تقييم العيوب عرقلة مفرق المسالك البولية عن طريق حقن صبغة أزرق الميثيلين

Kangsun Yun

doi:10.3791/56247

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

حقن صبغة أزرق الميثيلين في الحوض الكلوي يسهل تقييم المسالك البولية مفرق عرقلة العيوب أثناء تطوير المسالك البولية الجنينية الماوس. ويرد هنا، بروتوكولا لحقن صبغة أزرق الميثيلين في الحوض الكلوي.

Abstract

المسالك البولية مفرق عرقلة العيوب هي التشوهات الخلقية حمل هيدرونيفروسيس وهيدروريتير. يمكن تقييم المسالك البولية موريني مفرق عرقلة العيوب من خلال تتبع تدفق صبغة أزرق الميثيلين داخل الجهاز البولي. يتم حقن صبغة أزرق الميثيلين في الحوض الكلوي للكلى الجنينية قبل الولادة، ورصد تدفق صبغ من الحوض الكلوي الكلي عن طريق الحالب وفي التجويف المثانة بعد الضغط الهيدروستاتي. تراكم صبغ سيكون واضحا في التجويف المثانة المسالك البولية الفترة المحيطة بالولادة الطبيعية، ولكن ستكون مقيدة بين الحوض الكلوي ونقطة نهاية الحالب غير طبيعي، في حالة حدوث عوائق المسالك البولية. ويسهل هذا الأسلوب تأكيدا للمسالك البولية مفرق العراقيل والتصور هيدرونيفروسيس وهيدروريتير. ويصف هذه المخطوطة بروتوكول لحقن صبغة أزرق الميثيلين في الحوض الكلوي لتأكيد العراقيل مفرق المسالك البولية.

Introduction

الجهاز البولي يتكون من زوج من الكلي والحالب والمثانة ومجرى البول مشتركة. والوظيفة الرئيسية للجهاز البولي المحافظة على التوازن الجسم بإدارة توازن الماء والكهرباء للدم. الكلي تصفية الدم لتركيزات اﻻلكتروﻻيت التحكم وحمض قاعدة التوازن، وإنتاج البول تفرز فائض المياه والنفايات بما في ذلك الذوائب ونواتج الأيض. ثم يتم نقل البول من خلال الحالب من الحوض الكلوي الكلي إلى بلاديرين بطريقة أحادية الاتجاه حيث يتم تخزينها والقضاء عليها في نهاية المطاف عن طريق الاحليل¹.

الحالب أنابيب مستقيمة مصدرها القناة ونمائية. بعد الناشئين من لاصق ونمائية يوم الجنينية 10.5 (E10.5) في الماوس، ساق الحالب الغضروفي ويفرق في بنية متعددة الطبقات تسمى أوروثيليوم وكتيمه بين الماوس E12.5 و E16.5. كما تختلف الخلايا الوسيطة التي تحيط بساق الحالب إلى ثلاث طبقات مكونة من الخلايا اللحمية الداخلية وخلايا العضلات الملساء سميكة الوسيطة الليفية أدفينتيتيال الخارجي. موجات تمعجية الحالب الشروع في الحوض الكلوي تنتشر من خلال طبقة العضلات الملساء لجدار الحالب إلى المثانة لنقل البول²^،³، الذي يتم إنتاجه في بداية E16.5 في الماوس¹.

التشوهات الخلقية في الكلي والمسالك البولية (كاكوت) من بين الأمراض الوراثية الأكثر شيوعاً، في حوالي 1 في المائة من الأجنة البشرية¹^،⁴، وتتألف من مجموعة متنوعة من تعمل بما في ذلك هيدرونيفروسيس وهيدروريتير. ويؤدي التراكم غير طبيعي للبول في الكلي والحالب تشكيل هيدرونيفروتيك hydroureter والكلى. أحد الأسباب لتشكيل هيدرونيفروسيس و/أو هيدروريتير من انسداد المسالك البولية. انسداد مفرق أوريتيروبيلفيك (أوبجو) بسبب تدفق البول الشاذة بسبب انسداد الحالب الدانية بين الحوض الكلوي، مما أدى إلى هيدرونيفروسيس وتضييق hydroureter الدانية مع أنجولاتيون أو المستمرة للطي⁵^، ⁶. وباﻹضافة إلى ذلك، إدراج الحالب القاصي حمل خارج الرحم في جدار المثانة أو المسالك التناسلية يسمى عرقلة مفرق أوريتيروفيسيكال (أوفجو). يمكن أيضا لحمل أوفجو هيدرونيفروسيس وهيدروميجوريتير⁷^،تشكيل⁸. هو عيب مفرق (أوفج) أوريتيروفيسيكال إضافية الجزر فيسيكوريتيريك (فور). فور يتسم بالتدفق إلى الوراء البول من المثانة نحو الكلي في أوفج. بالمقارنة مع أوفجو، الأجنة قبل الولادة مع فور لا واضح إظهار الكلي منتفخة هيدرونيفروتيك أو هيدروريتير الشديد النمط الظاهري⁹.

في مختبر الماوس، يمكن دراسة تدفق البول بحقن صبغة، مثل الميثيلين الأزرق، في الحوض الكلوي⁹. الحل إينجيكتيدميثيليني الأزرق وسوف تتبع مسار البول من الحوض الكلوي عن طريق الحالب والمثانة. Hydronephrosis يمكن أن تعترف بزيادة الصبغة في الكلي. ويمكن الكشف عن آبجو كانسداد تدفق الصبغة في الحالب الدانية مع الحوض الكلوي منتفخة⁵. أي تمدد الحالب المؤشرة قطرها اتسعت يوضح مثال على هيدروريتير. أخيرا، يشير إلى أوفجو مع هيدرونيفروتيك منتفخة الكلي تراكم صبغ في جدار المثانة أو في موقع المسالك التناسلية والمتوسعة⁷^،هيدروميجوريتير¹⁰. للكشف عن فور، يتم حقن الحل صبغ في المثانة ورصد تدفق تراجعية لاحقة في الكلي⁹.

ويرد هنا، بروتوكولا لحقن صبغة أزرق الميثيلين إلى الحوض الكلوي الجنين قبل الولادة. هذا البروتوكول يسمح لتعقب تدفق البول من الحوض الكلوي من خلال الحالب والمثانة والتحقق من المسالك البولية مفرق العراقيل المحتملة مثل آبجو أو أوفجو.

Protocol

الفئران (فلكس Wnt5a/فلكس الفئران (Wnt5a ^tm1.1Tpy) وخط Dll1Cre، ونموذج الماوس أوفجو) ⁷ تدار وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ودراسة في إطار بروتوكول أقرته لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان NCI-فريدريك.

1-"إعداد حل صبغة أزرق الميثيلين"

قياس مسحوق أزرق الميثيلين 0.1 غ.
حل أزرق الميثيلين في المحلول الملحي العادي 10 مل أو 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تماما بواسطة فورتيكسينج.
تصفية الحل الميثيلين الأزرق 10 ملغ/مل مع عامل تصفية المحاقن (حجم المسام غشاء 0.45µm) للقضاء على انسداد أثناء حقن.
تجميع فروة الرأس عقيمة الوريد مجموعة (27GX3/4 ″) مع 3 مل حقنه المتاح وملء المحاقن مع 3 مل تصفية حل أزرق الميثيلين.
ملاحظة: لمنع الضغط الهيدروليكي وتدفق صبغ اللاحقة، ضع طرف إبرة أعلاه حقنه مليئة الأزرق الميثيلين الحل.

2. تشريح الأجنة "قبل الولادة"

نظيفة تشريح المقص والملقط مع الإيثانول 70%-
لجمع الأجنة قبل الولادة في E18.5 أو E19.5، euthanize الفئران الحوامل استخدام استنشاق أول أكسيد الكربون ₂ أولاً ثم قم بإجراء خلع عنق الرحم وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة-
ملاحظة: الماوس الإناث الحوامل وعادة ما تلد البدء في E18.5، إلا أن الكليتين أكبر أسهل للتعامل معها. ولذلك، الكلي في E19.5 أقرب للولادة أسهل لإجراء هذا التحليل على. ومع ذلك، من الجراء مع المسالك البولية ثنائية العراقيل يموت بعد الولادة. وينبغي تبعاً لخصائص الفئران التجريبية، تحديد يوم أو وقت جمع مناسب تجريبيا.
رذاذ الإيثانول 70% على سطح البطن البطني ثم قم بفتح التجويف البطني بطنيا باستخدام مقص وملقط تشريح.
رفع الرحم كامل وفصل من الجسم بالقطع مع تشريح مقص على نصائح قرون الرحم.
شطف الرحم كامل مع برنامج تلفزيوني 1 x في طبق بيتري.
الرحم سيجمينتالي مع تشريح مقص قطع وإزالة المشيمة أوروبية مع تشريح الملقط للكشف عن الأجنة في الأكياس صفار.
إزالة كيس الصفار أولاً ومن ثم إزالة الغشاء السلوى بتشريح الملقط لتحرير الأجنة قبل الولادة-
قطع رأس جنين بتشريح المقص. تمحو الدم الزائد مع منصات شاش معقم. دبوس الجنين إلى أسفل مع سطحه البطني حتى على مجهر تشريح مجهزة بكاميرا رقمية للتصوير. جمع ذيله للتنميط إذا لزم الأمر-
ملاحظة: إجراء حقن الأجنة واحد في وقت واحد.
بعناية فتح التجويف البطني للجنين بالملقط بتمزق الجلد. ثم، بعناية إزالة الزائدة والأنسجة مثل الكبد والمعدة والأمعاء بالملقط بقصها أو الانسحاب منها لفضح الكليتين والحالب والمثانة التي تقع في دورسالي ( الشكل 1A). امتصاص الدم الزائد من تشريح الجنين مع منصات شاش معقم إذا لزم الأمر-
ملاحظة: الدم الزائد يتداخل مع تحديد الحوض الكلوي لحقن صبغة.

3. حقن صبغة "أزرق الميثيلين" إلى الحوض الكلوي ورصد تدفق صبغ

إزالة الفقاعات في الإبر والأنابيب بطرد أزرق الميثيلين الحل من طرف الإبرة بالضغط الهيدروليكي. رفع المحاقن التي تحتوي على الحل صبغ فوق مستوى الحافة إبرة لبدء تدفق، وثم انخفاض المحاقن لوقف التدفق.
أدخل الإبرة في الحوض الكلوي قرب الحالب الدانية، مع الحرص على عدم الإخلال بأنها وضعت مرة واحدة. إجراء حقن صبغة في الكلي لتحديد به انسداد المسالك البولية.
ملاحظة: إجراء صبغ حقن في أي الكلي غير طبيعي ⁷ الأولى باتباع نفس الطريقة لتحديد به انسداد المسالك البولية.
رفع المحاقن يصل حوالي 20 سم لتوفير الضغط الهيدروليكي واسمحوا ميليلتر 15-60 ميليلتر من تدفق الحل الصبغ. معدل التدفق ستكون حوالي 3 ميليلتر/s إذا أثير المحاقن لهذا الارتفاع فوق الجنين.
اللون الأزرق لصبغ ابتداء من أول في الحوض الكلوي، ثم في طول الحالب، وأخيراً في التجويف المثانة.
ملاحظة: يستغرق حوالي 5 s لمشاهدة لون صبغة ضعيفة تنشأ داخل التجويف المثانة إذا كان يتم بشكل صحيح إدراج الحالب في المثانة. تسمح الصبغة تتراكم في موقع المحظورة حوالي 15 ثانية إذا ظهر أي لون الصبغة في تجويف المثانة.
مكان المحاقن وصولاً إلى وقف تدفق صبغ وإزالة الإبرة من الكلي.
تأخذ الصور الكلي والحالب والمثانة تتبع مع الحل صبغ استخدام الكاميرا والتصوير البرنامج متصلاً ستيريوميكروسكوبي.
جعل سجل hydronephrosis الكلي، هيدروريتير، والموقف النهائي للحل صبغ في دفتر ملاحظات معمل.
أداء الكلي كونترالاتيرال كما هو موضح في المقاطع 3.1) إلى 3.5) والسماح بتدفق صبغ حوالي 20 s في المجموع-
ملاحظة: سيتم ملء التجويف المثانة مع الحل الصبغ، المبين بلون أزرق قوي، إذا كان الحالب يتم إدراجها بشكل صحيح في تجويف المثانة. بعد تقييم لعرقلة مفرق المسالك البولية، يمكن أن تكون ثابتة الحالب والمثانة من أجل تمزيقها.

النتائج

تقع الظهرية لمعظم الأعضاء الداخلية مثل الكبد والأمعاء والكلى والجهاز البولي السفلي. بعد إزالة هذه الأجهزة الداخلية الأخرى، هي زوج من الكلي والحالب ومثانة مفردة مرئية (الشكل 1A). عند تشريح ناجحة، سوف يتدفق صبغ حقن الحوض الكلوي من الكلي إلى المثانة عن طريق ا...

Discussion

الماوس الكلي الوظيفية بدءاً E16.5 واختبار حقن صبغة من الممكن نظرياً من هذه النقطة الزمنية. ومع ذلك، الكلي صغير جداً بالحقن مع الحل صبغ وتعمل مثل هيدرونيفروسيس وهيدروريتير لا تراعي وضوح حيث تعمل هذه تأثير ثانوية من البول التي تراكمت بسبب النقل البول غير طبيعي. وتتضح هذه تعمل، من العراقيل مثل ...

Disclosures

ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.

Acknowledgements

أود أن أشكر الدكتور ألن سين بيرانتونى (CDBL/NCI/المعاهد الوطنية للصحة) لدعم تقديم هذه المخطوطة. أود أيضا أن أشكر الدكتور مايكل هول (CDBL/NCI/المعاهد الوطنية للصحة) و Nirmala شارما (CDBL/NCI/المعاهد الوطنية للصحة) لتحرير هذه المخطوطة. أنا ممتن لأي ثانغ (سايك) لتربية ماوس ممتازة له. وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني للسرطان، ومركز "أبحاث السرطان".

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML	Fisherscientific	50-983-204
3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip	BD	309657
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane	Pall corporation	4614
Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12"	EXELINT	26709
Delicate Operating Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6702
Micro Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5135
Dumont Tweezers; Pattern #5	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5045
BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2"	BD	305106

References

Rasouly, H. M., Lu, W. Lower urinary tract development and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 307-342 (2013).
Kispert, A. T-Box Genes in the Kidney and Urinary Tract. Curr Top Dev Biol. 122, 245-278 (2017).
Bohnenpoll, T., Kispert, A. Ureter growth and differentiation. Semin Cell Dev Biol. 36, 21-30 (2014).
Nicolaou, N., Renkema, K. Y., Bongers, E. M., Giles, R. H., Knoers, N. V. Genetic, environmental, and epigenetic factors involved in CAKUT. Nat Rev Nephrol. 11, 720-731 (2015).
Tripathi, P., Wang, Y., Casey, A. M., Chen, F. Absence of canonical Smad signaling in ureteral and bladder mesenchyme causes ureteropelvic junction obstruction. J Am Soc Nephrol. 23, 618-628 (2012).
Aoki, Y., et al. Id2 haploinsufficiency in mice leads to congenital hydronephrosis resembling that in humans. Genes Cells. 9, 1287-1296 (2004).
Yun, K., Perantoni, A. O. Hydronephrosis in the Wnt5a-ablated kidney is caused by an abnormal ureter-bladder connection. Differentiation. 94, 1-7 (2017).
Uetani, N., Bouchard, M. Plumbing in the embryo: developmental defects of the urinary tracts. Clin Genet. 75, 307-317 (2009).
Murawski, I. J., Watt, C. L., Gupta, I. R. Assessing urinary tract defects in mice: methods to detect the presence of vesicoureteric reflux and urinary tract obstruction. Methods Mol Biol. 886, 351-362 (2012).
Weiss, A. C., et al. Nephric duct insertion requires EphA4/EphA7 signaling from the pericloacal mesenchyme. Development. 141, 3420-3430 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

128

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: