установленных hiPS-клеток, описанный здесь, является надежным и может быть осуществлен с небольшим предварительным опытом...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase	Life Technologies	171105-041	Biopsy digestion
Collagenase	Sigma	C0130	Biopsy digestion
Gelatin	Sigma	G1393	Fibroblast matrix
IMDM	Life Technologies	21980002-032	Fibroblast medium
FBS	Invitrogen	10270106	Fibroblast medium
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Antibiotic
Essential 8 media	ThermFisher Scientific	A1517001	iPS cell culture media
LN-521	Biolamina	LN521-03	iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X	ThermoFisher Scientific	12563011	Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit	Life Technologies	A1377801	Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish	Sarstedt	83.3900.300	Cell culture
60 mm tissue culture dishes	Sarstedt	83.3901.300	Cell culture
24 well tissue culture plates	Sarstedt	83.3922.300	Cell culture
T25 tissue culture flasks	VWR	734-2311	Cell culture
15 mL tubes	Corning	430791	Centrifuge tubes
1.5 mL tube	Eppendorf	0030123.301	1.5 mL tube
CoolCell cell LX	Biocision	BCS-405	Freezing container
DMSO	Sigma	D2650-100ml	Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 mL	VWR	479-6847	Cryovials
PSC Cryopreservation Kit	Gibco	A2644601	PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%)	ThermoFisherScientific	25300054	Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12	Life Technologies	31331-028	Digestive enzymes dilutant
DPBS	Life Technologies	14190-094	PBS
HBSS	ThermoFIsher Scientific	14025-050	Biopsy preparation
Haemocytometer	Sigma	BRAND, 718920	Cell counting
Parafilm	VWR	291-1213	Sealing plates for storage