Integration Freie Ableitung von human induzierten pluripotenten Stammzellen mit Laminin 521 Matrix

Zusammenfassung

Die robuste Ableitung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS) wurde durch die Verwendung von nicht-integrierenden Sendai-Virus (SeV) -vektorvermittelten Umprogrammierung von dermalen Fibroblasten erreicht. HiPS-Zell-Aufrechterhaltung und Klon-Expansion wurde unter Verwendung von xeno-freien und chemisch definierten Kulturbedingungen mit rekombinantem humanem Laminin 521 (LN-521) -Matrix und Essential E8 (E8) Medium durchgeführt.

Zusammenfassung

Xeno-freie und vollständig definierte Bedingungen sind Schlüsselparameter für eine robuste und reproduzierbare Erzeugung von homogenen human induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS). Die Aufrechterhaltung von hiPS-Zellen auf Feeder-Zellen oder undefinierten Matrizen ist anfällig für Charge-Varianzen, pathogene Kontamination und Immunogenitätsgefahr. Die Verwendung der definierten rekombinanten humanen Laminin 521 (LN-521) -Matrix in Kombination mit xenofreien und definierten Medienformulierungen reduziert die Variabilität und ermöglicht die gleichmäßige Erzeugung von hiPS-Zellen. Der Sendai-Virus (SeV) -Vektor ist ein nicht-integrierendes RNA-basiertes System, wodurch Umstände vermieden werden, die mit dem potentiellen störenden Effekt auf die Integrationsvektoren der Genomintegrität verbunden sind. Darüber hinaus haben diese Vektoren eine relativ hohe Effizienz bei der Umprogrammierung von dermalen Fibroblasten gezeigt. Darüber hinaus ermöglicht die enzymatische Einzelzell-Passage von Zellen eine homogene Aufrechterhaltung von hiPS-Zellen ohne wesentliche Vorkenntnisse von StammzellenKultur. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das umfangreich getestet und mit einem Fokus auf Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit entwickelt wurde, was eine robuste und praktische Möglichkeit zur Erzeugung definierter und xenofreier menschlicher HiPS-Zellen aus Fibroblasten bietet.

Einleitung

Da die erste Ableitung von hiPS-Zelllinien von Takahashi et al. ^{1 , 2} , hiPS-Zellen haben ein nützliches Werkzeug für die Krankheitsmodellierung, die Wirkstoffforschung und als Ausgangsmaterial für die Erzeugung von Zelltherapien in der regenerativen Medizin bereitgestellt ³ . Die hiPS-Zellkultur ist seit langem auf Co-Kultur mit Fibroblasten-Feeder-Zellen ^{4 , 5} oder auf Matrigel ⁶ und mit Medienformulierungen, die fötales Rinderserum (FBS) enthalten, abhängig. Batch-to-Batch-Varianzen sind eine häufige Konsequenz der undefinierten Natur dieser Kulturbedingungen, was zu unvorhersehbaren Variationen führt, was einen wesentlichen Beitrag zur Unzuverlässigkeit dieser Protokolle gibt ⁷ Die Entwicklung eines definierten Mediums wie zB essentielle 8 (E8) ⁸ und definierte Zellkulturmatrizen zum Beispiel LN-521 ⁹ erlauben esS für die Etablierung hochreproduzierbarer Protokolle und Unterstützung bei der robusten Erzeugung und Pflege von homogenen HiFi Zellen ^{7 , 8 , 9 , 10} .

Entwicklung von integrationsfreien Umprogrammierungstechniken war ein Sprung nach vorne. Ursprünglich hing die Neuprogrammierung von retroviralen Vektoren ab, die zufällig in das Genom integriert wurden, mit störenden Auswirkungen auf die genomische Integrität ¹¹ . Fortschritte bei der Reprogrammierung von Methoden umfassen die Entwicklung von RNA-basierten Vektoren. RNA-Vektoren haben einen Vorteil gegenüber der DNA-basierten Reprogrammierungsmethode, da eine unbeabsichtigte Integration durch genomische Rekombination nicht möglich ist ¹² . SeV-Vektoren liefern eine hohe und transiente Expression exogener Faktoren durch einzelsträngige RNA ohne DNA-Phase ¹¹ . Die von der SeV gelieferten UmprogrammierungsvektorenSind in der Zellexpansion verdünnt und scheiden schließlich aus der Kultur, die einen fußabdruckfreien Weg zur Umprogrammierung bietet. Danach ist die Aufrechterhaltung der Pluripotenz abhängig von der endogenen Expression der Pluripotenzgene ² .

Als bahnbrechende hiPS-zellbasierte Therapien beginnen sich in klinische Studien zu bewegen, die Anforderungen an standardisierte Chargen, Reproduzierbarkeit und Sicherheit sind wesentliche Fragen, um ¹³ zu adressieren. Daher sollten Produkte tierischen Ursprungs vermieden werden. Zum Beispiel ist die Verwendung von xenogenen Produkten mit dem Risiko einer nichtmenschlichen Pathogenkontamination verbunden. Auch Zellen, die in Gegenwart von tierischen Kulturkomponenten kultiviert wurden, haben gezeigt, dass sie nichtmenschliche Silicasäuren in Zellmembranen einfließen, die drohende, abgeleitete Zellen immunogen zu machen ¹⁴ . Daher ist die Notwendigkeit, xenogene Produkte zu eliminieren, notwendig für zukünftige klinische Aktivitäten. Dieses Protokoll gilt für xeNicht-freie und definierte Kultur in der Aufrechterhaltung von hiPS-Zellen, die Zellen näher an klinische Compliance bewegen.

Dieses Protokoll beschreibt eine konsistente, hoch reproduzierbare und einfach zu bedienende Methode, die standardisierte HiPS-Zellen aus Fibroblasten erzeugt. Es bietet auch ein benutzerfreundliches Kultursystem für die Wartung von etablierten Hallo-Zellen. Dieses Protokoll wurde verwendet, um mehr als 300 hiPS Zelllinien in der schwedischen nationalen menschlichen iPS Core-Anlage am Karolinska Institutet abzuleiten, von denen einige Zeilen zuvor beschrieben wurden ^{15 , 16} .

Protokoll

Die Sammlung von Patientengaterial und Ableitung von hiPS-Zellen wird vom Ethics Review Board, Stockholm, 28. März 2012, Registrierungsnummer: 2012 / 208-31 / 3 genehmigt. Zellkulturschritte sollten in Biosicherheitsschränken durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben. Bei der Arbeit mit Zellen immer sterile Handhabungstechniken durchführen. Medien, Platten und Reagenzien vor dem Start auf Raumtemperatur bringen lassen. Inkubieren von Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ bei hoher Feuchtigkeit.

1. Isolierung von menschlichen Fibroblasten aus der Dermalbiopsie

1. Zubereitungen von Kulturmedium, Verdauungsenzyme, Beschichten von Geschirr und Sezierwerkzeugen.
   1. Bereiten Sie das Fibroblastenmedium vor: 44,5 ml Iscoves modifiziertes Dulbecco-Medium (IMDM), 5 ml Fetales Rinderserum (FBS) und 500 μl Penicillin / Streptomycin (PEST) (siehe Tabelle 1 ), bei 4 ° C aufbewahren.
   2. Bereiten Sie Verdauungsenzyme bei einer Arbeitskonzentration von 1 mg / ml vor: weiGh Aliquots von 4 mg Dispase und Kollagenase Typ I Pulver in separaten 15-ml-Röhrchen und lösen sich in 4 ml DMEM / F12 + 1% PEST. Sterilisieren der enzymatischen Lösung durch Durchleiten durch ein 0,22 μm Sieb. Bereiten Sie frische Enzymlösungen jedes Mal vor.
   3. In einer 6-Well-Gewebekulturplatte (oder einer 35-mm-Gewebekulturschale) pro Biopsie, die mit 1 ml 0,1% iger Gelatine in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) seziert wurde, Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min.
   4. Autoklav ein Satz chirurgische Schere und Pinzette pro Biopsie für die Sektion.
2. Biopsiebehandlung
   HINWEIS: Prozess Biopsien so schnell wie möglich nach der Aufnahme. In PBS + 1% PEST für bis zu 48 h bei 4 ° C aufbewahren. Biopsie sollte 2 - 4 mm im Durchmesser in Größe und in Übereinstimmung mit ethischen Genehmigungen.
   1. Übertragen Sie die Biopsie in eine 35-mm-Schale. Die Biopsie auf eine neue 35-mm-Schale geben und die Biopsie in 2 ml 70% igem Ethanol für 30 s eintauchen.
   2. Die Biopsie auf ein Drittel bringen35-mm-Schale und waschen mit 1 ml steriler Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), ergänzt mit 1% PEST.
   3. Übertragen Sie die Biopsie auf eine vierte 35-mm-Schale, fügen Sie 1 ml frisch zubereitete 0,1% Disposelösung hinzu.
   4. Schneiden Sie die Hautbiopsie in 1 - 2 mm ³ Stücke in der Schale mit chirurgischen Scheren und Pinzette und übertragen Sie dann Biopsie Stücke einschließlich der Dispase-Lösung in ein 15-ml-Rohr. Füge weitere 2 mL Disposition hinzu.
   5. Spülen Sie die 35-mm-Schale mit einer 1 mL Disposelösung und überführen Sie sie auf das 15-ml-Röhrchen.
   6. Inkubieren Sie die Biopsie bei 4 ° C über Nacht.
   7. 4 ml 0,1% Collagenase I zu dem Röhrchen geben und bei 37 ° C für 4 h inkubieren.
   8. Die verdauten Zellen 300 xg für 3 min zentrifugieren, den Überstand absaugen und den Digest in 2 ml Fibroblastenmedium resuspendieren.
   9. Entfernen Sie die Gelatinelösung aus der 6-Well-Gewebekulturplatte. Übertragen Sie die Zellsuspension einschließlich aller verbleibenden Stücke auf 6-Well-Gewebekulturplatte (oder 35-mM Gewebekulturschale), die mit 0,1% Gelatine in DPBS vorbeschichtet wurde
   10. Ändere das Medium jeden dritten Tag.
3. Erweiterung der menschlichen Fibroblasten
   HINWEIS: Fibroblasten sind bereit, an einen T25 (25 cm ² ) Gewebekulturkolben passiert zu werden, wenn 80% konfluent sind ( Abbildung 2B ). Fibroblasten erreichen in der Regel 80% Konfluenz innerhalb von 7 Tagen. Allerdings kann die Zeitaufwand stark variieren, sollte aber nicht länger als 4 Wochen sein.
   1. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie es einmal mit 2,5 ml DPBS.
   2. Entfernen Sie DPBS und fügen Sie 1 ml Trypsin-EDTA (0,05%) hinzu und inkubieren Sie bei 37 ° C für 5 min oder bis die Zellen abgerundete Kanten zeigen und beginnen, sich zu lösen.
   3. Füge 2 ml Fibroblasten-Medium hinzu, ggf. spülen die Zellen, um eine ordnungsgemäße Zerlegung von Zellen zu gewährleisten. Übertragen Sie die Zelllösung auf ein 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 300 xg für 3 min.
   4. Den Überstand verwerfen und das Zellpellet in 5 ml Fibroblastenmedium und Plattenfibroblasten in einem resuspendierenAuf-beschichtete Zellgewebekultur T25-Kolben. Beim Aufweiten von Fibroblasten nach diesem Schritt dissoziieren wie oben beschrieben und Saatgut 12 x 10 ³ Zellen / cm ² .
   5. Sobald konfluierende Zellen bereit sind, eingefroren zu werden, erweitern oder platten für die Umprogrammierung. Gefrieren Sie zwei Runden Fibroblasten, bevor eine Neuprogrammierung gestartet wird (siehe nächster Abschnitt zum Einfrieren). Die Umprogrammierungseffizienz ist bei niedrigeren Durchgangsfibroblasten im Allgemeinen höher, die Zellen am Durchgang 2 - 4 sind optimal. Jedoch wurde eine erfolgreiche Neuprogrammierung von Fibroblasten bis zum Durchgang 10 unter Verwendung dieses Protokolls durchgeführt.
4. Einfrieren und Auftauen von Fibroblasten
   1. Frohes Fibroblasten-Gefriermedium vorbereiten: 90% FBS + 10% Dimethylsulfoxid (DMSO). Bei 4 ° C aufbewahren ( Tabelle 1 ). Einmal konfluent, kann der T25 Gewebekulturkolben in drei Kryovials eingefroren werden. 500 μl Fibroblasten-Gefriermedium pro Vial gefroren
   2. Um Zellen zu frieren, dissoziiere cElls, wie in Schritt 1.3 beschrieben, Zählzellen unter Verwendung eines Hämocytometers und Transferabschnitte von 3 x 10 & sup5; Zellen zu 15-ml-Röhrchen. Spinnröhrchen bei 300 xg für 3 min. Absaugen des Überstandes
   3. Restenz von Zellpellets in 500 & mgr; l 4 & mgr; C Fibroblasten-Gefriermedium und Transfer in Kryovials. Legen Sie die Fläschchen in einen Gefrierbehälter und inkubieren Sie die Zellen bei -80 ° C für 24 Stunden, bevor Sie sie auf flüssigen Stickstoff zur Langzeitlagerung übertragen.
   4. Um die Zellen aufzutauen, tauchen Sie den unteren Teil des Kryovials in 37 ° C Wasser ein. Nach der Verflüssigung die Zellsuspension auf ein 15-ml-Röhrchen überführen und 5 ml Fibroblasten-Medium zugeben. Spin-Zellen 300 xg für 3 min.
   5. Den Überstand entfernen und das Zellpellet in 5 ml Fibroblastenmedium resuspendieren. Die Zellen in einen nicht beschichteten T25-Gewebekulturkolben überführen und in 37 ° C inkubieren.

2. SeV-Vektor-Umprogrammierung von Fibroblasten

1. Vorbereitung von Vektoraliquots ACHTUNG: Handhabung des SeV unter Biosicherheitsstufe 2. Siehe Protokoll des Herstellers und lokale Richtlinien ¹⁷ . Der Virustiter variiert zwischen den Chargen.
   1. Vor der Vorbereitung von Aliquoten berechnen Sie die für 5 x 10 ⁴ Zellen benötigte Vektormenge nach dem Protokoll des Herstellers ( zB CytoTune 2.0). Der Virustiter variiert im Allgemeinen von 8 x 10 ⁷ - 1,5 x 10 ⁸ . Tauen und kombinieren Vektoren 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 und hKlf4 = MOI 3). Portion die für die Umprogrammierung von 5 x 10 ⁴ Zellen berechnete Menge in autoklavierte 1,5 mL Röhrchen. Verdünnen Sie Virusaliquots mit Fibroblasten-Medium bis zu einem Endvolumen von 250 μl für die Umprogrammierung.
      HINWEIS: Jede Durchstechflasche gilt für die Umprogrammierung einer Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte mit 5 x 10 ⁴ Fibroblasten. Bewahren Sie Virusaliquots bei -80 ° C auf.
2. SeV-Vektor-Transduktion
   1. Aspirate Zelle cuLture medium und waschen mit 1 mL DPBS. Aspiration von DPBS und Zugabe von 1 ml Trypsin-EDTA (0,05%). Inkubieren bei 37 ° C für 5 min oder bis die Zellen abgelöst sind.
   2. 2 ml Fibroblasten-Medium zugeben und die Zellen resuspendieren und in ein 15-ml-Röhrchen überführen. Zentrifuge 300 xg für 3 min.
   3. Den Überstand absaugen und das Pellet in 2 ml Fibroblastenmedium resuspendieren.
   4. Zählen Sie Fibroblasten unter Verwendung eines Hämocytometers und Samen 5 x 10 ⁴ Zellen in einer Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Inkubieren von Zellen bei 37 ° C über Nacht.
   5. Das Zellkulturmedium einatmen, 250 μl der SeV-Lösung zugeben und bei 37 ° C über Nacht inkubieren.
   6. Wechsel täglich täglich zum frischen Fibroblasten-Medium. Lassen Sie transduzierte Zellen 7 Tage lang wachsen, bevor Sie mit LN-521 beschichteten Platten passagiert werden. Bereiten Sie LN-521 Platten am Tag vor Passage vor. Siehe 2.3.1 für Beschichtungsverfahren.
3. Umwandlung von transduzierten Fibroblasten
   1. Herstellung von LN-521 beschichtete Schalen: LN-521 in DPBS bis zu einer Endkonzentration von 0,63 μg / cm ² verdünnen. 2 ml der LN-521-Lösung pro 60-mm-Gewebekulturschale pipettieren. Die 60-mm-Gewebekulturschale mit Parafilm versiegeln. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C.
   2. Bereiten Sie essentielle 8 Medium (E8) Aliquots für eine leichtere Handhabung vor: 48,5 ml E8-Medium, 1 ml E8-Supplement und 500 μl PEST ( Tabelle 1 ).
   3. 7 Tage nach der Transduktion die Zellen zu einer LN-521 beschichteten 60 mm Gewebekulturschale überführen. Füge 250 μl Trypsin-EDTA (0,05%) hinzu und inkubiere bei 37 ° C für 5 min oder bis die Zellen abgelöst sind. 2 ml Fibroblasten-Medium zugeben und 3 min bei 300 x g zentrifugieren.
   4. Sauge den Überstand. Pellet in 2 ml Fibroblastenmedium resuspendieren und Zellen in einem Hämocytometer zählen. LN-521-Lösung aus der vorbeschichteten Platte und Saatgut 4 x 10 ⁴ Zellen in 5 ml Fibroblasten-Medium in die LN-521 vorbeschichtete 60 mm Schale geben. Füge den Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 hinzu(ROCKi) bis zu einer Endkonzentration von 5 μM. Inkubieren in 37 ° C über Nacht.
   5. Wichtig, am nächsten Tag, wechsle das Medium zum E8-Medium. E8 mittel täglich wechseln HiPS Zellkolonien entstehen innerhalb von 2 - 3 Wochen.

3. Kommissionierung von Kolonien und Erweiterung von hiPS Zellen

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden außerhalb des Biosicherheitskabinetts unter einem Stereomikroskop durchgeführt. Die Verwendung von Haarnetz- und Verfahrensmasken wird empfohlen. Arbeiten Sie sorgfältig nicht, um die Zellkultur zu kontaminieren.

1. Bereiten Sie LN-521 beschichtete Gewebekultur 24-Well-Platten am Tag vor der Kommissionierung vor. Verdünnen Sie LN-521 in DPBS 0,63 μg / cm ² . Pipettieren Sie 250 μl der LN-521-Lösung in eine Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Dichtungsplatten mit Parafilm. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C.
   ANMERKUNG: Kolonien sind bereit, abgeholt zu werden, wenn sie eine Größe> 1 mm im Durchmesser erreichen. Kolonien sollten scharfe Kanten und wachsen in homogenen MonOlayers ( Abbildung 2D ).
2. Ansaugen der LN-521-Lösung und Zugabe von 500 μl E8 in eine Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte.
3. Schneiden Sie Kolonien in kleinere Stücke mit einem Skalpell in einem Raster wie Muster unter einem Stereomikroskop. Mechanische Kratzen der Zellfolien aus der Schale und Übertragen der Blätter unter Verwendung einer 200 & mgr ; l Pipette auf die vorbereitete Vertiefung ( 2D- 2E ). Wähle Kolonien in getrennte Brunnen.
4. Erlaube Zellen, ohne das Medium für 48 h zu wechseln. Danach wechseln Sie täglich E8.
5. Wenn die Kolonien eine Größe von> 5 mm erreicht haben, enzymatisch Durchgangszellen als einzelne Zellen zu einer neuen Vertiefung einer LN-521 beschichteten Platte.
6. Das Zellkulturmedium aus den Zellen absaugen und mit 250 μl DPBS waschen.
7. Aspirieren Sie DPBS. Füge 250 μl Dissoziationsreagenz hinzu und inkubiere für 3 min bei 37 ° C.
8. Beachten Sie, dass die Zellen begonnen haben, sich zu runden. AblösenZellen aus der Platte durch Spülen der Zellen mit Dissoziationsreagenz ein paar Mal.
9. Füge 500 μl E8-Medium zu einem 15-ml-Röhrchen hinzu. Die Zellen in das Dissoziationsreagenz in das Röhrchen überführen und 3 min bei 300 x g zentrifugieren.
10. Die LN-521-Lösung aus der LN-521-Vorbeschichtung aufnehmen und 500 μl Raumtemperatur-E8-Medium hinzufügen.
11. Den Überstand absaugen und das Zellpellet in 500 μl E8-Medium resuspendieren.
12. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämocytometer und Samen 2,5 x 10 ⁴ - 5 x 10 ⁴ Zellen in der vorbereiteten LN-521 vorbeschichteten Vertiefung (1,25 x 10 ⁴ - 2,5 x 10 ⁴ Zellen / cm ² ). Das Zellkulturformat lässt sich problemlos auf den vorgesehenen Zweck skalieren.
13. Füge ROCKi zu einer Endkonzentration von 10 μM hinzu. Inkubieren von Zellen bei 37 ° C.
14. E8 mittel täglich wechseln Die Zellen sind in der Regel nach 4 - 6 Tagen fertig. Enzymatische Passagen von Zellen als einzelne Zellen, wie oben beschrieben, wenn etwa 90% konfluent.
    ANMERKUNG: Die Umprogrammierungsvektoren werden während der Hochwasserschutzerweiterung fortschreitend verdünnt und nach dem Durchgang nicht nachweisbar. Zellen, die unparteiisch neu programmiert werden, treten häufig nicht auf, um die Passage 6 - 10 zu vermehren oder ihre charakteristische pluripotenten Stammzellmorphologie zu verlieren ( Abbildung 3B ).
15. Einfrieren und Auftauen von Hifi-Zellen
    1. Um Zellen zu frieren, enzymatisch Zellen als einzelne Zellen wie oben beschrieben dissoziieren, Zellen in einem Hämocytometer zählen und 2,5 x 10 & sup5; Zellen in ein 15-ml-Röhrchen geben, das 1 ml E8-Medium enthält. Zentrifuge bei 300 xg für 3 min. Sauge den Überstand.
    2. Restenz von Zellpellets in 250 μl 4 ° C PSC Kryomedium und Transfer zu einem Kryovial. Legen Sie die Durchstechflasche in einen Gefrierbehälter und inkubieren Sie die Zellen bei -80 ° C für 24 Stunden, bevor Sie sie auf flüssigen Stickstoff zur Langzeitlagerung übertragen.
    3. Um die Zellen aufzutauen, wird eine vorbeschichtete LN-521-Vertiefung einer 24-Well-Gewebekultur hergestelltPlatte durch Ansaugen der LN-521-Lösung und Zugabe von 250 & mgr; l E8-Medium. Tauchen Sie den unteren Teil des Kryovials in 37 ° C Wasser, bis nur ein kleiner Eiszapfen bleibt.
    4. Füge 250 μl E8-Medium in die Kryoviale ein und transferiere die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen und füge 1 ml E8-Medium zu. Spin-Zellen 300 xg für 3 min.
    5. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 250 μl Raumtemperatur E8 Medium. Übertragen Sie die Zellsuspension auf die vorbereitete Vertiefung und fügen Sie 1% Zelllebensfähigkeitsergänzung oder 10 μM ROCKi hinzu. Inkubieren Sie die Gewebekulturplatte bei 37 ° C.

Ergebnisse

Von der Biopsie zu den hiPS Zellen

Der gesamte Prozess von der Biopsie bis zu etablierten Hallo-Zellen, frei von Umprogrammierungsvektor und bereit zur Charakterisierung, dauert etwa 16 Wochen ( Abbildung 1 ). Eine detailliertere Zeitleiste ist in Abbildung 2A angegeben . Etwa 4 Wochen sind erforderlich, um Fibroblasten-Kulturen zu etablieren und zu erweitern. Die ersten...

Diskussion

Das erwartete Ergebnis dieses Protokolls ist die erfolgreiche Erzeugung von mehreren klonal abgeleiteten hiPS-Zelllinien. Wichtig ist, dass die hier beschriebene Methode zur Aufrechterhaltung und Erweiterung der etablierten hiPS-Zellen zuverlässig ist und mit wenig vorheriger Erfahrung der Stammzellkultur durchgeführt werden kann. Die enzymatische Einzelzell-Passage mit ROCKi zusammen mit der LN-521-Matrix ist bekannt, um Zellen als karyotypisch normal zu halten, pluripotent und leicht in der Lage zu differenzieren, w...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase	Life Technologies	171105-041	Biopsy digestion
Collagenase	Sigma	C0130	Biopsy digestion
Gelatin	Sigma	G1393	Fibroblast matrix
IMDM	Life Technologies	21980002-032	Fibroblast medium
FBS	Invitrogen	10270106	Fibroblast medium
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Antibiotic
Essential 8 media	ThermFisher Scientific	A1517001	iPS cell culture media
LN-521	Biolamina	LN521-03	iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X	ThermoFisher Scientific	12563011	Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit	Life Technologies	A1377801	Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish	Sarstedt	83.3900.300	Cell culture
60 mm tissue culture dishes	Sarstedt	83.3901.300	Cell culture
24 well tissue culture plates	Sarstedt	83.3922.300	Cell culture
T25 tissue culture flasks	VWR	734-2311	Cell culture
15 mL tubes	Corning	430791	Centrifuge tubes
1.5 mL tube	Eppendorf	0030123.301	1.5 mL tube
CoolCell cell LX	Biocision	BCS-405	Freezing container
DMSO	Sigma	D2650-100ml	Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 mL	VWR	479-6847	Cryovials
PSC Cryopreservation Kit	Gibco	A2644601	PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%)	ThermoFisherScientific	25300054	Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12	Life Technologies	31331-028	Digestive enzymes dilutant
DPBS	Life Technologies	14190-094	PBS
HBSS	ThermoFIsher Scientific	14025-050	Biopsy preparation
Haemocytometer	Sigma	BRAND, 718920	Cell counting
Parafilm	VWR	291-1213	Sealing plates for storage