הערכת בדרכי השתן צומת פגמים חסימה על ידי הזרקת מתילן כחול צבע

Summary

הזרקת מתילן כחול צבע לתוך האגן הכליה מקלה את הערכת ליקויי חסימה בדרכי השתן צומת במהלך התפתחות דלקת בדרכי השתן עובריים בעכבר. . הנה, עבור הזרקת מתילן כחול צבע לתוך אגן הכליה פרוטוקול המתואר.

Abstract

פגמים חסימה בדרכי השתן צומת הם מולדים גרימת hydronephrosis ו- hydroureter. פגמים חסימה בדרכי השתן מאתר צומת יכול להיות מוערך על ידי מעקב אחר זרימת לצבוע מתילן כחול בתוך מערכת השתן. צבע כחול מתילן מוזרק לתוך אגן הכליה הכליות עובריים הלידה ונשאר צבע זרימת להשגחה של אגן הכליה הכליה וגרגר ו לתוך לומן שלפוחית השתן לאחר הפעלת לחץ הידרוסטטי. צבע הצטברות יהיה ניכר לומן שלפוחית השתן בדרכי השתן הלידה הרגילה, אך מוגבל בין אגן הכליה את נקודת הסיום של שופכן נורמלי, אם התרחשה חסימות בדרכי השתן. שיטה זו מקלה על האישור של חסימות בדרכי השתן צומת והדמיה של hydronephrosis ו- hydroureter. כתב יד זה מתאר פרוטוקול עבור הזרקת מתילן כחול צבע לתוך האגן הכליה לאשר חסימות בדרכי השתן צומת.

Introduction

מערכת השתן מורכב זוג של הכליות ו ureters ו נפוץ שלפוחית השתן לשופכה. הפונקציה העיקרית של מערכת השתן היא לשמור על הומאוסטזיס בגוף על-ידי ניהול יתרת אלקטרוליט והמים של הדם. הכליות לסנן את הדם שליטה אלקטרוליט ריכוזים, מאזן חומצה בסיס, לייצר שתן כדי במעים עודף מים ופסולת כולל מומסים בגבול מטבוליטים. השתן מועבר מכן וגרגר מ אגן הכליה עד bladderin באופן חד כיווני איפה זה מאוחסן, בסופו של דבר מסולק דרך השופכה¹.

Ureters הם צינורות ישרים שמקורו התעלה nephric. לאחר להנץ מן התעלה nephric ביום עובריים 10.5 (E10.5) העכבר, הקנה שופכן לתרמיל, מבדיל בין לתוך מבנה מרובה שכבות בשם urothelium אשר הוא אטום בין עכבר, E12.5 ו- E16.5. התאים mesenchymal סביב הקנה שופכן מובדלים גם לתוך שלוש שכבות המורכבת תאי סטרומה הפנימי, תאי השריר החלק העבה ביניים ו fibroblasts adventitial החיצוני. Ureteral גלי ממברנות ייזום באגן הכליה מופצים דרך השכבה שריר חלק של הקיר שופכן שלפוחית השתן להובלת שתן^2,3, אשר מיוצר החל מ- E16.5 העכבר¹.

מולדים של כליות ודרכי השתן (CAKUT) הם בין מחלות גנטיות בתדירות הגבוהה ביותר, נוכח סביב 1% של עוברים אנושיים^1,4, המורכבת מגוון פנוטיפים כולל hydronephrosis ו- hydroureter. הצטברות חריגה של שתן בתוצאות שופכן וכליות במבנה כליה, hydroureter hydronephrotic. אחד סיבת היווצרות hydronephrosis ו/או hydroureter היא חסימה של דרכי השתן. חסימת צומת Ureteropelvic (UPJO) נגרמת על ידי זרימת השתן aberrant עקב סתימה בין השופכן הפרוקסימלית של אגן הכליה, וכתוצאה מכך hydronephrosis וצמצום hydroureter הפרוקסימלית אפוזיציה או מתקפלים מתמיד^{5, 6}. בנוסף, חוץ רחמי ההוספה של השופכן דיסטלי לתוך הקיר בשלפוחית השתן או במערכת הרבייה נקרא חסימה בצומת ureterovesical (UVJO). UVJO יכול גם לגרום hydronephrosis ו hydromegaureter היווצרות^7,8. פגם צומת (UVJ) ureterovesical נוסף הוא vesicoureteric ריפלוקס (VUR). VUR מאופיין על ידי זרימת השתן רטרוגרדית משלפוחית לכיוון הכליה-UVJ. בהשוואה ל- UVJO, העוברים הלידה עם VUR בפירוש מציג של כליות hydronephrotic נפוחה או hydroureter חמורה פנוטיפ⁹.

העכבר מעבדה, זרימת השתן יכול להיבדק על ידי הזרקה של צבע, כגון כחול מתילן, לתוך אגן הכליה⁹. הפתרון injectedmethylene הכחול יהיה להתחקות אחר מסלול שתן מן האגן הכליה וגרגר ו לתוך שלפוחית השתן. Hydronephrosis ניתן לזהות על ידי הרחבה של לצבוע בתוך הכליה. UPJO ניתן יהיה מזוהה כמו סתימה של צבען זורם השופכן צינתור עם אגן הכליה נפוחה⁵. כל התרחבות של השופכן שצוין על-ידי קוטר המוגדלות מדגים דוגמה hydroureter. לבסוף, הצטברות צבע לקיר שלפוחית השתן או באתר של מערכת הרבייה מציינת UVJO עם כליה hydronephrotic נפוחה, מורחבים^7,hydromegaureter¹⁰. כדי לזהות VUR, הפתרון לצבוע מוזרק לתוך שלפוחית השתן, זרימה רטרוגרדית עוקבות מנוטר ב כליות⁹.

כאן מוצג עבור הזרקת מתילן כחול צבע לתוך אגן הכליה העובר הלידה פרוטוקול. פרוטוקול זה מאפשר את העקיבה של זרימת השתן מ אגן הכליה וגרגר ו לתוך שלפוחית השתן ומוודא פוטנציאליים חסימות צומת דרכי השתן כגון UPJO או UVJO.

Protocol

עכברים (Wnt5a flox / flox עכברים (Wnt5a ^tm1.1Tpy) וקו Dll1Cre, דגם העכבר UVJO) ⁷ היו מנוהלים על פי הנחיות NIH טיפול ושימוש של חיות מעבדה למד תחת פרוטוקול שאושרו על ידי NCI-פרדריק חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה.

1. הכנה של מתילן כחול צבע פתרון

1. למדוד אבקה וורודה 0.1 g.
2. לפזר את מתילן כחול 10 מ ל תמיסת מלח או 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) לחלוטין על-ידי vortexing.
3. סינון הפתרון מתילן כחול 10 מ"ג/מ"ל עם מסנן מזרק (גודל הנקבוביות ממברנה 0.45µm) כדי למנוע סתימת במהלך ההזרקה.
4. להרכיב הקרקפת סטרילי הווריד סט (27GX3/4 ″) עם מזרק חד פעמיות 3 מ"ל, למלא המזרק עם 3 מ ל מסונן פתרון מתילן כחול.
   הערה: כדי למנוע לחץ הידרוסטטי, לצבוע לאחר מכן זרימה, מקם קצה המחט מעל המזרק מלא עם פתרון מתילן כחול.

2. דיסקציה של העוברים לפני הלידה

1. נקי לנתח מספריים וחדים עם אתנול 70%-
2. כדי לאסוף את העוברים הלידה E18.5 או E19.5, המתת חסד עכברים בהריון הראשון באמצעות אינהלציה ₂ CO ולאחר מכן לבצע פריקה צוואר הרחם בהתאם להנחיות NIH.
   הערה: העכבר נקבה בהריון בדרך כלל יולדת ההתחלתי הוא E18.5, לעומת זאת, הכליות גדולות הן טיפול קל יותר. לכן, הכליות-E19.5 קרוב יותר ללידה הן קל יותר לבצע ניתוח זה. עם זאת, כלבלבים עם חסימות בדרכי השתן הדו-צדדיים למות לאחר הלידה. בהתאם המאפיינים של עכברים ניסיוני, יום/שעה אוסף המתאים מדעית ייקבע.
3. תרסיס אתנול 70% על פני הבטן הגחון ולאחר מכן פתח את חלל הבטן ventrally באמצעות מלקחיים ומספריים ויבתר.
4. הרם הרחם כולו, להפריד אותו מן הגוף על-ידי חיתוך עם לנתח מספריים-העצות של הקרניים הרחם.
5. לשטוף את הרחם כולו עם 1 x PBS בצלחת פטרי.
6. לחתוך את הרחם segmentally עם מספריים לנתח ולהסיר את היפרדות רותמי עם לנתח מלקחיים לחשוף את העוברים בתוך שקי חלמון.
7. להסיר את שק החלמון תחילה ולאחר מכן להסיר את קרום מי השפיר עם לנתח מלקחיים כדי לשחרר את העוברים הלידה.
8. לערוף העובר עם לנתח מספריים. . תנגב את עודף דם עם תחבושות גזה סטרילי. להפיל את העובר עם פני השטח הגחון שלו למעלה על מיקרוסקופ ויבתר מצויד with a מצלמה דיגיטלית עבור הדמיה. לאסוף את זנבו עבור genotyping במידת הצורך.
   הערה: לבצע זריקות העובר אחת בכל פעם.
9. פתח היטב את חלל הבטן של העובר עם מלקחיים על ידי קריעת העור. לאחר מכן, הסר בזהירות עודף איברים ורקמות כגון הכבד, הקיבה, המעי עם מלקחיים על-ידי גזירתם או מוציאה אותם לחשוף את הכליות, ureters את שלפוחית השתן הממוקמים dorsally ( איור 1 א'). לספוג עודפי הדם של העובר ביתור עם תחבושות גזה סטרילי, במידת הצורך.
   הערה: עודף דם מפריע זיהוי אגן הכליה על הזרקת צבע.

3. הזרקת מתילן כחול צבע לתוך אגן הכליה ואת ניטור לצבוע לזרום

1. בועות הסר המחט, אבובים על ידי סילוק מתילן כחול פתרון מהקצה המחט על ידי לחץ הידרוסטטי. להרים את המזרק המכיל את הפתרון לצבוע מעל הרמה של קצה המחט כדי להתחיל זרימת ולאחר מכן להנמיך את המזרק כדי לעצור את זרימת.
2. מכניס את המחט אגן הכליה ליד השופכן צינתור, דואגת שלא להפריע את זה מהרגע ששמים. לבצע הזרקת צבע לתוך כליה כדי לקבוע החסימה בדרכי השתן שלו.
   הערה: בצע לצבוע הזרקה לתוך כל כליה חריג ⁷ הראשון על-ידי ביצוע באופן זהה כדי לקבוע החסימה בדרכי השתן שלו.
3. הרם את המזרק עד כ-20 ס מ לספק לחץ הידרוסטטי. ולתת µL 15 - 60 µL של הזרם פתרון לצבוע. קצב הזרימה יהיה 3 µL/s אם המזרק הוא הרים את הגובה הזה מעל העובר.
4. לנטר את הצבע הכחול של לצבוע מתחיל הראשון של אגן הכליה, אזי באורך של השופכן, ולבסוף ב לומן שלפוחית השתן-
   הערה: זה לוקח בערך 5 s לראות צבע לצבוע חלש להגיח בתוך לומן שלפוחית השתן אם השופכן הוכנס כהלכה לתוך שלפוחית השתן. אפשר לצבוע לצבור חסומים באתר כ- 15 ש' אם אין צבע לצבוע מופיע לומן שלפוחית השתן.
5. למקם את המזרק עד להפסיק לצבוע זרימה, הסר את המחט מן הכליה.
6. לקחת תמונות של הכליה, השופכן לשלפוחית השתן לעקוב אחריו עם צבע פתרון באמצעות מצלמת ה והדמיה התוכנית מחוברים stereomicroscope.
7. להפוך רשומה של hydronephrosis של הכליה, hydroureter את המיקום הסופי של הפתרון לצבוע במחברת המעבדה.
8. לבצע הזרקה של הכליה contralateral כפי שמתואר סעיפים 3.1) ל 3.5) ולאפשר זרימה צבען בערך 20 s בסה כ.
   הערה: לומן שלפוחית השתן יהיה מלא עם פתרון לצבוע, המצוין על-ידי צבע כחול חזק, אם השופכן הוכנס כהלכה לתוך לומן שלפוחית השתן. לאחר הערכה של חסימת צומת דרכי השתן, את ureters ואת שלפוחית השתן יכול להיות קבוע על חלוקתה.

תוצאות

הכליות, מערכת השתן התחתונה ממוקמים הגבי לאיברים הפנימיים ביותר אחרים כגון הכבד, המעי. לאחר הסרת האלו לאיברים פנימיים אחרים, הם זוג כליות ואת ureters לו שלפוחית שתן בודדת גלוי (איור 1 א'). על ניתוח מוצלח, לצבוע מוזרק את אגן הכליה יזרום מן הכליה לתוך שלפוחית השתן ד...

Discussion

העכבר כליות פונקציונלי החל E16.5, מבחן הזרקת צבע אפשרי תיאורטית, מנקודת זמן זו. עם זאת, הכליה הוא קטן מדי כדי להיות מוזרק עם הפתרון לצבוע, פנוטיפים hydronephrosis ו hydroureter שאינם קיימים בבירור מאז פנוטיפים אלה הם השפעה משנית של שתן בנוי עקב שתן נורמלי תחבורה. פנוטיפים אלה, מן המכשולים כגון UPJO או UVJO, ניכ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML	Fisherscientific	50-983-204
3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip	BD	309657
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane	Pall corporation	4614
Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12"	EXELINT	26709
Delicate Operating Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6702
Micro Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5135
Dumont Tweezers; Pattern #5	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5045
BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2"	BD	305106