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Resumen

derivación robusta de las células inducido por el hombre pluripotentes madre (HIPS) se logró mediante el uso de no-integración de virus Sendai (SeV) vector reprogramación mediada de fibroblastos dérmicos. el mantenimiento de células caderas y la expansión clonal se realizó utilizando condiciones de cultivo libre de xeno y definidos químicamente con laminina humana recombinante 521 (LN-521) de matriz y esencial E8 (E8) Medium.

Resumen

Las condiciones sin Xeno y completamente definidas son parámetros clave para la generación robusta y reproducible de células de vástago pluripotentes inducidas por humanos (HiPS) homogéneas. El mantenimiento de células hiPS en células alimentadoras o matrices indefinidas son susceptibles a variaciones en lotes, contaminación patógena y riesgo de inmunogenicidad. La utilización de la matriz de laminina 521 (LN-521) humana recombinante definida en combinación con formulaciones de medios sin xeno y definidas reduce la variabilidad y permite la generación consistente de células hiPS. El virus Sendai (SeV) vector es un no-integrar RNA-basado en el sistema, evitando así las preocupaciones asociadas con el potencial efecto disruptivo sobre la integridad del genoma integrar vectores pueden tener. Además, estos vectores han demostrado una eficacia relativamente alta en la reprogramación de fibroblastos dérmicos. Además, el paso enzimático de celdas individuales facilita el mantenimiento homogéneo de las células HiPS sin experiencia previaLl cultura. Aquí se describe un protocolo que ha sido ampliamente probado y desarrollado con un enfoque en la reproducibilidad y facilidad de uso, proporcionando una manera robusta y práctica para generar definido y xeno-libre humanos hiPS células de fibroblastos.

Introducción

Desde la primera derivación de las líneas de células HiPS por Takahashi et al. 1 , 2 , HiPS células han proporcionado una herramienta útil para la enfermedad de modelado, descubrimiento de fármacos y como material de origen para la generación de terapias celulares en la medicina regenerativa [ 3] . El cultivo de células hiPS ha dependido durante mucho tiempo del co-cultivo con células alimentadoras de fibroblastos 4 , 5 o en Matrigel 6 y con formulaciones de medios que contienen suero fetal bovino (FBS). Las variaciones de lote a lote son una consecuencia común de la naturaleza indefinida de estas condiciones de cultivo, lo que resulta en variaciones impredecibles, lo que es un contribuyente importante a la falta de fiabilidad de estos protocolos 7 . El desarrollo de un medio definido tal como Essential 8 (E8) 8 y matrices de cultivo celular definidas por ejemplo LN-521 9 , permitenS para el establecimiento de protocolos altamente reproducibles y ayuda en la robusta generación y mantenimiento de células hoPS homogéneas 7 , 8 , 9 , 10 .

El desarrollo de técnicas de reprogramación libres de integración ha sido un salto adelante. Originalmente, la reprogramación dependía de los vectores retrovirales que se integraron al azar en el genoma con efectos perjudiciales sobre la integridad genómica [ 11] . Los avances en las metodologías de reprogramación incluyen el desarrollo de vectores basados ​​en ARN. Los vectores de ARN tienen una ventaja sobre el método de reprogramación basado en el ADN como la integración no intencional a través de la recombinación genómica no es posible [ 12] . Los vectores SeV proporcionan una expresión alta y transitoria de factores exógenos a través de ARN monocatenario sin una fase de ADN 11 . Los vectores de reprogramación entregados por el SeVSe diluyen a lo largo de la expansión celular y eventualmente se desprenden del cultivo proporcionando una forma libre de reprogramación. Posteriormente, el mantenimiento de la pluripotencia depende de la expresión endógena de los genes de pluripotencia [ 2] .

Como las terapias pioneras basadas en células de HiPS están comenzando a entrar en ensayos clínicos, las demandas de lotes estandarizados, reproducibilidad y seguridad son cuestiones esenciales para abordar. Por lo tanto, deben evitarse los productos de origen animal. Por ejemplo, el uso de productos xenogénicos se ha asociado con el riesgo de contaminación no humana de patógenos. Además, se ha demostrado que las células cultivadas en presencia de componentes de cultivo derivados de animales incorporan ácidos siliacos no humanos en las membranas celulares, lo que amenaza con hacer que las células derivadas sean inmunogénicas 14 . Por lo tanto, la necesidad de eliminar los productos xenogénicos es necesaria para cualquier actividad clínica futura. Este protocolo se aplica xeNo-libre y definido en el mantenimiento de las células HiPS celdas móviles más cerca de cumplimiento clínico.

Este protocolo describe un método consistente, altamente reproducible y fácil de usar que genera células hiPS estandarizadas a partir de fibroblastos. También ofrece un sistema de cultivo de fácil manejo para el mantenimiento de las células hiPS establecidas. Este protocolo se ha utilizado para derivar más de 300 líneas celulares hiPS en la instalación nacional sueca de iPS core humano en el Instituto Karolinska, de la cual algunas líneas se han descrito previamente 15 , 16 .

Protocolo

La recopilación de material para pacientes y la derivación de las células del hiPS es aprobada por la Junta de Revisión de Ética, Estocolmo, 28 de marzo de 2012, Número de registro: 2012 / 208-31 / 3. Los pasos de cultivo celular deben realizarse en los gabinetes de seguridad de la biotecnología a menos que se indique lo contrario. Siempre practique técnicas de manejo estériles cuando trabaje con células. Deje que los medios, placas y reactivos alcancen la temperatura ambiente antes de comenzar. Incubar las células a 37 ° C, 5% de CO 2 en alta humedad.

1. Aislamiento de fibroblastos humanos por biopsia dérmica

  1. Preparaciones de medio de cultivo, enzimas digestivas, revestimiento de platos y herramientas de disección.
    1. Preparar el medio de Fibroblast: 44,5 ml de medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), 5 ml de suero bovino fetal (FBS) y 500 mu l de penicilina / estreptomicina (PEST) (ver Tabla 1 ), almacenar a 4ºC.
    2. Preparar enzimas digestivas a una concentración de trabajo de 1 mg / ml: weiGh de 4 mg de polvo de dispasa y colagenasa tipo I en tubos separados de 15 ml y se disuelven en 4 ml de DMEM / F12 + 1% PEST. Esterilizar la solución enzimática haciéndola pasar a través de un colador de 0,22 μm. Prepare soluciones de enzimas frescas cada vez.
    3. Recubrir un pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos (o plato de cultivo de tejidos de 35 mm) por biopsia diseccionada con 1 ml de gelatina al 0,1% en solución salina tamponada con fosfato (DPBS). Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
    4. Autoclave un conjunto de tijeras quirúrgicas y fórceps por biopsia para disección.
  2. Manejo de la biopsia
    NOTA: Trate las biopsias lo más rápido posible después de tomarlas. Almacenar en PBS + 1% PEST hasta 48 h a 4 ° C. La biopsia debe ser de 2 - 4 mm de diámetro en tamaño y de acuerdo con los permisos éticos.
    1. Transfiera la biopsia en un plato de 35 mm. Mueva la biopsia a un nuevo plato de 35 mm y sumerja la biopsia en 2 ml de etanol al 70% durante 30 s.
    2. Mueva la biopsia a una tercera35 mm y lavar con 1 ml de Solución de Sal Equilibrada Hank (HBSS) estéril suplementada con 1% de PEST.
    3. Transfiera la biopsia a un cuarto plato de 35 mm, añada 1 mL de solución de fracción 0,1% recién preparada.
    4. Cortar la biopsia de piel en 1 - 2 mm 3 piezas en el plato con tijeras quirúrgicas y fórceps y luego transferir piezas de biopsia, incluyendo la solución dispase en un tubo de 15 ml. Añadir 2 mL adicionales de dispase.
    5. Enjuague el plato de 35 mm con una solución dispasa de 1 ml y transfiera al tubo de 15 ml.
    6. Incubar la biopsia a 4 ° C durante la noche.
    7. Añadir 4 ml de colagenasa I al 0,1% al tubo e incubar a 37 ° C durante 4 h.
    8. Centrifugar las células digeridas 300 xg durante 3 min, aspirar el sobrenadante y resuspender la digestión en 2 ml de medio de fibroblastos.
    9. Retire la solución de gelatina de la placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Transferir la suspensión celular incluyendo cualquier resto de piezas a una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos (o 35 mM de cultivo de tejidos) previamente recubierto con 0,1% de gelatina en DPBS.
    10. Cambie de medio cada tercer día.
  3. Expansión de fibroblastos humanos
    NOTA: Los fibroblastos están listos para pasar a un matraz de cultivo tisular T25 (25 cm2) cuando están confluentes al 80% ( Figura 2B ). Los fibroblastos típicamente alcanzan el 80% de confluencia en 7 días. Sin embargo, el tiempo necesario puede variar mucho, pero no debe ser superior a 4 semanas.
    1. Aspirar el medio y lavar una vez con 2,5 ml de DPBS.
    2. Eliminar DPBS y añadir 1 ml de tripsina-EDTA (0,05%) e incubar a 37 ° C durante 5 minutos o hasta que las células muestran bordes redondeados y empezar a separar.
    3. Añadir 2 mL de medio de fibroblasto, si es necesario enjuagar las células asegurando una adecuada disociación de las células. Transferir la solución celular a un tubo de 15 ml y centrifugar a 300 xg durante 3 min.
    4. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 5 ml de medio de fibroblastos y fibroblastos de placa en unEn un vaso T25 de cultivo de tejidos de células revestidas. Cuando se expanden fibroblastos después de esta etapa, disociar como se ha descrito anteriormente y sembrar 12 x 10 3 células / cm2.
    5. Una vez que las células confluentes están listas para ser congeladas, expandir o planchar para reprogramar. Congelar dos rondas de fibroblastos antes de comenzar cualquier reprogramación (consulte la siguiente sección para el procedimiento de congelación). La eficacia de reprogramación es generalmente mayor para los fibroblastos de paso inferior, las células en el paso 2 - 4 son óptimas. Sin embargo, la reprogramación exitosa de fibroblastos hasta el paso 10 se ha llevado a cabo usando este protocolo.
  4. Congelación y descongelación de fibroblastos
    1. Preparar un medio fresco de congelación de fibroblastos: FBS al 90% + dimetilsulfóxido al 10% (DMSO). Mantener a 4 ° C ( Tabla 1 ). Una vez confluente, el matraz de cultivo tisular T25 se puede congelar en tres crioviales. Preparar 500 μl de medio de congelación de fibroblastos por vial congelado.
    2. Para congelar las células, disociar cComo se describe en el Paso 1.3, cuentan las células usando un hemocitómetro y las porciones de transferencia de 3 x 105 células a tubos de 15 ml. Girar los tubos a 300 xg durante 3 min. Aspirar sobrenadante.
    3. Resuspender los sedimentos celulares en 500 μl de medio de congelación de fibroblastos a 4 ˚C y transferirlos a crioviales. Colocar los viales en un recipiente de congelación e incubar las células a -80 ° C durante 24 horas antes de transferir a nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo.
    4. Para descongelar las células, sumerja la parte inferior del criovial en agua a 37 ° C. Una vez licuado, transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml y añada 5 ml de medio de fibroblasto. Células de centrifugación 300 xg durante 3 min.
    5. Se retira el sobrenadante y se resuspende el sedimento celular en 5 ml de medio fibroblástico. Transferir las células a un matraz de cultivo de tejido T25 no recubierto e incubar a 37 ° C.

2. SeV Vector Reprogramación de Fibroblastos

  1. Preparación de alícuotas de vectores
    PRECAUCIÓN: Maneje el SeV bajo la contención del nivel 2 de bioseguridad. Consulte el protocolo del fabricante y las directrices locales 17 . El título de virus varía entre lotes.
    1. Antes de preparar las alícuotas calcular la cantidad de vector necesario para 5 x 10 4 células de acuerdo con el protocolo del fabricante ( por ejemplo , CytoTune 2.0). El título del virus varía generalmente de 8 x 10 7 - 1,5 x 10 8 . Descongelar y combinar vectores 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 y hKlf4 = MOI 3). Porción la cantidad calculada para la reprogramación de 5 x 10 4 células en tubos de 1,5 ml esterilizados en autoclave. Diluir alícuotas de virus con medio de fibroblasto hasta un volumen final de 250 μl para reprogramar.
      NOTA: Cada vial es válido para la reprogramación de un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos con 5 x 104 fibroblastos. Almacenar alícuotas de virus a -80 ° C.
  2. Transducción vectorial SeV
    1. Célula de aspiraciónLture el medio y lave con 1 mL de DPBS. Aspirar DPBS y añadir 1 ml de tripsina-EDTA (0,05%). Incubar a 37 ° C durante 5 min o hasta que las células se separan.
    2. Añadir 2 ml de medio de fibroblasto y resuspender las células y transferir a un tubo de 15 ml. Centrifugar 300 xg durante 3 min.
    3. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 2 ml de medio de fibroblasto.
    4. Contar fibroblastos mediante el uso de un hemocitómetro y la semilla de 5 x 10 4 células en un pozo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Incubar las células a 37 ° C durante la noche.
    5. Aspirar el medio de cultivo celular, añadir 250 μL de la solución SeV e incubar a 37 ° C durante la noche.
    6. Cambiar el medio diario al medio fresco del fibroblast. Permitir que las células transducidas a crecer durante 7 días antes de pasar a LN-521 placas recubiertas. Preparar LN-521 placas el día antes del paso. Refiérase a 2.3.1 para el procedimiento de recubrimiento.
  3. Replantación de fibroblastos transducidos
    1. Preparación de LN -521 platos revestidos: Diluir LN-521 en DPBS hasta una concentración final de 0,63 μg / cm2. Pipetee 2 mL de la solución LN-521 por plato de cultivo de tejidos de 60 mm. Selle el plato de cultivo de tejidos de 60 mm usando parafilm. Incubar durante la noche a 4 ° C.
    2. Preparar 8 alícuotas de medio 8 (E8) básicas para facilitar el manejo: 48,5 ml de medio E8, 1 ml de suplemento de E8 y 500 μl de PEST ( Tabla 1 ).
    3. 7 días después de la transducción, pasar las células a un plato de cultivo de tejidos de 60 mm recubierto con LN-521. Añadir 250 μL de tripsina-EDTA (0,05%) e incubar a 37 ° C durante 5 minutos o hasta que las células se hayan desprendido. Añadir 2 ml de medio de fibroblasto y centrifugar las células durante 3 min a 300 x g.
    4. Aspirar el sobrenadante. Resuspender el sedimento en 2 ml de medio de fibroblastos y contar las células en un hemocitómetro. Aspirar la solución de LN-521 de la placa pre-recubierta y sembrar 4 x 10 4 células en 5 ml de medio de fibroblasto en el plato de 60 mm preenvasado LN-521. Añadir inhibidor de la Rho - quinasa Y - 27632(ROCKi) hasta una concentración final de 5 μM. Incubar a 37 ° C durante la noche.
    5. Importante, el día siguiente, cambie el medio al medio E8. Cambiar E8 medio diario. Las colonias de células hiPS surgirán dentro de 2 a 3 semanas.

3. Recogida de colonias y ampliación de células HiPS

NOTA: Los siguientes pasos se realizan fuera del gabinete de bioseguridad bajo un microscopio estéreo. Se recomienda el uso de malla y máscaras de procedimiento. Trabaje con cuidado para no contaminar el cultivo celular.

  1. Preparar placas de 24 pocillos de cultivo de tejidos recubiertos de LN-521 el día antes de recoger. Diluir LN-521 en DPBS 0,63 μg / cm2. Pipetea 250 μL de la solución de LN-521 en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Seal las placas usando parafilm. Incubar durante la noche a 4 ° C.
    NOTA: Las colonias están listas para ser recogidas cuando alcanzan un tamaño> 1 mm de diámetro. Las colonias deben mostrar bordes afilados y crecer en forma homogéneaOlayers ( Figura 2D ).
  2. Aspirar la solución LN-521 y añadir 500 μL de E8 en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos.
  3. Corte las colonias en pedazos más pequeños con un bisturí en una rejilla como el patrón debajo de un stereomicroscope. Raspar mecánicamente las láminas de células del plato y transferir las hojas usando una pipeta de 200 mu l al pocillo preparado ( Figura 2D - 2E ). Elija las colonias en pozos separados.
  4. Deje que las células se adhieran sin cambiar el medio durante 48 h. A partir de entonces, cambie el medio E8 diariamente.
  5. Cuando las colonias han alcanzado un tamaño de> 5 mm, enzimáticamente pasan células como células individuales a un pocillo nuevo de una placa revestida con LN-521.
  6. Aspirar el medio de cultivo celular de las células y lavar con 250 μL de DPBS.
  7. Aspirar DPBS. Añadir 250 μl de reactivo de disociación e incubar durante 3 minutos a 37 ° C.
  8. Observe que las células han comenzado a redondear. DespegarDe la placa mediante el enjuague de las células con reactivo de disociación unas cuantas veces.
  9. Añadir 500 μl de medio E8 a un tubo de 15 ml. Transferir las células en el reactivo de disociación al tubo y centrifugar durante 3 min a 300 x g.
  10. Aspirar la solución LN-521 del pocillo preenvasado LN-521 y añadir 500 μl de medio E8 a temperatura ambiente.
  11. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 500 μl de medio E8.
  12. Contar las células usando un hemocitómetro y sembrar 2,5 x 10 4 - 5 x 10 4 células en el pocillo preparado previamente LN-521 (1,25 x 10 4 - 2,5 x 10 4 células / cm 2 ). El formato de cultivo celular puede ser ampliado fácilmente para satisfacer el propósito deseado.
  13. Añadir ROCKi a una concentración final de 10 mu M. Incubar las células a 37 ° C.
  14. Cambiar E8 medio diario. Las células suelen estar listas para el paso después de 4 a 6 días. Las células de paso enzimáticamente como células individuales como se describió anteriormente cuando aproximadamente el 90% de confluencia.
    NOTA: Los vectores de reprogramación se diluyen progresivamente durante la expansión de las células de hiPS y no son detectables después del paso 12. Las células que se reprograman imparcialmente dejan de proliferar alrededor del paso 6-10 o pierden su morfología de células madre pluripotentes características ( Figura 3B ).
  15. Congelación y descongelación de células HiPS
    1. Para congelar células, disociar enzimáticamente las células como células individuales como se ha descrito anteriormente, contar las células en un hemocitómetro y transferir 2,5 x 105 células a un tubo de 15 ml que contiene 1 ml de medio E8. Centrifugar a 300 xg durante 3 min. Aspirar el sobrenadante.
    2. Resuspender el sedimento de células en 250 μL de cryomedium de PSC de 4 ° C y transferir a un criovial. Colocar el vial en un recipiente de congelación e incubar las células a -80 ° C durante 24 h antes de transferir a nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo.
    3. Para descongelar las células, preparar un pocillo LN-521 pre-recubierto de un cultivo de tejidos de 24 pocillosMediante la aspiración de la solución LN-521 y la adición de 250 μl de medio E8. Sumergir la parte inferior de la criovial en agua a 37 ° C hasta que sólo queda un pequeño carámbano.
    4. Añadir 250 μL de medio E8 al criovial y transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml y agregar 1 ml de medio E8. Células de centrifugación 300 xg durante 3 min.
    5. Se retira el sobrenadante y se resuspende el sedimento celular en 250 μl de medio E8 de temperatura ambiente. Transferir la suspensión de células al pocillo preparado y añadir 1% de suplemento de viabilidad celular o 10 μM de ROCKi. Incubar la placa de cultivo de tejidos a 37 ° C.

Resultados

De la biopsia a las células HiPS

Todo el proceso desde la biopsia hasta las células hiPS establecidas, desprotegido del vector de reprogramación y listo para su caracterización, toma aproximadamente 16 semanas ( Figura 1 ). En la Figura 2A se especifica un cronograma más detallado. Se necesitan aproximadamente 4 semanas para establecer y expandir los cultivos de fib...

Discusión

El resultado esperado de este protocolo es la generación exitosa de varias líneas celulares de hiPS derivadas clonalmente. Es importante destacar que el método para el mantenimiento y la expansión de las células hiPS establecidas aquí descritas es fiable y puede realizarse con poca experiencia previa de cultivo de células madre. Se sabe que el paso de células únicas enzimáticas con ROCKi junto con la matriz LN-521 mantiene las células como cariotipicamente normales, pluripotentes y fácilmente capaces de dife...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que reportar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por los agentes de financiación SSF (B13-0074) y VINNOVA (2016-04134).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
DispaseLife Technologies171105-041Biopsy digestion
CollagenaseSigmaC0130Biopsy digestion
GelatinSigmaG1393Fibroblast matrix
IMDMLife Technologies21980002-032Fibroblast medium
FBSInvitrogen10270106Fibroblast medium
Penicillin/StreptomycinLife Technologies15070-063Antibiotic
Essential 8 mediaThermFisher ScientificA1517001iPS cell culture media
LN-521BiolaminaLN521-03iPS cell culture matrix
TrypLE select 1XThermoFisher Scientific12563011Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632MilliporeSCM075Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kitLife TechnologiesA1377801Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dishSarstedt83.3900.300Cell culture
60 mm tissue culture dishesSarstedt83.3901.300Cell culture
24 well tissue culture platesSarstedt83.3922.300Cell culture
T25 tissue culture flasksVWR734-2311Cell culture
15 mL tubesCorning430791Centrifuge tubes
1.5 mL tubeEppendorf0030123.3011.5 mL tube
CoolCell cell LXBiocisionBCS-405Freezing container
DMSOSigmaD2650-100mlFibroblast freezing
Cryovials 1.8 mLVWR479-6847Cryovials
PSC Cryopreservation KitGibcoA2644601PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%)ThermoFisherScientific25300054Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12Life Technologies31331-028Digestive enzymes dilutant
DPBSLife Technologies14190-094PBS
HBSSThermoFIsher Scientific14025-050Biopsy preparation
HaemocytometerSigmaBRAND, 718920Cell counting
ParafilmVWR291-1213Sealing plates for storage

Referencias

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