Valutazione difetti di ostruzione delle vie urinarie Junction iniettando colorante blu di metilene

Riepilogo

Iniezione della tintura del blu di metilene nella pelvi renale facilita la valutazione dei difetti di ostruzione delle vie urinarie giunzione durante lo sviluppo embrionale dell'apparato urinario del mouse. Qui, un protocollo per l'iniezione della tintura del blu di metilene nella pelvi renale è descritto.

Abstract

Difetti di ostruzione delle vie urinarie giunzione sono anomalie congenite inducendo idronefrosi e hydroureter. Difetti di ostruzione giunzione murino delle vie urinarie possono essere valutati da monitorando il flusso di colorante blu di metilene all'interno del sistema urinario. Blu di metilene colorante viene iniettato nella pelvi renale dei reni embrionali perinatale e flusso di tintura è monitorato dalla pelvi renale del rene attraverso l'uretere e nel lume della vescica dopo l'applicazione di pressione idrostatica. Accumulo di colorante sarà evidente nel lume della vescica dell'apparato urinario perinatale normale, ma sarà vincolata tra pelvi renale e il punto finale di un uretere anormale, in caso di ostruzioni delle vie urinarie. Questo metodo facilita la conferma delle ostruzioni di giunzione delle vie urinarie e visualizzazione di idronefrosi e hydroureter. Questo manoscritto descrive un protocollo per l'iniezione della tintura del blu di metilene nella pelvi renale per confermare ostruzioni di giunzione delle vie urinarie.

Introduzione

Il sistema urinario è costituito da una coppia di reni e ureteri e un comune della vescica e dell'uretra. La funzione principale del sistema urinario è di mantenere l'omeostasi corporea gestendo l'equilibrio di acqua ed elettroliti del sangue. I reni filtrano il sangue per controllo di concentrazione di elettroliti e l'equilibrio acido-base e producono urina per espellere l'acqua in eccesso e rifiuti tra cui soluti e metaboliti. Urina viene quindi trasportato attraverso l'uretere dalla pelvi renale del rene per la bladderin un modo unidirezionale dove viene immagazzinata e infine eliminata attraverso l' uretra¹.

Gli ureteri sono tubi dritti che proviene dal dotto nephric. Dopo in erba dal dotto nephric al giorno embrionale 10.5 (e 10.5) nel topo, il gambo di uretere si allunga e differenzia in una struttura multistrata denominata urothelium che è impermeabile tra mouse 12.5 ed E16.5. Le cellule mesenchimali che circondano il gambo dell'uretere sono anche differenziate in tre strati composto da cellule stromali interne, cellule di muscolo liscio spessore intermedio e fibroblasti adventitial esterni. Le onde peristaltiche ureterale avvio nella pelvi renale vengono propagate attraverso lo strato di muscolo liscio della parete dell'uretere alla vescica per il trasporto di urine^2,3, che è prodotto a partire da E16.5 in mouse¹.

Anomalie congenite del rene e delle vie urinarie (CAKUT) sono tra le più frequenti malattie genetiche, presente in circa 1% dei feti umani^1,4e composto di una varietà di fenotipi compreso idronefrosi e hydroureter. L'abnorme accumulo di urina nel rene e uretere provoca hydronephrotic del rene e hydroureter formazione. Una causa di formazione di idronefrosi e/o hydroureter è un'ostruzione delle vie urinarie. Ureteropelvic della giunzione (UPJO) è causato dal flusso di urina aberrante a causa di un blocco tra l'uretere prossimale e la pelvi renale, con conseguente idronefrosi e prossimale hydroureter restringimento con angolazione o persistente pieghevole^{5, 6}. Inoltre, l'inserimento ectopica dell'uretere distale nella parete della vescica o del tratto riproduttivo viene chiamato ostruzione giunzione ureterovesical (UVJO). UVJO può anche indurre l'idronefrosi e hydromegaureter formazione^7,8. Un difetto di giunzione (UVJ) ulteriori ureterovesical è reflusso vesicoureteric (RVU). VUR è caratterizzata da flusso retrogrado dell'urina dalla vescica verso il rene presso UVJ. Rispetto al UVJO, perinatali embrioni con VUR non distintamente mostrano un rene hydronephrotic dilatato o grave hydroureter fenotipo⁹.

Nel topo di laboratorio, il flusso di urina può essere esaminato tramite l'iniezione di un colorante, come il blu di metilene, nel bacino renale⁹. La soluzione di injectedmethylene blu si traccia la traiettoria di urina dalla pelvi renale attraverso l'uretere e la vescica. Idronefrosi possono essere riconosciuto da un'espansione del colorante nel rene. UPJO può essere rilevato come un blocco del flusso di tintura all'uretere prossimale con pelvi renale dilatata⁵. Qualsiasi dilatazione dell'uretere indicato da un diametro allargato di seguito viene illustrato un esempio di hydroureter. Infine, accumulo di colorante alla parete della vescica o presso il sito del tratto riproduttivo indica UVJO con rene hydronephrotic dilatato e dilatato hydromegaureter^7,10. Per rilevare VUR, la soluzione colorante viene iniettata nella vescica e conseguente flusso retrogrado è monitorato nel rene⁹.

Qui, un protocollo per l'iniezione di colorante blu di metilene nella pelvi renale di un embrione perinatale è presentato. Questo protocollo permette l'analisi del flusso di urina dalla pelvi renale attraverso l'uretere e la vescica e verifica potenziali ostacoli di giunzione delle vie urinarie come UPJO o UVJO.

Protocollo

topi (Wnt5a flox / flox topi (Wnt5a ^tm1.1Tpy) e Dll1Cre linea, modello murino UVJO) ⁷ erano gestiti secondo le linee guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio Studiò con un protocollo approvato dal comitato di uso e NCI-Frederick Animal Care.

1. preparazione della soluzione di colorante blu di metilene

1. misura 0,1 g di blu di metilene polvere.
2. Sciogliere completamente il blu di metilene in salino normale 10 mL o 1 x tamponato fosfato salino (PBS) nel Vortex.
3. Filtrare la soluzione di blu di metilene 10 mg/mL con un siringa filtro (dimensione dei pori di membrana 0.45µm) per eliminare l'intasamento durante l'iniezione.
4. Montare un sterile del cuoio capelluto vena set (27GX3/4 ″) con una siringa monouso da 3 mL e riempire la siringa con 3 mL di filtrato soluzione di blu di metilene.
   Nota: Per evitare successive tintura flusso e pressione idrostatica, posizionare la punta dell'ago sopra la siringa riempita con soluzione di blu di metilene.

2. Dissezione di embrioni prenatale

1. pulito di dissezione Forbici e pinze con etanolo al 70%.
2. Per raccogliere embrioni perinatali a E18.5 o e 19.5, eutanasia topi incinti prima mediante inalazione di CO ₂ e quindi eseguire dislocazione cervicale secondo linee guida NIH.
   Nota: Il mouse femmina incinto solitamente dà vita a partire da E18.5, tuttavia, i reni più grandi sono più facili da manipolare. Di conseguenza, reni a e 19.5 più vicino alla nascita sono più facili da eseguire questa analisi su. Tuttavia, cuccioli con bilaterale delle vie urinarie ostruzioni muoiono dopo la nascita. A seconda delle caratteristiche di topi sperimentali, una raccolta appropriata giorno e ora dovrebbe essere determinata empiricamente.
3. Spray etanolo al 70% sulla superficie addominale ventrale e quindi aprire la cavità addominale ventrale utilizzando pinze e forbici per dissezione.
4. Sollevare l'intero utero e separarla dal corpo di taglio con forbici alle punte dei corni uterini di dissezione.
5. Sciacquare l'intero utero con PBS 1X in una capsula Petri.
6. Tagliare l'utero segmentally con forbici di dissezione e rimuovere placenta decidua con forcipe per esporre gli embrioni nei sac di tuorlo di dissezione.
7. Rimuovere il sacco vitellino prima e poi rimuovere la membrana amniotic con forcipe per liberare gli embrioni perinatali di dissezione.
8. Decapitare un embrione con forbici di dissezione. Pulire il sangue in eccesso con compresse di garza sterile. L'embrione pin con la sua superficie ventrale up in un microscopio per dissezione equipaggiato con una fotocamera digitale per l'imaging. Raccogliere la sua coda per genotipizzazione se necessario.
   Nota: Eseguire un embrione iniezioni alla volta.
9. Aprire con cautela la cavità addominale di un embrione con forcipe strappando la pelle. Quindi, rimuovere con delicatezza in eccesso organi e tessuti quali fegato, stomaco e intestino con forcipe tagliandoli o tirarle fuori per esporre i reni, ureteri e vescica che sono situati dorsalmente ( Figura 1A). Assorbire il sangue in eccesso dall'embrione dissecata con compresse di garza sterile se necessario.
   Nota: Il sangue in eccesso interferisce con identificazione della pelvi renale per l'iniezione di colorante.

3. Iniezione di colorante blu di metilene nella pelvi renale e monitoraggio del flusso di tintura

1. Rimuovi bolle nell'ago e la tubazione espellendo soluzione di blu di metilene dalla punta dell'ago dalla pressione idrostatica. Sollevare la siringa contenente la soluzione di colorante sopra il livello della punta dell'ago per avviare il flusso e quindi abbassare la siringa per interrompere il flusso.
2. Inserire l'ago nella pelvi renale vicino l'uretere prossimale, facendo attenzione a non per disturbare una volta posizionati. Eseguire l'iniezione della tintura in un rene per determinare la sua ostruzione dell'apparato urinario.
   Nota: Eseguire la tintura prima iniezione in qualsiasi renale anormale ⁷ seguendo allo stesso modo per determinare la sua ostruzione dell'apparato urinario.
3. Sollevare la siringa fino a circa 20 cm per fornire pressione idrostatica e lasciare 15 µ l - 60 µ l del flusso di soluzione del colorante. La portata sarà circa 3 µ l/s se la siringa è aumentata a questa altezza sopra l'embrione.
4. Monitorare il colore blu della tintura a partire prima nella pelvi renale, poi nella lunghezza dell'uretere e infine nel lume della vescica.
   Nota: Si impiegano circa 5 s per vedere un colore tintura debole emergono all'interno del lumen della vescica se l'uretere è correttamente inserito nella vescica. Consentire il colorante ad accumularsi nel sito bloccato circa 15 s se nessun colore tintura compare nel lume della vescica.
5. Posizionare la siringa fino a fermata tintura flusso e rimuovere l'ago dal rene.
6. Foto per scattare foto di rene, uretere e vescica tracciata con soluzione colorante con la fotocamera e programma di imaging collegato a uno stereomicroscopio.
7. Fare un record di idronefrosi del rene, hydroureter e la posizione finale della soluzione colorante in un quaderno di laboratorio.
8. Eseguire l'iniezione di rene controlaterale come descritto nelle sezioni 3.1) a 3.5) e consentire il flusso di tintura circa 20 s in totale.
   Nota: Il lume della vescica sarà riempito di soluzione colorante, indicata da un colore blu forte, se l'uretere è inserito correttamente nel lume della vescica. Dopo la valutazione dell'ostruzione della giunzione delle vie urinarie, ureteri e vescica può essere fissate per sezionamento.

Risultati

I reni e il sistema urinario inferiore si trovano dorsale alla maggior parte degli altri organi interni come il fegato ed intestino. Dopo la rimozione di questi altri organi interni, una coppia di reni e ureteri e vescica una singola sono visibili (Figura 1A). Al momento di successo dissezione, il colorante iniettato nella pelvi renale fluirà dal rene nella vescica tramite l'uretere. La pelvi renale è la parte prossimale dilatata imbuto dell'uretere nel ren...

Discussione

I reni mouse sono inizio funzionale alle E16.5 e una prova di iniezione della tintura è teoricamente possibile da questo punto di tempo. Tuttavia, il rene è troppo piccolo per essere iniettato con la soluzione colorante e fenotipi quali idronefrosi e hydroureter non si osservano chiaramente dal momento che questi fenotipi sono un effetto secondario di urina accumulato a causa del trasporto delle urine anormali. Questi fenotipi, da ostruzioni quali UPJO o UVJO, sono evidenti alle E18.5 di dilatato reni e ureteri. Reni p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML	Fisherscientific	50-983-204
3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip	BD	309657
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane	Pall corporation	4614
Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12"	EXELINT	26709
Delicate Operating Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6702
Micro Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5135
Dumont Tweezers; Pattern #5	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5045
BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2"	BD	305106