Derivação livre de integração de células-tronco pluripotentes induzidas por seres humanos com Laminin 521 Matrix

Resumo

A derivação robusta das células do tronco pluripotente humano induzido (hiPS) foi conseguida utilizando a reprogramação mediada por vetores de vírus Sendai não-integrante (SeV) de fibroblastos dérmicos. A manutenção da célula hiPS e a expansão clonal foram realizadas usando condições de cultura sem xeno e quimicamente definidas com matriz de laminina humana recombinante 521 (LN-521) e meio Essential E8 (E8).

Resumo

As condições Xeno-free e totalmente definidas são parâmetros fundamentais para a geração robusta e reprodutível de células de vástago pluripotente induzido por humanos (hiPS) homogêneas. A manutenção das células HiPS em células alimentadoras ou matrizes indefinidas são susceptíveis a variantes do lote, contaminação patogênica e risco de imunogenicidade. A utilização da matriz de laminina humana recombinante definida 521 (LN-521) em combinação com formulações de meios sem xeno e definidas reduz a variabilidade e permite a geração consistente de células hiPS. O vetor de vírus Sendai (SeV) é um sistema não-integrante baseado em ARN, evitando assim preocupações associadas ao potencial efeito disruptivo sobre a integridade do genoma que os vetores de integração podem ter. Além disso, esses vetores demonstraram eficiência relativamente alta na reprogramação de fibroblastos dérmicos. Além disso, o envio enzimático de células únicas de células facilita a manutenção homogênea de células HiPS sem experiência substancial antes de troncoCultura. Aqui descrevemos um protocolo que foi amplamente testado e desenvolvido com foco na reprodutibilidade e facilidade de uso, proporcionando uma maneira robusta e prática de gerar células HiPS humanas definidas e sem xeno de fibroblastos.

Introdução

Desde a primeira derivação das linhas celulares hiPS por Takahashi et al. ^{1 , 2} , as células HiPS forneceram uma ferramenta útil para modelagem de doenças, descoberta de drogas e como material de origem para a geração de terapias celulares em medicina regenerativa ³ . A cultura de células hiPS tem sido dependente da co-cultura com células alimentadoras de fibroblastos ^{4 , 5} ou em Matrigel ⁶ e com formulações de mídia contendo soro bovino fetal (FBS). As variações de lote para lote são uma conseqüência comum da natureza indefinida dessas condições de cultura, resultando em variações imprevisíveis, o que é um dos principais contribuintes para a falta de confiabilidade desses protocolos ⁷ . O desenvolvimento de um meio definido como Essential 8 (E8) ⁸ e matrizes de cultura de células definidas, por exemplo, LN-521 ⁹ , permitemS para o estabelecimento de protocolos altamente reprodutíveis e ajuda na geração e manutenção robustas de células hips homogêneas ^{7 , 8 , 9 , 10} .

O desenvolvimento de técnicas de reprogramação livre de integração tem sido um salto em frente. Originalmente, a reprogramação dependia de vetores retrovirais que se integrassem aleatoriamente ao genoma com efeitos disruptivos sobre a integridade genômica ¹¹ . Os avanços nas metodologias de reprogramação incluem o desenvolvimento de vetores baseados em ARN. Os vetores de ARN têm uma vantagem sobre o método de reprogramação baseado em DNA, uma vez que a integração não intencional através da recombinação genômica não é possível ¹² . Os vetores SeV fornecem expressão elevada e transitória de fatores exógenos através de ARN de cadeia simples sem uma fase ^de DNA ¹¹ . Os vetores de reprogramação entregues pela SeVSão diluídos durante a expansão celular e, eventualmente, derramam da cultura, fornecendo um modo de reprogramação livre de pé-impressão. Posteriormente, a manutenção da pluripotência é dependente da expressão endógena dos genes de pluripotência ² .

À medida que as terapias baseadas em células HiPS pioneiras estão começando a se mover para ensaios clínicos, as demandas de lotes, reprodutibilidade e segurança padronizados são questões essenciais para abordar ¹³ . Portanto, os produtos de origem animal devem ser evitados. Por exemplo, o uso de produtos xenogênicos tem sido associado ao risco de contaminação por agentes não humanos. Além disso, as células cultivadas na presença de componentes de cultura derivados de animais demonstraram incorporar ácidos siliac não humanos em membranas celulares que ameaçam tornar as células derivadas imunogênicas ¹⁴ . Portanto, a necessidade de eliminar produtos xenogênicos é necessária para qualquer atividade clínica futura. Este protocolo aplica xeCultura sem livre e definida na manutenção das células móveis do hiPS que se deslocam para as células mais próximas do cumprimento clínico.

Este protocolo descreve um método consistente, altamente reprodutível e fácil de usar, que gera células HiPS padronizadas a partir de fibroblastos. Ele também oferece um sistema de cultura fácil de usar para a manutenção de células HiPS estabelecidas. Este protocolo foi usado para derivar mais de 300 linhas celulares de hiPS na instalação nacional sueca de iPS Core em Karolinska Institutet, das quais algumas linhas já foram descritas ^{15 , 16} .

Protocolo

A coleção de material do paciente e derivação de células HiPS é aprovada pelo Ethics Review Board, em Estocolmo, 28 de março de 2012, número de registro: 2012 / 208-31 / 3. As etapas de cultura de células devem ser realizadas em gabinetes de segurança de biossegurança, salvo indicação em contrário. Sempre pratique técnicas de manuseio estéril ao trabalhar com células. Permita que a mídia, placas e reagentes atinjam a temperatura ambiente antes de começar. Incubar células a 37 ° C, 5% de CO ₂ com alta umidade.

1. Isolamento de Fibroblastos Humanos por Biopsia Dermal

1. Preparações de meio de cultura, enzimas digestivas, revestimento de pratos e ferramentas de dissecação.
   1. Preparar meio de fibroblasto: 44,5 mL de meio de Dulbecco modificado da Iscove (IMDM), 5 mL de soro de bovino fetal (FBS) e 500 μL de penicilina / estreptomicina (PEST) (ver Tabela 1 ), armazenar a 4 ° C.
   2. Prepare enzimas digestivas a uma concentração de trabalho de 1 mg / mL: weiAlíquotas de gh de 4 mg de dispase e colagenase tipo I em tubos separados de 15 mL e dissolva-se em 4 mL de DMEM / F12 + 1% PEST. Esterilize a solução enzimática passando-a através de um filtro de 0,22 μm. Prepare sempre novas soluções de enzimas.
   3. Cubra um poço em uma placa de cultura de tecido de 6 poços (ou prato de cultura de tecidos de 35 mm) por biópsia dissecada com 1 mL de gelatina a 0,1% em solução salina tamponada com fosfato (DPBS). Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
   4. Autoclave um conjunto de tesouras cirúrgicas e fórceps por biópsia para dissecção.
2. Manuseio de biópsia
   NOTA: Processe as biópsias o mais rápido possível depois de serem tomadas. Armazenar em PBS + 1% PEST por até 48 h a 4 ° C. A biópsia deve ter entre 2 e 4 mm de diâmetro e de acordo com as licenças éticas.
   1. Transfira a biópsia para um prato de 35 mm. Mova a biópsia para um novo prato de 35 mm e submergir a biópsia em 2 mL de etanol a 70% durante 30 s.
   2. Mova a biópsia para um terceiroPrato de 35 mm e lavar com 1 mL de solução de sal equilibrada de Hank esterilizada (HBSS) suplementada com 1% de PEST.
   3. Transfira a biópsia para um quarto prato de 35 mm, adicione 1 mL de solução de dispase a 0,1% preparada recentemente.
   4. Corte a biópsia da pele em 1 a 2 mm ³ pedaços no prato usando tesouras cirúrgicas e fórceps e, em seguida, transfira peças de biópsia, incluindo a solução dispase em um tubo de 15 ml. Adicione mais 2 mL de dispase.
   5. Enxágüe o prato de 35 mm com uma solução de solução de 1 mL e transfira para o tubo de 15 mL.
   6. Incubar a biópsia a 4 ° C durante a noite.
   7. Adicionar 4 mL de 0,1% de colagenase I ao tubo e incubar a 37 ° C durante 4 h.
   8. Centrifugar as células digeridas 300 xg durante 3 min, aspirar o sobrenadante e ressuspender o resíduo em 2 mL de meio de fibroblasto.
   9. Remova a solução de gelatina da placa de cultura de tecido de 6 poços. Transfira a suspensão celular, incluindo as peças restantes para a placa de cultura de tecidos de 6 poços (ou 35 mM prato de cultura de tecidos) pré-revestido com 0,1% de gelatina em DPBS.
   10. Altere o meio a cada terceiro dia.
3. Expansão de fibroblastos humanos
   NOTA: Os fibroblastos estão prontos para serem passados ​​para um balão de cultura de tecidos T25 (25 cm ² ) quando confluido a 80% ( Figura 2B ). Os fibroblastos geralmente atingem 80% de confluência dentro de 7 dias. No entanto, o tempo necessário pode variar muito, mas não pode demorar mais do que 4 semanas.
   1. Aspirar o meio e lavar uma vez com 2,5 mL de DPBS.
   2. Remova o DPBS e adicione 1 mL de tripsina-EDTA (0,05%) e incube a 37 ° C durante 5 minutos ou até que as células exibam bordas arredondadas e comecem a se separar.
   3. Adicione 2 mL de meio de fibroblasto, se necessário, enxágue as células garantindo a desassociação adequada das células. Transfira a solução celular para um tubo de 15 ml e centrifugue a 300 xg durante 3 min.
   4. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular em 5 mL de meio de fibroblasto e fibroblastos de placa em umFrasco de T25 com cultura de tecido celular revestido. Ao expandir os fibroblastos após este passo, dissociar como descrito acima e semente 12 x 10 ³ células / cm2.
   5. Uma vez que as células confluentes estão prontas para congelar, expandir ou prender para a reprogramação. Congele duas rodadas de fibroblasto antes de iniciar qualquer reprogramação (consulte a próxima seção para o procedimento de congelamento). A eficiência de reprogramação é geralmente maior para os fibroblastos de passagem inferior, as células na passagem 2 a 4 são ótimas. No entanto, a reprogramação bem sucedida de fibroblastos até a passagem 10 foi conduzida usando este protocolo.
4. Congelamento e descongelamento de fibroblastos
   1. Prepare meio de congelação de fibroblasto fresco: 90% de FBS + 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Manter a 4 ° C ( Tabela 1 ). Uma vez confluente, o balão de cultura de tecidos T25 pode ser congelado em três crioviais. Prepare 500 μL de meio de congelação de fibroblastos por frasco congelado.
   2. Para congelar células, dissocie cElls como descrito na Etapa 1.3, contam células usando um hemocitómetro e transferem porções de 3 x 10 ⁵ células para tubos de 15 mL. Tubos de rotação a 300 xg durante 3 min. Aspirar o sobrenadante.
   3. Ressuspenda os grânulos celulares em 500 μL de meio de congelação de fibroblastos 4 ˚C e transfira para crioviais. Coloque os frascos em um recipiente congelante e incubar as células a -80 ° C durante 24 h antes de transferi-las para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
   4. Para descongelar as células, submergir a parte inferior do criovial a 37 ° C de água. Uma vez liquefeito, transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL e adicione 5 mL de meio de fibroblastos. Spin cells 300 xg durante 3 min.
   5. Remova o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular em 5 mL de meio de fibroblasto. Transferir células para um balão de cultura de tecidos T25 não revestido e incubar em 37 ° C.

2. Reprogramação vetorial SeV de fibroblastos

1. Preparação de alíquotas de vetores
   CUIDADO: Manele o SeV sob a contenção do nível 2 de biossegurança. Consulte o protocolo do fabricante e as diretrizes locais ¹⁷ . O título do vírus varia entre os lotes.
   1. Antes de preparar alíquotas, calcule a quantidade de vetor necessária para 5 x 10 ⁴ células de acordo com o protocolo do fabricante ( por exemplo , CytoTune 2.0). O título do vírus geralmente varia de 8 x 10 ⁷ - 1,5 x 10 ⁸ . Descongelar e combinar vetores 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 e hKlf4 = MOI 3). Porção da quantidade calculada para a reprogramação de 5 x 10 ⁴ células em tubos autoclavados de 1,5 mL. Diluir alíquotas de vírus com meio de fibroblasto para um volume final de 250 μL para reprogramação.
      NOTA: Cada frasco é válido para a reprogramação de um poço de uma placa de cultura de tecido de 24 poços com 5 x 10 ⁴ fibroblastos. Armazene as alíquotas de vírus a -80 ° C.
2. Sev Vector transduction
   1. Aspirar celularLure o meio e lave com 1 mL de DPBS. Aspirar DPBS e adicionar 1 mL de tripsina-EDTA (0,05%). Incubar a 37 ° C durante 5 min ou até as células serem separadas.
   2. Adicione 2 mL de meio de fibroblasto e ressuspenda as células e transfira para um tubo de 15 mL. Centrifugue 300 xg por 3 min.
   3. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 2 mL de meio de fibroblasto.
   4. Contagem de fibroblastos usando um hemocitómetro e semente 5 x 10 ⁴ células em um poço de uma placa de cultura de tecido de 24 poços. Incubar células a 37 ° C durante a noite.
   5. Aspirar meio de cultura de células, adicionar 250 μL da solução de SeV e incubar a 37 ° C durante a noite.
   6. Altere o meio diariamente para o meio de fibroblastos fresco. Permitir que as células transduzidas cresçam durante 7 dias antes de serem passadas para placas revestidas com LN-521. Prepare as placas LN-521 no dia anterior à passagem. Consulte 2.3.1 para o procedimento de revestimento.
3. Replação de fibroblastos transduzidos
   1. Preparação de LN-521 pratos revestidos: Diluir LN-521 em DPBS até uma concentração final de 0,63 μg / cm2. Pipetar 2 mL da solução LN-521 por prato de cultura de tecidos de 60 mm. Selar o prato de cultura de tecidos de 60 mm usando parafilme. Incubar durante a noite a 4 ° C.
   2. Prepare alíquotas de médio e médio nível (E8) para facilitar o manuseio: 48,5 mL de meio E8, 1 mL de suplemento E8 e 500 μL de PEST ( Tabela 1 ).
   3. 7 dias após a transdução, passar as células para um prato de cultura de tecidos 60 mm revestido com LN-521. Adicione 250 μL de tripsina-EDTA (0,05%) e incube a 37 ° C durante 5 min ou até as células se separarem. Adicionar 2 mL de meio de fibroblasto e células de centrifugação durante 3 min a 300 x g.
   4. Aspirar o sobrenadante. Resuspender o sedimento em 2 mL de meio fibroblástico e contar células em um hemocitômetro. Aspirar a solução LN-521 da placa pré-revestida e semear 4 x 10 ⁴ células em 5 ml de meio de fibroblasto no prato pré-revestido LN-521 de 60 mm. Adicionar inibidor de Rho-quinase Y-27632(ROCKi) até uma concentração final de 5 μM. Incubar a 37 ° C durante a noite.
   5. Importante, no dia seguinte, mude de médio para médio E8. Mude o E8 diariamente. As colônias de células hiPS emergirão dentro de 2 a 3 semanas.

3. Colheita de Colonias e Expansão de células HiPS

NOTA: As seguintes etapas são feitas fora do gabinete de biossegurança sob um microscópio estéreo. Recomenda-se o uso de máscaras de cabos e de procedimentos. Trabalhe cuidadosamente para não contaminar a cultura celular.

1. Prepare a cultura de tecidos revestida com LN-521 placas de 24 poços no dia anterior à colheita. Diluir LN-521 em DPBS 0,63 μg / cm2. Pipetar 250 μL da solução LN-521 em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Placas de vedação usando parafilme. Incubar durante a noite a 4 ° C.
   NOTA: as colônias estão prontas para serem colhidas quando atingem um tamanho> 1 mm de diâmetro. As colônias devem exibir bordas afiadas e crescer em um todo homogêneoOlayers ( Figura 2D ).
2. Aspirar a solução LN-521 e adicionar 500 μL de E8 em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços.
3. Corte as colônias em pedaços menores com um bisturi em uma grade como padrão sob um estereomicroscópio. Raspe mecanicamente as folhas das células do prato e transfira as folhas usando uma pipeta de 200 μL para o poço preparado ( Figura 2D -2E ). Escolha colônias em poços separados.
4. Permitir que as células se liguem sem alterar o meio durante 48 h. Posteriormente, altere E8 diariamente.
5. Quando as colônias atingiram um tamanho de> 5 mm, células de passagem enzimática como células únicas para um novo poço de uma placa revestida com LN-521.
6. Aspirar o meio de cultura celular das células e lavar com 250 μL de DPBS.
7. Aspirar DPBS. Adicionar 250 μL de reagente de dissociação e incubar durante 3 min a 37 ° C.
8. Observe que as células começaram a arredondar. DesanexarCélulas da placa por enxaguamento das células com reagente de dissociação algumas vezes.
9. Adicione 500 μL de meio E8 a um tubo de 15 mL. Transferir as células no reagente de dissociação para o tubo e centrifugar durante 3 min a 300 x g.
10. Aspirar a solução LN-521 do poço pré-revestido LN-521 e adicionar 500 μL de temperatura ambiente E8 médio.
11. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 500 μL de meio E8.
12. Contar as células usando um hemocitómetro e semear 2.5 x 10 ⁴ - 5 x 10 ⁴ células no poço pré-revestido LN-521 preparado (1,25 x 10 ⁴ - 2,5 x 10 ⁴ células / cm ² ). O formato da cultura celular pode ser facilmente aprimorado para se adequar ao propósito pretendido.
13. Adicione ROCKi a uma concentração final de 10 μM. Incubar células a 37 ° C.
14. Mude o E8 diariamente. As células geralmente estão prontas para a passagem após 4 a 6 dias. Enzimáticamente células de passagem como células únicas como descrito acima quando cerca de 90% confluentes.
    NOTA: Os vetores de reprogramação são progressivamente diluídos durante a expansão da célula hiPS e não são detectáveis ​​após a passagem 12. As células que são reprogramadas de forma imparcial geralmente deixam de proliferar em torno da passagem 6-10 ou perdem a sua característica morfologia de células estaminais pluripotentes ( Figura 3B ).
15. Congelamento e descongelamento de células HiPS
    1. Para congelar células, dissocie enzimáticamente as células como células únicas como descrito acima, contei células em um hemocitómetro e transfere 2,5 x 10 ⁵ células para um tubo de 15 mL contendo 1 mL de meio E8. Centrifugar a 300 xg por 3 min. Aspirar o sobrenadante.
    2. Resuspenda o sedimento celular em 250 μL de Cryomedium PSC a 4 ° C e transfira para um criovial. Coloque o frasco em um recipiente congelante e incubar as células a -80 ° C durante 24 h antes de transferi-las para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
    3. Para descongelar células, prepare um poço pré-revestido LN-521 de uma cultura de tecido de 24 poçosPlaca aspirando a solução LN-521 e adicionando 250 μL de meio E8. Submergir a parte inferior do criovial em 37 ° C de água até ficar um pequeno pingente de gelo.
    4. Adicione 250 μL de E8 Medium ao criovial e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL e adicione 1 mL de meio E8. Spin cells 300 xg durante 3 min.
    5. Remova o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular em 250 μL de temperatura ambiente E8 médio. Transfira a suspensão celular para o poço preparado e adicione um suplemento de viabilidade celular de 1% ou ROCKi a 10 μM. Incubar a placa de cultura de tecidos a 37 ° C.

Resultados

Da biópsia às células hiPS

Todo o processo, desde a biópsia até as células hiPS estabelecidas, sem vetor de reprogramação e pronto para caracterização, leva aproximadamente 16 semanas ( Figura 1 ). Uma linha de tempo mais detalhada é especificada na Figura 2A . Aproximadamente 4 semanas são necessárias para estabelecer e expandir as culturas de fibroblastos....

Discussão

O resultado esperado deste protocolo é a geração bem-sucedida de várias linhas de células hiPS derivadas de clonação. Importante, o método para a manutenção e expansão de células estabelecidas de hiPS aqui descritas é confiável e pode ser realizado com pouca experiência prévia de cultura de células-tronco. A migração de célula única enzimática com ROCKi juntamente com a matriz LN-521 é conhecida por manter as células como cariotípicamente normais, pluripotentes e prontamente capazes de se difere...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase	Life Technologies	171105-041	Biopsy digestion
Collagenase	Sigma	C0130	Biopsy digestion
Gelatin	Sigma	G1393	Fibroblast matrix
IMDM	Life Technologies	21980002-032	Fibroblast medium
FBS	Invitrogen	10270106	Fibroblast medium
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Antibiotic
Essential 8 media	ThermFisher Scientific	A1517001	iPS cell culture media
LN-521	Biolamina	LN521-03	iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X	ThermoFisher Scientific	12563011	Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit	Life Technologies	A1377801	Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish	Sarstedt	83.3900.300	Cell culture
60 mm tissue culture dishes	Sarstedt	83.3901.300	Cell culture
24 well tissue culture plates	Sarstedt	83.3922.300	Cell culture
T25 tissue culture flasks	VWR	734-2311	Cell culture
15 mL tubes	Corning	430791	Centrifuge tubes
1.5 mL tube	Eppendorf	0030123.301	1.5 mL tube
CoolCell cell LX	Biocision	BCS-405	Freezing container
DMSO	Sigma	D2650-100ml	Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 mL	VWR	479-6847	Cryovials
PSC Cryopreservation Kit	Gibco	A2644601	PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%)	ThermoFisherScientific	25300054	Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12	Life Technologies	31331-028	Digestive enzymes dilutant
DPBS	Life Technologies	14190-094	PBS
HBSS	ThermoFIsher Scientific	14025-050	Biopsy preparation
Haemocytometer	Sigma	BRAND, 718920	Cell counting
Parafilm	VWR	291-1213	Sealing plates for storage