使用层粘连蛋白521矩阵整合人诱导多能干细胞的自由衍生

摘要

通过使用非整合仙台病毒（SeV）载体介导的真皮成纤维细胞的重编程，实现人诱导的多能干细胞（hiPS）细胞的稳健衍生。使用重组人层粘连蛋白521（LN-521）基质和Essential E8（E8）培养基，使用无异种素和化学定义的培养条件进行hiPS细胞维持和克隆扩增。

摘要

无性和完全定义的条件是稳定和可重复产生均质人诱导多能干细胞（hiPS）细胞的关键参数。饲养细胞或未定义基质上的hiPS细胞的维持易受批次差异，致病性污染和免疫原性风险的影响。使用定义的重组人层粘连蛋白521（LN-521）基质与无异种素和限定的培养基制剂组合减少变异性并允许hiPS细胞的一致产生。仙台病毒（SeV）载体是一种非整合的基于RNA的系统，因此规避了与基因组完整性整合载体可能具有的潜在破坏性影响相关的问题。此外，这些载体在真皮成纤维细胞的重新编程中已经表现出相对较高的效率。此外，细胞的酶促单细胞传代促进了hiPS细胞的均匀维持，而没有实质的茎干经验文化。在这里，我们描述了一个经过广泛测试和开发的方案，重点是重现性和易用性，为从成纤维细胞中产生定义和不含异种的人类hiPS细胞提供了一种可靠和实用的方法。

引言

由于Takahashi 等人首先推导出hiPS细胞系^1,2 ，hiPS细胞为疾病建模，药物发现和用于在再生医学中产生细胞疗法的源材料提供了有用的工具³ 。长期以来，HiPS细胞培养依赖于与成纤维细胞饲养细胞^4,5或基质胶⁶和含有胎牛血清（FBS）的培养基配制物的共培养。批次差异是这些文化条件未定义性质的常见后果，导致不可预测的变化，这是这些协议不可靠性的主要原因⁷ 。定义的培养基如基本8（E8） ⁸和定义的细胞培养基质例如LN-521 ^9的开发允许s用于建立高度可重复的方案，并有助于稳健的产生和维持均质的hiPS细胞7,8,9,10。

一体化免费重编程技术的发展已经跨越式发展。最初，重编程依赖于随机整合到基因组中的逆转录病毒载体，对基因组完整性具有破坏性影响¹¹ 。重编程方法的进展包括开发基于RNA的载体。 RNA载体相对于基于DNA的重编程方法具有优势，因为通过基因组重组的非预期整合是不可能的¹² 。 SeV载体通过没有DNA相^11的单链RNA提供高和短暂的外源因子表达。由SeV交付的重编程载体在整个细胞扩增过程中被稀释，最终从培养物中脱落，提供了免打印方式的重编程。此后，多能性的维持依赖于多能性基因的内源性表达² 。

作为开创性的基于hiPS细胞的疗法正在开始进入临床试验，标准化批次，再现性和安全性的要求是解决^13的重要问题。因此，应避免动物产地。例如，异种产品的使用与非人类病原体污染的风险相关。此外，在动物衍生的培养物组分存在下培养的细胞已经显示出将非人类硅酸掺入可能导致衍生细胞免疫原性的细胞膜中¹⁴ 。因此，消除异种产品的需要对于任何未来的临床追求都是必要的。此协议适用于xe免疫和定义的培养在保持hiPS细胞移动细胞更接近临床依从性。

该协议描述了从成纤维细胞产生标准化的hiPS细胞的一致，高度可重现和易于使用的方法。它还提供了一种用户友好的文化系统，用于维护已建立的hiPS细胞。该协议已被用于在Karolinska机构的瑞典国家人类iPS核心设施中获得超过300个hiPS细胞系，其中一些线路之前已被描述为^15,16 。

研究方案

患者资料的收集和hiPS细胞的推导得到道德评估委员会，2012年3月28日，斯德哥尔摩，注册号:2012 / 208-31 / 3的批准。细胞培养步骤应在生物安全柜内进行，除非另有说明。在使用细胞时，始终使用无菌处理技术。允许介质，板和试剂在启动前达到室温。在37℃，5％CO ₂高湿度条件下孵育细胞。

1.从真皮活检中分离人成纤维细胞

1. 培养基的制备，消化酶，菜肴和解剖工具的涂层。
   1. 准备成纤维细胞培养基:44.5mL Iscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM），5mL胎牛血清（FBS）和500μL青霉素/链霉素（PEST）（ 见表1 ），储存在4℃。
   2. 以1mg / mL的工作浓度制备消化酶:wei在分开的15-mL管中加入4mg分散酶和胶原酶I型粉末的gh等分试样并溶于4mL DMEM / F12 + 1％PEST中。通过将其通过0.22μm过滤器来消毒酶溶液。每次准备新鲜的酶溶液。
   3. 在6孔组织培养板（或35mm组织培养皿）中，每孔用1mL 0.1％明胶在磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中切片进行活检，涂一个孔。在室温下孵育30分钟。
   4. 高压灭菌一次手术剪刀和镊子每次活检进行解剖。
2. 活检处理
   注意:采集后尽可能快地处理活组织检查。在4℃下在PBS + 1％PEST中存放长达48小时。活检的大小应为2-4毫米，符合道德准证。
   1. 将活检转移到35毫米的盘中。将活组织检查移至新的35毫米皿中，并将活检浸没在2毫升70％乙醇中30秒。
   2. 将活检移至第三位35毫升菜，并用1毫升无菌汉克平衡盐溶液（HBSS）和1％PEST进行洗涤。
   3. 将活检转移到第四个35毫米皿中，加入1毫升新鲜制备的0.1％分散液。
   4. 使用手术剪刀和镊子将皮肤活检切成盘中1-2mm ³片，然后将包括分泌酶溶液的活检片转移到15mL管中。加入另外2 mL的分散液。
   5. 用1 mL分散液冲洗35 mm的培养皿并转移到15 mL管中。
   6. 在4℃孵育活检过夜。
   7. 加入4 mL 0.1％胶原酶Ⅰ至37℃孵育4 h。
   8. 将消化的细胞离心300×g 3分钟，抽出上清液并将消化物重悬于2mL成纤维细胞培养基中。
   9. 从6孔组织培养板中取出明胶溶液。将包括任何剩余片段的细胞悬浮液转移到6孔组织培养板（或35μm）中m组织培养皿），用DPBS中的0.1％明胶预涂。
   10. 每三天更换一次媒体。
3. 人类成纤维细胞的扩增
   注意:当80％汇合时，成纤维细胞可以传代给T25（25cm ² ）组织培养瓶（ 图2B ）。成纤维细胞通常在7天内达到80％的汇合。然而，所需时间可能会有很大差异，但不得超过4周。
   1. 吸出培养基，并用2.5mL DPBS洗涤一次。
   2. 取出DPBS，加入1 mL胰蛋白酶-EDTA（0.05％），37℃孵育5 min，直至细胞呈圆形边缘，开始分离。
   3. 加入2 mL成纤维细胞培养基，如有必要，冲洗细胞，确保细胞正确分离。将细胞溶液转移到15-mL管中，并以300xg离心3分钟。
   4. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5mL成纤维细胞培养基和平板成纤维细胞中包被细胞组织培养T25烧瓶。当在该步骤之后扩增成纤维细胞时，如上所述解离并种子12×10 ^3个细胞/ cm ² 。
   5. 一旦融合的细胞准备冻结，扩大或平板进行重新编程。在任何重新编程开始之前冻结两轮成纤维细胞（参见下一部分的冷冻程序）。下通道成纤维细胞的重编程效率一般较高，第2-4代细胞最佳。然而，使用该方案已经使成纤维细胞成功重编程直到第10代。
4. 冻融成纤维细胞
   1. 准备新鲜的成纤维细胞冷冻培养基:90％FBS + 10％二甲基亚砜（DMSO）。保持在4°C（ 表1 ）。一旦汇合，T25组织培养瓶可以冷冻成三个冷冻管。每瓶冷冻制备500μL成纤维细胞冷冻培养基。
   2. 冻结细胞，解离c使用血细胞计数器计数细胞并将3×10 ^5个细胞的部分转移至15-mL管。旋转管300×g 3分钟。吸出上清。
   3. 将细胞沉淀重悬于500μL的4℃成纤维细胞冷冻培养基中并转移到冷冻管中。将小瓶放入冷冻容器中，并将细胞在-80℃下孵育24小时，然后将其转移至液氮以长期储存。
   4. 要解冻细胞，将冰箱的底部浸入37°C的水中。一旦液化，将细胞悬浮液转移到15 mL管中，加入5 mL成纤维细胞培养基。旋转细胞300 xg 3 min。
   5. 去除上清液并将细胞沉淀重悬于5 mL成纤维细胞培养基中。将细胞转移至未涂覆的T25组织培养瓶中，并在37℃下孵育。

2.成纤维细胞的SeV载体重编程

1. 载体等分试样的制备
   小心:在生物安全2级遏制下处理SeV。参见制造商协议和本地准则¹⁷ 。病毒滴度在批次之间变化。
   1. 在制备等分试样之前，根据制造商的方案（ 例如 CytoTune 2.0）计算5×10 ^4个细胞所需的载体量。病毒滴度通常为8×10 ⁷ - 1.5×10 ⁸ 。解冻和组合载体5:5:3（KOS MOI = 5，hc-myc MOI = 5和hKlf4 = MOI 3）。将5×10 ^4个细胞的重新编程计算的部分分成高压灭菌的1.5mL管。用成纤维细胞稀释病毒等分试样至250μL的最终体积用于重新编程。
      注意:每个小瓶有效重新编程一个具有5×10 ⁴成纤维细胞的24孔组织培养板的一个孔。将病毒等分试样储存在-80°C。
2. SeV载体转导
   1. 吸气孔切片培养基并用1mL DPBS洗涤。吸入DPBS并加入1mL胰蛋白酶-EDTA（0.05％）。在37℃孵育5分钟或直到细胞分离。
   2. 加入2mL成纤维细胞培养基，并重悬细胞并转移到15-mL管中。离心300 xg 3 min。
   3. 吸出上清液并将沉淀重悬于2mL成纤维细胞培养基中。
   4. 在24孔组织培养板的一个孔中使用血细胞计数器和种子5×10 ⁴细胞计数成纤维细胞。在37℃孵育细胞过夜。
   5. 吸出细胞培养基，加入250μLSeV溶液，37℃孵育过夜。
   6. 每天更换培养基至新鲜成纤维细胞培养基。允许转导的细胞生长7天，然后传播到LN-521涂覆的平板。在通过前一天准备LN-521板。涂层程序参见2.3.1。
3. 替代转导的成纤维细胞
   1. 制备LN-521涂层:DPBS稀释LN-521至0.63μg/ cm ²的终浓度。每60毫米组织培养皿移取2毫升LN-521溶液。使用石蜡膜密封60毫米组织培养皿。在4℃下孵育过夜。
   2. 准备基本8中等（E8）等分试样以便于处理:48.5mL E8培养基，1mL E8补充物和500μLPEST（ 表1 ）。
   3. 转导后7天，将细胞通过LN-521涂覆的60mm组织培养皿。加入250μL胰蛋白酶-EDTA（0.05％），37℃孵育5分钟或直到细胞分离。加入2mL成纤维细胞培养基，并以300×g离心细胞3分钟。
   4. 吸出上清液。将沉淀重悬于2mL成纤维细胞培养基中，并在血细胞计数器中计数细胞。将来自预涂板的吸液LN-521溶液和在LN-521预涂的60mm培养皿中的5ml成纤维细胞培养基中种子4×10 ⁴细胞。添加Rho激酶抑制剂Y-27632（ROCKi）至最终浓度为5μM。在37℃下孵育过夜。
   5. 重要的是，第二天将介质更换为E8中等。每天更换E8中等hiPS细胞集落将在2-3周内出现。

3.采摘殖民地和hiPS细胞扩增

注意:以下步骤是在立体显微镜下在生物安全柜之外完成的。推荐使用发丝网和程序口罩。小心不要污染细胞培养。

1. 在采摘前一天准备LN-521涂层组织培养24孔板。 DPBS稀释LN-521 0.63μg/ cm ² 。将250μL的LN-521溶液移至24孔组织培养板的一个孔中。密封板使用石蜡膜。在4℃下孵育过夜。
   注意:当大小达到直径1毫米的大小时，殖民地已准备好挑选。殖民地应显示锋利的边缘，并以均匀的单株生长olayers（ 图2D ）。
2. 吸出LN-521溶液，并将500μLE8加入24孔组织培养板的一个孔中。
3. 用立体显微镜下的网格像格子的手术刀将殖民地切成小块。机械地从盘中刮下细胞片并使用200μL移液管将片材转移到制备好的孔中（ 图2D-2D ）。选择殖民地分成不同的井。
4. 允许细胞在不改变培养基的情况下附着48小时。此后，每天更换E8。
5. 当菌落达到> 5mm的大小时，将细胞作为单细胞酶促传代至LN-521涂层板的新孔。
6. 从细胞吸出细胞培养基，用250μLDPBS洗涤。
7. 吸气DPBS。加入250μL解离试剂，37℃孵育3 min。
8. 观察细胞已经开始向上。分离通过用解离试剂冲洗细胞几次，从板上取出细胞。
9. 向15 mL管中加入500μLE8培养基。将解离试剂中的细胞转移到管中，并以300×g离心3分钟。
10. 从LN-521预涂井抽出LN-521溶液，加入500μL室温E8培养基。
11. 吸出上清并将细胞沉淀重悬于500μL的E8培养基中。
12. 使用血细胞计数器计数细胞，并在制备的LN-521预包被孔（1.25×10 ⁴ - 2.5×10 ^4个细胞/ cm ² ）中种2.5×10 ⁴ -5×10 ^4个细胞。细胞培养格式可以轻松地放大到适合预期目的。
13. 将ROCKi添加到终浓度为10μM。孵育细胞在37°C。
14. 每天更换E8中等细胞通常在4-6天后通过。当约90％融合时，将上述细胞作为单细胞进行酶促传代。
    注意:重编程载体在hiPS细胞扩增期间逐渐稀释，在第12代后无法检测到。通常重新编程的细胞通常停止在6-10周围增殖或丧失其特征性多能干细胞形态（ 图3B ）。
15. hiPS细胞的冻融
    1. 为了冷冻细胞，如上所述用单细胞酶促离解细胞，在血细胞计数器中计数细胞，并将2.5×10 ^5个细胞转移到含有1mL E8培养基的15-mL管中。以300 xg离心3分钟。吸出上清液。
    2. 将细胞沉淀重悬于250μL4℃的PSC冷冻细胞中，并转移至低温条件下。将小瓶放入冷冻容器中，并将细胞在-80℃下孵育24小时，然后将其转移至液氮以进行长期储存。
    3. 为了解冻细胞，准备24孔组织培养物的预涂LN-521孔通过吸取LN-521溶液并加入250μLE8培养基。将冰箱的底部浸入37°C的水中，直到只剩下一个小冰柱。
    4. 向冷冻机中加入250μLE8培养基，并将细胞悬浮液转移到15 mL试管中，加入1 mL E8培养基。旋转细胞300 xg 3 min。
    5. 取出上清液，将细胞沉淀重悬于250μL室温E8培养基中。将细胞悬浮液转移到准备好的孔中，加入1％细胞活力补充剂或10μMROCKi。在37℃下孵育组织培养板。

结果

从活检到hiPS细胞

从活检到建立的hiPS细胞，清除重编程载体并准备表征的整个过程大约需要16周（ 图1 ）。 图2A中指定了更详细的时间表。需要大约4周来建立和扩大成纤维细胞培养。第一个hiPS细胞集落开始在仙台载体转导后约三周出现。首先通过机械采集菌落，然后以单细胞酶促传代...

讨论

该协议的预期结果是成功生成几个克隆导出的hiPS细胞系。重要的是，这里描述的用于维持和扩增所建立的hiPS细胞的方法是可靠的，并且可以以少量干细胞培养的经验进行。已知使用ROCKi与LN-521基因进行单酶细胞传代，将细胞维持在核型正常，多能性和易于分化，同时避免诱导的异质性，基于集落的传代可刺激10,19,20。在LN-521上培养的hiPS细胞可以作为单细胞传代，而不添加ROCKi ¹⁰ ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase	Life Technologies	171105-041	Biopsy digestion
Collagenase	Sigma	C0130	Biopsy digestion
Gelatin	Sigma	G1393	Fibroblast matrix
IMDM	Life Technologies	21980002-032	Fibroblast medium
FBS	Invitrogen	10270106	Fibroblast medium
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Antibiotic
Essential 8 media	ThermFisher Scientific	A1517001	iPS cell culture media
LN-521	Biolamina	LN521-03	iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X	ThermoFisher Scientific	12563011	Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit	Life Technologies	A1377801	Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish	Sarstedt	83.3900.300	Cell culture
60 mm tissue culture dishes	Sarstedt	83.3901.300	Cell culture
24 well tissue culture plates	Sarstedt	83.3922.300	Cell culture
T25 tissue culture flasks	VWR	734-2311	Cell culture
15 mL tubes	Corning	430791	Centrifuge tubes
1.5 mL tube	Eppendorf	0030123.301	1.5 mL tube
CoolCell cell LX	Biocision	BCS-405	Freezing container
DMSO	Sigma	D2650-100ml	Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 mL	VWR	479-6847	Cryovials
PSC Cryopreservation Kit	Gibco	A2644601	PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%)	ThermoFisherScientific	25300054	Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12	Life Technologies	31331-028	Digestive enzymes dilutant
DPBS	Life Technologies	14190-094	PBS
HBSS	ThermoFIsher Scientific	14025-050	Biopsy preparation
Haemocytometer	Sigma	BRAND, 718920	Cell counting
Parafilm	VWR	291-1213	Sealing plates for storage