Methylene 청색 색소를 주입 하 여 요로 분기점 방해 결함 평가

요약

Methylene 청색 염료 주입 신장 골반으로 마우스 배아 요로 개발 하는 동안 요로 분기점 방해 결함의 평가 촉진 한다. 여기, 신장 골반에 methylene 청색 염료 주입에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

초록

요로 분기점 방해 결함은 선천적인 변형을 유도 hydronephrosis 및 hydroureter. Murine 요로 분기점 방해 결함 비뇨 기 시스템 내에서 메 틸 렌 블루 염색 흐름을 추적 하 여 평가 될 수 있다. Methylene 청색 염료 perinatal 배아 신장의 신장 골반에 주입 하 고 염료 흐름은 액체 정역학 압력을 적용 한 후 신장 ureter 통해 및 방광 루멘에의 신장 골반에서 모니터링 합니다. 염료 축적 정상적인 perinatal 요로, 방광 루멘에 분명 있을 것입니다 하지만 요로 문제 발생 하는 경우 신장 골반 사이 비정상적인 ureter의 강요 될 것 이다. 이 방법은 요로 분기점 장애물 확인 및 hydronephrosis 및 hydroureter의 시각화를 촉진 한다. 이 원고는 요로 분기점 장애물을 확인 하 신 골반에 methylene 청색 염료 주입에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

서문

비뇨 기 시스템은 신장, ureters 및 일반적인 방광과 요도의 한 쌍의 구성 됩니다. 비뇨 기 시스템의 주요 기능은 혈액의 물과 전해질 균형을 관리 하 여 신체의 항상성 유지 하는 것입니다. 신장 혈액 제어 전해질 농도 산 성-기본 균형을 필터링 하 고 초과 물과 용액 및 대사 산물 등 폐기물을 배설 하는 소변 생산. 소변은 신장 신장 골반에서 ureter 그것 저장 되 고 궁극적으로 요도¹통해 제거 단방향 방식으로 bladderin 통해 다음 수송 된다.

ureters는 직선 튜브 nephric 덕트에서 발생. 마우스에서 배아 일 10.5 (E10.5)에서 nephric 덕트에서 신진, 후 ureter 스토킹 elongates 및 E12.5 및 E16.5 라는 마우스 사이 침투성은 urothelium 다층 구조로 차별화. Ureter 줄기 주변 중간 엽 세포 또한 내부 stromal 세포, 중간 두께 평활 근 세포, 그리고 외부 adventitial 섬유 아 세포로 구성 된 3 개의 층으로 구분 됩니다. 신장 골반에서 시작 ureteral 연동 파도 ureter 소변^2,3, E16.5 마우스¹부터 생산 되는 수송 방광 벽의 평활 근 층을 통해 전파 됩니다.

신장 및 요로 (CAKUT)의 선천적인 이상이 가장 빈번한 유전 질병, 인간 태아^1,4의 약 1%에 중 고 고기 hydronephrosis 및 hydroureter 등의 다양 한 구성. 고 신장 ureter 소변의 비정상적인 축적 hydronephrotic 신장 및 hydroureter 형성에 결과. Hydronephrosis 또는 hydroureter 형성의 한 원인은 요로 방해 이다. Ureteropelvic 접속점 방해 (UPJO) 인접 ureter hydronephrosis 및 인접 hydroureter angulation 또는 영구 접는^{5, 축소의 결과로 신장 골반 사이 방해 때문에 탈 선 소변 흐름에 의해 발생 6}. 또한, 방광 벽 또는 생식 관의 원심 ureter 소성 삽입 ureterovesical 접속점 방해 (UVJO) 이라고 합니다. UVJO 또한 hydronephrosis와 hydromegaureter 형성^7,8을 유도할 수 있다. 추가 ureterovesical 접합 (UVJ) 결함은 vesicoureteric 환류 (VUR). VUR는 UVJ에서 신장으로 방광에서 역행 소변 흐름에 의해 특징입니다. UVJO에 비해 perinatal 배아 VUR로 표시 되지 않습니다 분명히 팽창된 hydronephrotic 신장 이나 심한 hydroureter 표현 형⁹.

실험실 마우스에서 소변 신장 골반⁹에 메 틸 렌 블루 등 염료의 주입에 의해 시험 될 수 있다. Injectedmethylene 블루 솔루션 통해 ureter, 방광으로 신장 골반에서 소변 궤적을 추적 한다. Hydronephrosis 염료는 신장에서의 확장에 의해 인식 될 수 있다. UPJO 발포 신장 골반⁵근 위 ureter에서 염료 흐름의 막힘으로 감지할 수 있습니다. 어떤 팽창 확대 직경으로 표시 ureter의 hydroureter의 예를 보여 줍니다. 마지막으로, 염료 축적 방광 벽에 또는 생식 관의 사이트에서 UVJO 발포 hydronephrotic 신장으로 나타내고 크기 hydromegaureter^7,10. VUR를 검출 하기 위하여 염료 솔루션은 방광에 주입 하 고 후속 역행 흐름 신장⁹에서 모니터링 됩니다.

여기, 주 태아의 신장 골반에 methylene 청색 염료 주입에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 이 프로토콜 통해 ureter, 방광으로 신장 골반에서 소변 흐름의 추적을 허용 하 고 UPJO 또는 UVJO와 같은 잠재적인 요로 분기점 장애물을 확인 합니다.

프로토콜

쥐 (Wnt5a flox / flox 마우스 (Wnt5a ^tm1.1Tpy) 및 Dll1Cre 선, UVJO 마우스 모델) 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 NIH 지침에 따라 관리 ⁷ NCI 프레드릭 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 프로토콜 아래에서 공부 하는 고.

1. 메 틸 렌 블루 염색 솔루션의 준비

1. 측정 0.1 g 메 틸 렌 블루 가루.
2. 10 mL 정상적인 염 분 또는 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1에서 메 틸 렌 블루를 vortexing에 의해 완전히 분해.
3. 주입 동안 막힘 제거 주사기 필터 (막 기 공 크기 0.45µm) 10 mg/mL 메 틸 렌 블루 솔루션 필터.
4. 어셈블 메 마른 두 피 정 맥 세트 (27GX3/4 ″) 3 mL 일회용 주사기와 채우기 3 mL을 주사기 메 틸 렌 블루 솔루션 필터링.
   참고: 수압 및 후속 염료 흐름을 방지 하려면 배치 메 틸 렌 블루 솔루션으로 채워진 주사기 위에 바늘 팁.

2. 출생 전 태아의 해 부

1. 깨끗 한가 위와 집게를 70% 에탄올과 해 부.
E18.5 또는 E19.5, perinatal 배아를 수집
2. 임신 마우스를 안락사 먼저 CO ₂ 흡입을 사용 하 고 다음 수행 NIH 지침에 따라 자 궁 경부 전위.
   그러나 참고: 임신 여성 마우스 일반적으로 출산 E18.5에서 시작,, 더 큰 신장은 조작 하기 쉽습니다. 따라서, 신장 E19.5 가까이에 출생에는에이 분석을 수행 하기 쉽습니다. 그러나, 양측 요로 방해 된 출산 후 새끼. 실험 쥐의 특성에 따라 적절 한 컬렉션 요일/시간 수 경험적으로 결정 합니다.
3. 복 부 복 부 표면에 70% 에탄올을 스프레이 하 고 해가 위와 집게를 사용 하 여 ventrally 복 부 구멍.
4. 전체 자 궁 고 해 부가 위 자 궁 뿔의 끝을 절단 하 여 몸에서 분리.
5. 1 x PBS 가진 전체 자 궁 페 트리 접시에 린스.
6. Segmentally가 위 해 부와 자 궁을 잘라내어 집게 노른자위 낭에서 태아를 폭로 해 부와 placental decidua 제거.
7. 노른자위 sac를 먼저 제거 하 고 해방 perinatal 배아를 집게 해 부와 양수 막 제거.
8. 배아가 위 해 부와 목을 벨. 멸 균 거 즈 패드와 함께 과잉 혈액을 닦아. 태아 그것의 복 부 표면 위로 핀 해 현미경 이미징에 대 한 디지털 카메라를 갖춘. 필요한 경우 유전형 꼬리를 수집.
   참고: 한 번에 주사 한 배아를 수행.
9. 신중 하 게 피부를 찢 어 여 집게로 태아의 복 부 구멍을 엽니다. 다음, 조심 스럽게 제거 초과 장기와 조직 간, 위, 소장 등 집게와 그들을 절단 또는 신장, ureters, 방광 dorsally는 노출에 그들을 밖으로 당기 ( 그림 1A). 필요한 경우 멸 균 거 즈 패드와 함께 해 부 배아에서 과잉 혈액을 흡수.
   참고: 초과 혈액 신장 골반 염료 주입에 대 한 식별과 방해.

3. 신장 골반 및 염료 흐름 모니터링 Methylene 청색 염료의 주입

1. 바늘에 액체 정역학 압력에 의해 바늘 팁에서 메 틸 렌 블루 솔루션을 추방 하 여 튜브 제거 거품. 시작 흐름, 바늘 팁의 수준 이상의 염료 솔루션이 포함 된 주사기를 들어올린 다음 낮은 흐름을 막으려고 주사기.
2. 신장 골반 근 ureter, 한 번 배치 그것을 방해 하지 않도록 주의 복용 근처에 바늘을 삽입 합니다. 수행의 요로 방해를 결정 하기 위해 신장에 염료 주입.
   참고: 수행의 요로 장애를 결정 하는 같은 방법에 따라 어떤 비정상적인 신장 ⁷에 주입을 첫 번째 염색.
3. 15 µ L-60 µ L 염료 솔루션 흐름의 액체 정역학 압력을 제공 하는 약 20 cm를 주사기를 들어올립니다. 유량 주사기 태아 위에이 높이 발생 약 3 µ L/s 됩니다.
4. 모니터링 신장 골반에서 다음 ureter의 길이에 처음 시작 하는 염료의 파란색 그리고 마지막으로 방광 루멘에서.
   참고: 그것은 걸립니다 약 5 s ureter을 방광에 올바르게 삽입 하는 경우 방광 루멘 내에서 등장 하는 약한 염료 색깔을 보고. 차단 된 사이트에 대해 15에서 축적 하는 염료를 허용 염료 색깔 방광 루멘에 표시 하는 경우 s.
5. 중지 염료 흐름으로 주사기를 놓고 바늘을 제거 하는 신장에서.
6. 신장, ureter, 방광 염료 솔루션 추적의 걸릴 이미지는 stereomicroscope에 연결 하는 카메라를 사용 하 여 및 프로그램 이미징.
7. 실험실 노트북에는 신장, hydroureter, 및 염료 솔루션의 최종 위치 hydronephrosis의 기록을 만들기.
8. 수행 주입 contralateral 신장에 설명 된 대로 섹션 3.1) 3.5) 염료 흐름 약 20 수 총에서 s.
   참고: 방광 루멘 ureter을 방광 루멘에 올바르게 삽입 하는 경우 강한 파란 색깔에 의해 표시 된 염료 해결책으로 가득 합니다. 요로 분기점 방해의 평가, 후에 ureters, 방광 고쳐질 수 있다 단면에 대 한.

결과

신장과 더 낮은 오 줌 시스템 등 간, 대 장 등 대부분의 다른 내부 장기에 있습니다. 제거한 후에 이러한 다른 내부 장기, 신장, ureters과 단일 방광의 쌍 표시 (그림 1A)는. 성공 해 부에 신장 골반에 주입 하는 염료 ureter 통해 방광으로 신장에서 흐름 것입니다. 신장 골반 ureter는 신장에서의 깔때기 모양의 동 공이 확장 되어 근 위 부분 이다. 따라서, 염?...

토론

마우스 신장 E16.5 기능 시작 되며 염료 주입 테스트가 시간 포인트에서 이론적으로 가능 하다. 그러나, 신장이 너무 작아 염료 솔루션 주입 및 이후이 고기 때문에 비정상적인 소변 전송 쌓아 소변의 보조 효과 hydronephrosis 및 hydroureter 같은 고기 명확 하 게 관찰 하지는. UPJO 또는 UVJO, 같은 장애물에서이 고기 발포 신장, ureters, E18.5에서 분명 하다. E19.5 또는 신생아 강아지에 태아의 큰 신장은 E18.5에?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML	Fisherscientific	50-983-204
3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip	BD	309657
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane	Pall corporation	4614
Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12"	EXELINT	26709
Delicate Operating Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6702
Micro Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5135
Dumont Tweezers; Pattern #5	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5045
BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2"	BD	305106