Оценка дефекты обструкции мочевыводящих путей Junction Метиленовый синий краситель инъекции

Резюме

Метиленовый синий краситель инъекции в почечной лоханки облегчает оценку дефекты обструкции мочевыводящих путей соединения во время мыши эмбриональные мочевыводящих путей развития. Здесь описывается протокол для инъекций красителя метиленового синего в почечной лоханки.

Аннотация

Дефекты обструкции мочевыводящих путей соединения являются врожденные аномалии, вызывая гидронефроз и hydroureter. Дефекты обструкции мышиных мочевыводящих путей перехода можно оценить по отслеживание потока красителя метиленового синего в мочевыделительной системы. Метиленового синего красителя инъецируется в почечной лоханки перинатальной эмбриональных почек и краска поток контролируется от почечной лоханки почки через Мочеточник и в просвете мочевого пузыря после применения гидростатического давления. Накопление краски будет видно в просвете мочевого пузыря нормальное перинатальной мочевыводящих путей, но будет ограничен между почечной лоханки и конечной точкой аномальные мочеточника, если встречаются препятствия мочевыводящих путей. Этот метод способствует подтверждение мочевыводящих путей перехода препятствий и визуализация гидронефроз и hydroureter. Эта рукопись описывает протокол для инъекций красителя метиленового синего в почечной лоханки для подтверждения мочевыводящих путей перехода препятствий.

Введение

Мочевая система состоит из пары почек и мочеточников и общей мочевого пузыря и мочеиспускательного канала. Основная функция мочевой системы является поддержание гомеостаза организма путем управления водно-электролитного баланса крови. Почки фильтрации крови для контроля концентрации электролитного и кислотно щелочной баланс и производят моча выводят лишнюю воду и отходы, включая растворенных веществ и метаболитов. Затем моча транспортируется через Мочеточник от почечной лоханки почки к bladderin однонаправленный манере, где она хранится и в конечном счете ликвидирована через мочеиспускательный канал¹.

Прямые трубы, происходящих из нефрической протока мочеточников. После бутонизации из нефрической протока на эмбриональных день 10.5 (E10.5) в мышь, стебель мочеточника удлиняется и отличает в многослойной структуре, называемой Уротелий, который является непроницаемой между мыши, E12.5 и E16.5. Мезенхимальные клетки, окружающие стебель мочеточника также дифференцированы на три слоя, состоящий из внутреннего стромальных клеток, промежуточные толстые гладких мышечных клеток и наружной adventitial фибробластов. Уретеральные перистальтические волны в почечной лоханки, распространяются через слой гладких мышц стенки мочеточника в мочевой пузырь для транспортировки мочи^2,3, которая производится начиная E16.5 в мышь¹.

Врожденные аномалии почек и мочевыводящих путей (CAKUT) относятся к числу наиболее частых генетических заболеваний, в около 1% человеческого плода^1,4и состоит из целого ряда фенотипов, включая гидронефроз и hydroureter. Ненормальное накопление мочи в результатах почки и мочеточника в формирование почек и hydroureter hydronephrotic. Одной из причин формирования гидронефроз или hydroureter является обструкции мочевыводящих путей. Ureteropelvic перекрестка обструкции (UPJO) вызвано аномальным мочи потока из-за закупорки между проксимального отдела мочеточника и почечной лоханки, что привело к гидронефроз и проксимальный hydroureter сужение с углы или стойких складной^{5, 6}. Кроме того внематочная вставки дистальной части мочеточника в стенке мочевого пузыря или репродуктивного тракта называется ureterovesical перекрестка обструкции (UVJO). UVJO можно также вызвать гидронефроз и hydromegaureter формирования^7,,⁸. Дефект Джанкшен (UVJ) дополнительные ureterovesical-vesicoureteric рефлюкс (VUR). VUR характеризуется поток Ретроградная мочи из мочевого пузыря к почек на UVJ. По сравнению с UVJO, перинатальной эмбрионов с VUR не показывают отчетливо растянутый hydronephrotic почек или тяжелой hydroureter фенотип⁹.

Лабораторные мыши струя мочи может быть проверен инъекции красителя, например, метиленовый синий, в почечной лоханки⁹. Injectedmethylene синий решение будет проследить траекторию мочи от почечной лоханки через Мочеточник и в мочевой пузырь. Гидронефроз могут быть признаны расширение красителя в почках. UPJO могут быть обнаружены как блокирование потока красителя на проксимальной мочеточник с растянутый почечной лоханки⁵. Любое дилатация мочеточника, обозначается расширены диаметр демонстрирует пример hydroureter. Наконец накопление краски на стенку мочевого пузыря или на сайте репродуктивного тракта указывает UVJO с растянутый hydronephrotic почек и расширены hydromegaureter^7,10. Чтобы обнаружить VUR, раствор красителя инъецируется в мочевого пузыря и последующих Ретроградная поток контролируется в почках⁹.

Здесь представлен протокол для инъекций красителя метиленового синего в почечной лоханки перинатальной эмбриона. Этот протокол позволяет трассировки потока мочи от почечной лоханки через Мочеточник и в мочевом пузыре и проверяет потенциальные мочевыводящих путей перехода препятствий, таких как UPJO или UVJO.

протокол

мышей (Wnt5a flox / flox мышей (Wnt5a ^tm1.1Tpy) и Dll1Cre линии, UVJO модель мыши) ⁷ осуществлялось согласно NIH руководящие принципы для ухода и использования лабораторных животных и учился под протоколом, утвержденным NCI-Фредерик животное уход и использование Комитетом.

1. Подготовка раствор метиленового синего красителя

1. измерения 0,1 г, метиленовый синий порошок.
2. Растворения метиленового синего в 10 мл физиологическим или 1 x-фосфатный буфер (PBS), vortexing.
3. Фильтр 10 мг/мл раствора метиленового синего с шприц фильтр (Размер поры мембраны 0.45µm), чтобы устранить засорение во время инъекции.
4. Сборка стерильные головы вены набор (27GX3/4 ″) с одноразовой шприц 3 мл и заполните шприц 3 мл фильтруют раствора метиленового синего.
   Примечание: Чтобы предотвратить гидростатического давления и потока последующего окрашивания, поместите кончик иглы выше шприц, заполненные раствором метиленового синего.

2. Рассечение дородовой эмбрионов

1. чистый рассекает ножницы и щипцы с 70% этанол.
2. Для сбора перинатальной эмбрионов в E18.5 или E19.5, усыпить беременных мышей использованием CO ₂ ингаляции сначала и затем выполнить шейки матки дислокации согласно рекомендациям NIH.
   Примечание: Беременных женщин мыши обычно рожает начиная с E18.5, однако, больше почек, легче манипулировать. Таким образом почками в E19.5 ближе к рождению проще выполнять этот анализ. Однако щенков с двусторонними мочевыводящих путей препятствия умирают после рождения. В зависимости от характеристики экспериментальной мышей, соответствующую коллекцию день/время должна определяться эпирически.
3. Спрей 70% этанол на вентральной поверхности живота, а затем открыть брюшной полости вентрально использованием рассечения ножницы и щипцами.
4. Поднять всю матку и отделить его от тела путем резки с рассечения ножницы на кончики рогов матки.
5. Смыть всю матку с ПБС в чашке Петри.
6. Матки сегментарно с рассечения ножницами вырезать и удалить плацентарной decidua с рассечения щипцы подвергать эмбрионов в желтке sacs.
7. Сначала удалить желточного мешка и затем удалите амниотической мембраны с рассечения щипцы освободить перинатальной эмбрионов.
8. Обезглавить эмбриона с рассечения ножницы. Вытрите избыток крови с стерильные марлевые подушечки. Придавить эмбриона с его вентральной поверхности вверх на рассечения микроскоп оснащен цифровой камерой для воображения. Собирать его хвост для генотипирования, в случае необходимости.
   Примечание: Выполнение инъекции одного эмбриона в то время,.
9. Тщательно открыть брюшной полости эмбриона с щипцами, разрывая на кожу. Затем, тщательно удалить избыток органов и тканей, таких как печень, желудок и кишечник с щипцами, вырезая их или потянув их подвергать почек, мочеточников и мочевого пузыря, которые расположены дорзально ( рис. 1A). Поглощают избыток крови из расчлененных эмбриона с стерильные марлевые подушечки, в случае необходимости.
   Примечание: Избыток крови мешает идентификации почечной лоханки для инъекций краситель.

3. Инъекции красителя метиленового синего в почечной лоханки и мониторинг потока краска

1. удалить пузыри на иглы и трубки, изгоняя раствор метиленового синего из кончик иглы на гидростатическое давление. Поднимите шприц, содержащие раствор красителя над уровнем кончик иглы для начала потока, а затем опустите шприца, чтобы остановить поток.
2. Вставить иглу в почечной лоханки вблизи проксимального отдела мочеточника, стараясь не нарушить его однажды помещены. Выполнять инъекции красителя в почку для определения ее непроходимость мочевыводящих путей.
   : Примечание краска инъекции в любой ненормальной почек ⁷ первый, следуя так же определить его обструкции мочевыводящих путей.
3. Поднимите шприц до около 20 см для обеспечения гидростатического давления и пусть 15 мкл - 60 мкл потока раствора красителя. Скорость потока будет около 3 мкл/s если шприц возникает на этой высоте над эмбриона.
4. Мониторинг синий цвет красителя, начиная в почечной лоханки, затем в длину мочеточника и наконец в просвет пузыря.
   Примечание: Занимает около 5 s чтобы увидеть слабая краска цвета появляются в просвет пузыря, если мочеточника в мочевой пузырь правильно вставлен. Разрешить краситель накопить на заблокированный сайт около 15 s если не краска цвет появляется в просвет пузыря.
5. Место шприца до остановки потока краски и удалите иглу из почки.
6. Принимать изображения и почек, мочеточника, мочевого пузыря с раствор красителя с помощью камеры и изображений программы подключены к стереомикроскопом.
7. Сделать запись гидронефроз почки, hydroureter и окончательной позиции раствор красителя в лаборатории ноутбука.
8. Выполнения инъекций контралатеральной почки как описано в разделах 3.1) до 3.5) и позволяют краска поток около 20 s в целом.
   Примечание: В просвет пузыря будет наполнен раствор красителя, обозначается сильным синим цветом, если мочеточника правильно вставлена в просвет пузыря. После оценки Джанкшен обструкции мочевыводящих путей, мочевого пузыря и мочеточников может устанавливаться для разрезания.

Результаты

Почек и нижних мочевых расположены спинной большинства других внутренних органов, как печень и кишечника. После удаления этих других внутренних органов, пару почек и мочеточников и один мочевого пузыря являются видимыми (рис. 1A). После успешного рассеч...

Обсуждение

Мыши почки начинают в E16.5 функциональных и тестирования внедрения краситель теоретически возможно с этого момента времени. Однако почки слишком малы, чтобы быть вводили раствор красителя и фенотипы гидронефроз и hydroureter не наблюдаются четко поскольку эти фенотипы вторичный эффект мочи...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML	Fisherscientific	50-983-204
3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip	BD	309657
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane	Pall corporation	4614
Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12"	EXELINT	26709
Delicate Operating Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6702
Micro Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5135
Dumont Tweezers; Pattern #5	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5045
BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2"	BD	305106