Intégration de la dérivation libre de cellules souches pluripotentes induites par l'homme à l'aide de Laminin 521 Matrix

Résumé

La dérivation robuste des cellules de la tige pluripotente induite par l'homme (hiPS) a été réalisée en utilisant une reprogrammation médiée par vecteur de virus Sendai non-intégrant (SeV) des fibroblastes dermiques. La maintenance cellulaire de hiPS et l'expansion clonale ont été réalisées en utilisant des conditions de culture sans xénon et chimiquement définies avec une matrice recombinante de la laminine humaine 521 (LN-521) et un milieu E8 (E8) essentiel.

Résumé

Les conditions exemptes de Xeno et totalement définies sont des paramètres clés pour la génération robuste et reproductible de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPS) homogènes. La maintenance des cellules HiPS sur les cellules nourricières ou les matrices non définies sont sensibles aux variances discontinues, à la contamination pathogène et au risque d'immunogénicité. L'utilisation de la matrice recombinante de la laminine humaine 521 (LN-521) définie en combinaison avec des formulations de média xénoïdes et définies réduit la variabilité et permet la génération cohérente de cellules HiPS. Le vecteur de virus Sendai (SeV) est un système à base d'ARN non intégrant, contournant ainsi les préoccupations liées à l'effet perturbateur potentiel sur les vecteurs intégrant l'intégrité du génome. En outre, ces vecteurs ont démontré une efficacité relativement élevée dans la reprogrammation des fibroblastes dermiques. En outre, le passage enzymatique à une seule cellule des cellules facilite l'entretien homogène des cellules HiPS sans une expérience préalable substantielle de la tigeLl culture. Ici, nous décrivons un protocole qui a été largement testé et développé en mettant l'accent sur la reproductibilité et la facilité d'utilisation, fournissant un moyen robuste et pratique de générer des cellules hiPS humaines définies et exemptes de xénon à partir de fibroblastes.

Introduction

Depuis la première dérivation des lignées cellulaires hiPS par Takahashi et al. ^{1 , 2} , les cellules HiPS ont fourni un outil utile pour la modélisation de la maladie, la découverte de médicaments et comme matériau de base pour la génération de thérapies cellulaires dans la médecine régénératrice ³ . La culture cellulaire hiPS a longtemps dépendu de la co-culture avec des cellules nourrissantes de fibroblastes ^{4 , 5} ou sur Matrigel ⁶ et avec des formulations de média contenant du sérum bovin fœtal (FBS). Les variances de lot à lot sont une conséquence courante de la nature indéfinie de ces conditions de culture, ce qui entraîne des variations imprévisibles, ce qui contribue grandement à la non fiabilité de ces protocoles ⁷ . Le développement de moyens définis tels que Essential 8 (E8) ⁸ et des matrices de culture cellulaire définies, par exemple LN-521 ⁹ , permettentS pour l'établissement de protocoles hautement reproductibles et aide à la génération et à la maintenance robustes des cellules HiPS homogènes ^{7 , 8 , 9 , 10} .

Le développement de techniques de reprogrammation sans intégration a été un bond en avant. À l'origine, la reprogrammation dépendait de vecteurs rétroviraux qui s'établissaient de manière aléatoire dans le génome avec des effets perturbateurs sur l'intégrité génomique ¹¹ . Les progrès dans les méthodologies de reprogrammation comprennent le développement de vecteurs à base d'ARN. Les vecteurs d'ARN ont un avantage par rapport à la méthode de reprogrammation basée sur l'ADN car une intégration involontaire par recombinaison génomique n'est pas possible ¹² . Les vecteurs SeV fournissent une expression élevée et transitoire de facteurs exogènes par l'ARN monocaténaire sans phase d'ADN ¹¹ . Les vecteurs de reprogrammation livrés par le SeVSont dilués tout au long de l'expansion de la cellule et finissent par se débarrasser de la culture en fournissant un mode de reprogrammation sans impression imprimée. Par la suite, le maintien de la pluripotence dépend de l'expression endogène des gènes de pluripotence ² .

Au fur et à mesure que les thérapies basées sur les cellules hiPS avancées commencent à se lancer dans des essais cliniques, les demandes de lots, de reproductibilité et de sécurité standardisés sont des problèmes essentiels à résoudre ¹³ . Par conséquent, les produits d'origine animale devraient être évités. Par exemple, l'utilisation de produits xénogénétiques a été associée au risque de contamination par des agents pathogènes non humains. En outre, les cellules cultivées en présence de composants de culture dérivés d'animaux ont montré qu'ils incorporent des acides siliques non humains dans des membranes cellulaires qui menacent de rendre les cellules dérivées immunogènes ¹⁴ . Par conséquent, la nécessité d'éliminer les produits xénogénétiques est nécessaire à toute poursuite clinique future. Ce protocole s'applique xeUne culture non libre et définie dans la maintenance des cellules HiPS se déplace des cellules plus près de la conformité clinique.

Ce protocole décrit une méthode cohérente, hautement reproductible et facile à utiliser qui génère des cellules HiPS normalisées à partir de fibroblastes. Il offre également un système de culture convivial pour la maintenance de cellules hiPS établies. Ce protocole a été utilisé pour dériver plus de 300 lignées cellulaires hiPS dans l'installation suédoise nationale iPS Core chez Karolinska Institutet dont certaines lignes ont déjà été décrites ^{15 , 16} .

Protocole

La collecte du matériel du patient et la dérivation des cellules HiPS sont approuvées par le Ethics Review Board, Stockholm, le 28 mars 2012, numéro d'enregistrement: 2012 / 208-31 / 3. Les étapes de culture cellulaire doivent être effectuées dans des armoires de sécurité biologique, sauf mention contraire. Toujours pratiquer des techniques de manipulation stérile lorsque vous travaillez avec des cellules. Permet aux médias, les plaques et les réactifs d'atteindre la température ambiante avant de commencer. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO ₂ à haute humidité.

1. Isolation des fibroblastes humains à partir de biopsie cutanée

1. Préparations de milieu de culture, enzymes digestives, revêtement de vaisselle et outils de dissection.
   1. Préparer le milieu de fibroblastes: 44,5 mL du milieu Dulbecco modifié par IMDG (Isabelle), 5 mL de sérum bovin fœtal (FBS) et 500 μL de pénicilline / streptomycine (PEST) (voir tableau 1 ), conserver à 4 ° C.
   2. Préparer des enzymes digestives à une concentration de travail de 1 mg / mL: weiGh aliquotes de 4 mg de dispase et de la poudre de collagénase de type I dans des tubes séparés de 15 ml et dissolvent dans 4 mL de DMEM / F12 + 1% de PEST. Stériliser la solution enzymatique en la passant par une crépine de 0,22 μm. Préparez des solutions enzymatiques fraîches à chaque fois.
   3. Enduire un puits dans une plaque de culture de tissu de 6 puits (ou un plat de culture de tissu de 35 mm) par biopsie disséquée avec 1 ml de gélatine à 0,1% dans une solution saline tamponnée au phosphate (DPBS). Incuber à température ambiante pendant 30 min.
   4. Autoclavez un ensemble de ciseaux chirurgicaux et de pinces par biopsie pour dissection.
2. Traitement de la biopsie
   REMARQUE: organisez les biopsies le plus rapidement possible après avoir été prises. Stockez dans PBS + 1% PEST jusqu'à 48 h à 4 ° C. La biopsie doit être de 2 à 4 mm de diamètre et conformément aux permis éthiques.
   1. Transférer la biopsie dans un plat de 35 mm. Déplacez la biopsie dans un nouveau plat de 35 mm et immergez la biopsie dans 2 ml d'éthanol à 70% pendant 30 s.
   2. Déplacer la biopsie à un tiersPlateau de 35 mm et lave avec 1 ml de solution de sel équilibré Hank stérile (HBSS) additionnée de 1% de PEST.
   3. Transférer la biopsie dans un quatrième plat de 35 mm, ajouter 1 ml d'une solution préparée à 0,1%.
   4. Coupez la biopsie de la peau en 1 à 2 mm ³ dans le plat en utilisant des ciseaux chirurgicaux et des pinces, puis transférez des morceaux de biopsie, y compris la solution dispersée dans un tube de 15 ml. Ajouter 2 ml supplémentaires de dispase.
   5. Rincer le plat de 35 mm avec une solution de 1 mL et passer au tube de 15 ml.
   6. Incuber la biopsie à 4 ° C pendant la nuit.
   7. Ajouter 4 ml de 0,1% de collagénase I au tube et incuber à 37 ° C pendant 4 h.
   8. Centrifuger les cellules digérées 300 xg pendant 3 min, aspirer le surnageant et remettre à nouveau en suspension dans 2 mL de milieu fibroblaste.
   9. Retirer la solution de gélatine de la plaque de culture tissulaire à 6 puits. Transférer la suspension de la cellule, y compris les morceaux restants sur une plaque de culture tissulaire de 6 po (ou 35 mM plaque de culture de tissu) pré-revêtue avec 0,1% de gélatine dans du DPBS.
   10. Changez le moyen tous les trois jours.
3. Expansion des fibroblastes humains
   REMARQUE: Les fibroblastes sont prêts à être passés dans un flacon de culture tissulaire T25 (25 cm ² ) lorsque 80% confluent ( figure 2B ). Les fibroblastes atteignent généralement 80% de confluence dans les 7 jours. Cependant, le temps nécessaire peut varier considérablement mais ne doit pas dépasser 4 semaines.
   1. Aspirer le milieu et laver une fois avec 2,5 ml de DPBS.
   2. Enlever le DPBS et ajouter 1 ml de trypsine-EDTA (0,05%) et incuber à 37 ° C pendant 5 min ou jusqu'à ce que les cellules présentent des bords arrondis et commencent à se détacher.
   3. Ajouter 2 ml de milieu fibroblaste, si nécessaire, rincer les cellules en assurant une désassociation appropriée des cellules. Transférer la solution cellulaire dans un tube de 15 ml et centrifuger à 300 xg pendant 3 min.
   4. Jeter le surnageant et remettre à nouveau le culot cellulaire dans 5 mL de fibroblastes et former des fibroblastes dans unFlacon T25 de culture de tissu cellulaire sur couche. Lors de l'expansion des fibroblastes après cette étape, se dissocier comme décrit ci-dessus et semer 12 x 10 ³ cellules / cm ² .
   5. Une fois que les cellules confluentes sont prêtes à être gelées, développez ou plaque pour la reprogrammation. Congéler deux cycles de fibroblastes avant toute nouvelle reprogrammation (voir la section suivante pour la procédure de congélation). L'efficacité de la reprogrammation est généralement plus élevée pour les fibroblastes de passage inférieur, les cellules au passage 2 à 4 sont optimales. Cependant, la reprogrammation réussie des fibroblastes jusqu'au passage 10 a été effectuée en utilisant ce protocole.
4. Congélation et décongélation des fibroblastes
   1. Préparer un milieu de congélation de fibroblastes frais: 90% de FBS + 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO). Conserver à 4 ° C ( Tableau 1 ). Une fois confluent, le flacon de culture tissulaire T25 peut être congelé en trois cryovials. Préparer 500 μL de milieu de congélation par fibroblaste par flacon congelé.
   2. Pour congeler les cellules, dissociez cComme décrit à l'étape 1.3, comptent des cellules en utilisant un hémocytomètre et transfèrent des portions de 3 x 10 ⁵ cellules à des tubes de 15 ml. Essuyer les tubes à 300 xg pendant 3 min. Aspirer le surnageant.
   3. Remettre en suspension les granulés cellulaires dans 500 μL de milieu de congélation fibroblaste à 4 ° C et transférer dans des cryogéniques. Placez les flacons dans un récipient de congélation et incube les cellules à -80 ° C pendant 24 h avant de les transférer à l'azote liquide pour un stockage à long terme.
   4. Pour décongeler les cellules, immerger la partie inférieure du cryovial à 37 ° C d'eau. Une fois liquéfiés, transférer la suspension cellulaire dans un tube à 15 mL et ajouter 5 mL de milieu fibroblaste. Spin cells 300 xg pendant 3 min.
   5. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de milieu fibroblaste. Transférer des cellules dans un flacon de culture tissulaire T25 non revêtu et incuber à 37 ° C.

2. Reprogramme Vectorielle SeV des Fibroblastes

1. Préparation d'aliquotes vectorielles
   ATTENTION: manipuler le SeV sous le contrôle du niveau de biosécurité 2. Reportez-vous au protocole du fabricant et aux directives locales ¹⁷ . Le titre du virus varie entre les lots.
   1. Avant de préparer des aliquotes, calculer la quantité de vecteur nécessaire pour 5 x 10 ⁴ cellules selon le protocole du fabricant ( p . Ex . , CytoTune 2.0). Le titre du virus varie généralement de 8 x 10 ⁷ - 1,5 x 10 ⁸ . Décongeler et combiner les vecteurs 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 et hKlf4 = MOI 3). Portez le montant calculé pour la reprogrammation de 5 x 10 ⁴ cellules dans des tubes de 1,5 mL autoclavés. Diluer les aliquotes de virus avec un milieu de fibroblaste jusqu'à un volume final de 250 μL pour la reprogrammation.
      NOTE: Chaque flacon est valable pour la reprogrammation d'un puits d'une plaque de culture tissulaire de 24 puits avec 5 x 10 ⁴ fibroblastes. Conserver les aliquotes de virus à -80 ° C.
2. Transduction du vecteur SeV
   1. Aspirer la celluleLuring medium et laver avec 1 mL de DPBS. Aspirez le DPBS et ajoutez 1 ml de trypsine-EDTA (0,05%). Incuber à 37 ° C pendant 5 min ou jusqu'à ce que les cellules soient détachées.
   2. Ajouter 2 ml de milieu de fibroblastes et ré-endiguer les cellules et les transférer dans un tube de 15 ml. Centrifuge 300 xg pendant 3 min.
   3. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 2 ml de milieu fibroblaste.
   4. Compter les fibroblastes en utilisant un hémocytome et semer 5 x 10 ⁴ cellules dans un puits d'une plaque de culture tissulaire à 24 puits. Incuber les cellules à 37 ° C pendant une nuit.
   5. Aspirer le milieu de culture cellulaire, ajouter 250 μL de la solution de SeV et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
   6. Changez quotidiennement le milieu au milieu fibroblaste frais. Permettre aux cellules transduites de croître pendant 7 jours avant d'être passées dans des plaques revêtues de LN-521. Préparez les plaques LN-521 le jour avant le passage. Voir 2.3.1 pour la procédure de revêtement.
3. Réplique des fibroblastes transduits
   1. Préparation de LN-521 vaisselle revêtue: Diluer LN-521 dans du DPBS jusqu'à une concentration finale de 0,63 μg / cm ² . Pipettez 2 mL de la solution LN-521 pour un plat de culture tissulaire de 60 mm. Sceller le plat de culture de tissu de 60 mm en utilisant du parafilm. Incuber pendant une nuit à 4 ° C.
   2. Préparez les aliquotes moyennes Essential 8 (E8) pour une manipulation plus facile: 48,5 ml de milieu E8, 1 ml de supplément E8 et 500 μL de PEST ( tableau 1 ).
   3. 7 jours après la transduction, passage des cellules à un plat de culture de tissus 60 mm revêtu de LN-521. Ajouter 250 μL de trypsine-EDTA (0,05%) et incuber à 37 ° C pendant 5 min ou jusqu'à ce que les cellules se soient détachées. Ajouter 2 ml de milieu fibroblaste et centrifuger des cellules pendant 3 min à 300 x g.
   4. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension les pastilles dans 2 mL de milieu fibroblaste et compter les cellules dans un hémocytomètre. Aspirer la solution LN-521 à partir de la plaque pré-revêtue et semer 4 x 10 ⁴ cellules dans 5 ml de milieu fibroblaste dans le plat LN-521 pré-revêtu de 60 mm. Ajouter l'inhibiteur de Rho-kinase Y-27632(ROCKi) à une concentration finale de 5 μM. Incuber à 37 ° C pendant la nuit.
   5. Fait important, le lendemain, changez de moyenne à moyenne E8. Changer E8 moyen tous les jours. Les colonies de cellules HiPS apparaîtront dans les 2 à 3 semaines.

3. Picking of Colonies and Expansion of HiPS Cells

REMARQUE: les étapes suivantes sont effectuées en dehors du coffret de sécurité biologique sous un microscope stéréo. L'utilisation de masques de défilement et de procédure est recommandée. Travailler soigneusement pour ne pas contaminer la culture cellulaire.

1. Préparer des plaques à 24 po de culture tissulaire recouvertes de LN-521 le jour avant la cueillette. Diluer LN-521 dans DPBS 0,63 μg / cm ² . Pipetter 250 μL de la solution LN-521 dans un puits d'une plaque de culture tissulaire à 24 puits. Plaques d'étanchéité à l'aide de parafilm. Incuber pendant une nuit à 4 ° C.
   NOTE: Les colonies sont prêtes à être choisies lorsqu'elles atteignent une taille> 1 mm de diamètre. Les colonies devraient afficher des bords tranchants et croître en un monomètre homogèneOlayers ( figure 2D ).
2. Aspirez la solution LN-521 et ajoutez 500 μL de E8 dans un puits d'une plaque de culture tissulaire à 24 puits.
3. Couper les colonies en petits morceaux avec un scalpel dans une grille comme un motif sous un stéréomicroscope. Rincez mécaniquement les feuilles de cellules du plat et transférez les feuilles en utilisant une pipette de 200 μL au puits préparé ( Figure 2D -2E ). Choisissez les colonies dans des puits distincts.
4. Permettre aux cellules de se fixer sans changer de support pendant 48 h. Ensuite, changez E8 moyennement par jour.
5. Lorsque les colonies ont atteint une taille de> 5 mm, les cellules de passage enzymatique en tant que cellules individuelles dans un nouveau puits d'une plaque revêtue de LN-521.
6. Aspirer le milieu de culture cellulaire des cellules et laver avec 250 μL de DPBS.
7. Aspirez le DPBS. Ajouter 250 μL de réactif de dissociation et incuber pendant 3 min à 37 ° C.
8. Observez que les cellules ont commencé à s'arranger. DétacherCellules de la plaque en rinçant les cellules avec un réactif de dissociation à plusieurs reprises.
9. Ajouter 500 μL de milieu E8 à un tube de 15 ml. Transférer les cellules dans le réactif de dissociation au tube et centrifuger pendant 3 min à 300 x g.
10. Aspirer la solution LN-521 du puits pré-revêtu LN-521 et ajouter 500 μL de température ambiante E8 moyenne.
11. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 μL de milieu E8.
12. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et semer 2,5 x 10 ⁴ - 5 x 10 ⁴ cellules dans le puits pré-revêtu LN-521 préparé (1,25 x 10 ⁴ - 2,5 x 10 ⁴ cellules / cm ² ). Le format de culture cellulaire peut facilement être amélioré en fonction du but recherché.
13. Ajouter ROCKi à une concentration finale de 10 μM. Incuber les cellules à 37 ° C.
14. Changer E8 moyen tous les jours. Les cellules sont habituellement prêtes à passer après 4 à 6 jours. Cellules de passage enzymatique comme cellules individuelles comme décrit ci-dessus lorsque environ 90% confluent.
    NOTE: Les vecteurs de reprogrammation sont progressivement dilués au cours de l'expansion de la cellule hiPS et ne sont pas détectables après le passage 12. Les cellules qui sont reprogrammées de manière impartiale cessent généralement de proliférer autour du passage 6-10 ou perdent leur morphologie caractéristique de la cellule souche pluripotente ( figure 3B ).
15. Congélation et décongélation des cellules HiPS
    1. Pour congeler des cellules, dissocier enzymatiquement les cellules comme cellules simples comme décrit ci-dessus, compter les cellules dans un hémocytomètre et transférer 2,5 x 10 ⁵ cellules dans un tube de 15 ml contenant 1 ml de milieu E8. Centrifuger à 300 xg pendant 3 min. Aspirer le surnageant.
    2. Remettre en suspension la culot cellulaire dans 250 μL de cryomedium PSC à 4 ° C et transférer à un cryogène. Placer le flacon dans un récipient de congélation et incuber les cellules à -80 ° C pendant 24 h avant de les transférer à l'azote liquide pour un stockage à long terme.
    3. Pour décongeler les cellules, préparer un puits LN-521 pré-revêtu d'une culture tissulaire à 24 puitsPlaque en aspirant la solution LN-521 et en ajoutant 250 μL de milieu E8. Immergez la partie inférieure du cryovial à 37 ° C d'eau jusqu'à ce que seul un petit glaçon reste.
    4. Ajouter 250 μL de E8 Medium au cryovial et transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et ajouter 1 ml de milieu E8. Spin cells 300 xg pendant 3 min.
    5. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 250 μL de température ambiante E8 moyenne. Transférer la suspension cellulaire dans le puits préparé et ajouter un supplément de viabilité cellulaire de 1% ou ROCKi 10 μM. Incuber la plaque de culture tissulaire à 37 ° C.

Résultats

De la biopsie aux cellules HiPS

L'ensemble du processus, de la biopsie aux cellules hiPS établies, sans vecteur de reprogrammation et prêt à être caractérisé, prend environ 16 semaines ( Figure 1 ). Un calendrier plus détaillé est spécifié dans la figure 2A . Il faut environ 4 semaines pour établir et développer des cultures de fibroblastes. Les première...

Discussion

Le résultat attendu de ce protocole est la génération réussie de plusieurs lignées cellulaires hiPS dérivées de manière clonale. Il est important de noter que la méthode pour la maintenance et l'expansion des cellules hiPS établies ici décrit est fiable et peut être effectuée avec peu d'expérience préalable de la culture de cellules souches. Le transfert enzymatique d'une seule cellule avec ROCKi avec la matrice LN-521 est connu pour maintenir les cellules comme caryotypiquement normales, plur...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase	Life Technologies	171105-041	Biopsy digestion
Collagenase	Sigma	C0130	Biopsy digestion
Gelatin	Sigma	G1393	Fibroblast matrix
IMDM	Life Technologies	21980002-032	Fibroblast medium
FBS	Invitrogen	10270106	Fibroblast medium
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Antibiotic
Essential 8 media	ThermFisher Scientific	A1517001	iPS cell culture media
LN-521	Biolamina	LN521-03	iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X	ThermoFisher Scientific	12563011	Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit	Life Technologies	A1377801	Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish	Sarstedt	83.3900.300	Cell culture
60 mm tissue culture dishes	Sarstedt	83.3901.300	Cell culture
24 well tissue culture plates	Sarstedt	83.3922.300	Cell culture
T25 tissue culture flasks	VWR	734-2311	Cell culture
15 mL tubes	Corning	430791	Centrifuge tubes
1.5 mL tube	Eppendorf	0030123.301	1.5 mL tube
CoolCell cell LX	Biocision	BCS-405	Freezing container
DMSO	Sigma	D2650-100ml	Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 mL	VWR	479-6847	Cryovials
PSC Cryopreservation Kit	Gibco	A2644601	PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%)	ThermoFisherScientific	25300054	Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12	Life Technologies	31331-028	Digestive enzymes dilutant
DPBS	Life Technologies	14190-094	PBS
HBSS	ThermoFIsher Scientific	14025-050	Biopsy preparation
Haemocytometer	Sigma	BRAND, 718920	Cell counting
Parafilm	VWR	291-1213	Sealing plates for storage