Beurteilung der Harnwege Junction Obstruktion Mängel durch Methylenblau-Dye-Injektion

Zusammenfassung

Methylenblau-Dye-Injektion in das Nierenbecken erleichtert die Beurteilung der Harnwege Kreuzung Obstruktion Mängel während der Maus embryonalen Harnwege Entwicklung. Hier wird ein Protokoll für Methylenblau-Dye-Injektion in das Nierenbecken beschrieben.

Zusammenfassung

Harnwege Kreuzung Obstruktion Mängel sind angeborene Anomalien induzierende Hydronephrose und Hydroureter. Murine Harnwege Kreuzung Obstruktion Mängel können beurteilt werden, durch die Verfolgung Methylenblau färben Strömung innerhalb der Harnwege. Methylenblau-Dye in das Nierenbecken der perinatalen embryonale Nieren injiziert und Farbstoff wird überwacht von den Nierenbecken der Niere durch den Harnleiter und in das Lumen der Blase nach dem hydrostatischen Druck anwenden. Farbstoff Anhäufung werden deutlich in der Blase Lumen der normalen perinatale Harnwege, sondern wird zwischen dem Nierenbecken und den Endpunkt der eine abnorme Harnleiter, eingeschränkt werden, wenn die Harnwege Hindernisse auftreten. Diese Methode ermöglicht die Bestätigung der Harnwege Kreuzung Hindernisse und Visualisierung von Hydronephrose und Hydroureter. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll für Methylenblau färben Injektion in das Nierenbecken, Harnwege Kreuzung Hindernisse zu bestätigen.

Einleitung

Das Harnsystem besteht aus einem Paar Nieren und Harnleiter und einer gemeinsamen Blase und Harnröhre. Die Hauptfunktion des Harnsystems ist Körper-Homöostase durch die Verwaltung der Wasser- und Elektrolyt-Gleichgewicht des Blutes. Die Nieren filtern das Blut zur Kontrolle Elektrolyt Konzentrationen und Säure-Basen-Gleichgewicht und produzieren Urin um überschüssiges Wasser und Abfällen einschließlich Solute und Stoffwechselprodukte auszuscheiden. Urin wird dann durch den Harnleiter aus dem Nierenbecken der Niere, die Bladderin einer unidirektionalen Weise transportiert, wo es gespeichert und schließlich über die Harnröhre¹beseitigt.

Die Harnleiter sind gerade Rohre mit Ursprung aus dem nephric Rohr. Nach angehenden aus dem nephric Rohr an embryonalen Tag 10.5 (E10.5) in der Maus, der Harnleiter Stiel verlängert und differenziert in eine mehrschichtige Struktur namens Urothel, die zwischen Maus undurchlässig ist, E12.5 und E16.5. Die mesenchymalen Zellen umgibt den Harnleiter Stiel unterscheiden sich auch in drei Schichten bestehend aus inneren Stromazellen Zellen, zwischen dicken glatten Muskelzellen und äußeren adventitial Fibroblasten. Harnleiter peristaltische Wellen, Einleitung in das Nierenbecken werden vermehrt durch die glatte Muskulatur Schicht der Mauer Harnleiter in die Blase Urin^2,3, transportieren die ab E16.5 in der Maus-¹produziert wird.

Angeborene Fehlbildungen der Nieren und Harnwege (CAKUT) gehören zu den häufigsten Erbkrankheiten, bei rund 1 % der menschlichen Föten^1,4, und setzt sich aus einer Vielzahl von Phänotypen einschließlich Hydronephrose und Hydroureter. Die abnorme Ansammlung von Urin in der Niere und Harnleiter führt Hydronephrotic Nieren- und Hydroureter Bildung. Eine Ursache der Hydronephrose und/oder Hydroureter Formation ist eine Obstruktion der Harnwege. Ureteropelvic Kreuzung Obstruktion (UPJO), verursacht durch aberrante Harnfluss durch eine Blockade zwischen den proximalen Harnleiter und das Nierenbecken, wodurch Hydronephrose und proximale Hydroureter Verengung mit Winkelung oder hartnäckige Falten^{5, 6}. Darüber hinaus wird die ektopische Einfügung von den distalen Harnleiter in die Blasenwand oder die Fortpflanzungsorgane vesikale Kreuzung Obstruktion (UVJO) genannt. UVJO kann auch Hydronephrose und Hydromegaureter Bildung^7,8induzieren. Ein zusätzliche vesikale Kreuzung (UVJ) defekt ist Vesicoureteric Reflux (VUR). VUR zeichnet sich durch retrograde Urin-Flow aus der Blase in Richtung Niere bei UVJ. Im Vergleich zu UVJO, zeigen perinatale Embryonen mit VUR deutlich einen aufgeblähten Hydronephrotic Nieren- oder schweren Hydroureter Phänotyp⁹nicht.

In der Labormaus kann Urin-Flow durch Injektion eines Farbstoffes, wie Methylenblau, in das Nierenbecken⁹untersucht werden. Die Injectedmethylene blaue Lösung wird die Flugbahn der Urin aus dem Nierenbecken durch den Harnleiter und in die Blase verfolgen. Hydronephrose kann durch eine Erweiterung des Farbstoffs in der Niere erkannt werden. UPJO kann als eine Blockade der Farbstoff Strömung an den proximalen Harnleiter mit aufgeblähten Nierenbecken⁵erkannt werden. Dilatation der Harnleiter durch einen aufgeweiteten Durchmesser angegeben zeigt ein Beispiel für Hydroureter. Zu guter Letzt Farbstoff Ansammlung an der Blasenwand oder auf der Website der Fortpflanzungsorgane zeigt UVJO mit aufgeblähten Hydronephrotic Niere und geweitet Hydromegaureter^7,10. Um VUR zu erkennen, die Farbstofflösung in die Blase injiziert und anschließende retrograde wird in der Niere⁹überwacht.

Hier ist ein Protokoll für Methylenblau färben Injektion in das Nierenbecken eines perinatalen Embryos präsentiert. Dieses Protokoll ermöglicht die Rückverfolgung von Urin-Flow aus dem Nierenbecken durch den Harnleiter und in die Blase und prüft mögliche Harnwege Kreuzung Hindernisse wie UPJO oder UVJO.

Protokoll

Mäuse (Wnt5a Flox / Flox Mäuse (Wnt5a ^tm1.1Tpy) und Dll1Cre Linie, UVJO-Maus-Modell) ⁷ wurden nach NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren verwaltet und studierte unter ein Protokoll durch die NCI-Frederick Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Vorbereitung des Methylenblau Farbstofflösung

1. 0,1 g Methylenblau Pulver zu messen.
2. Lösen sich die Methylenblau in 10 mL normale Kochsalzlösung oder 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) vollständig durch vortexen.
3. Filtern die 10 mg/mL Methylenblau-Lösung mit einer Spritze Filter (Membran Porengröße 0.45µm) zu beseitigen, Verstopfungen beim Einspritzen.
4. Montieren einer sterilen Kopfhaut Vene Set (27GX3/4 ″) mit 3 mL Einwegspritze und füllen Sie die Spritze mit 3 mL Methylenblau-Lösung gefiltert.
   Hinweis: Zur Vermeidung von hydrostatischen Druck und nachfolgenden Farbstoff Fluss legen Sie die Spitze der Nadel über die Spritze gefüllt mit Methylenblau-Lösung.

2. Dissektion der pränatalen Embryonen

1. sauber sezieren, Scheren und Pinzetten mit 70 % igem Ethanol.
2. , Perinatale Embryonen im E18.5 oder E19.5, sammeln einschläfern schwangere Mäusen zuerst mit CO ₂ Einatmen und zervikale Dislokation nach NIH-Richtlinien führen.
   Hinweis: Die schwangere weibliche Maus in der Regel gebiert E18.5 ab, jedoch größere Nieren sind leichter zu manipulieren. Daher sind die Nieren im E19.5 näher zur Geburt leichter auf diese Analyse durchzuführen. Aber Welpen mit bilateralen Harnwege Hindernisse sterben nach der Geburt. Abhängig von den Eigenschaften der experimentellen Mäuse, sollte eine entsprechende Sammlung Wochentag/Uhrzeit empirisch ermittelt werden.
3. 70 % igem Ethanol auf der ventralen Bauch-Oberfläche sprühen und öffnen Sie dann die Bauchhöhle mit ventral sezierenden Schere und Zange.
4. Heben die gesamte Gebärmutter und trennen Sie ihn aus dem Körper durch Schneiden mit Präparierscheren an den Spitzen der uterinen Hörner.
5. Spülen die gesamte Gebärmutter mit 1 X PBS in einer Petrischale.
6. Die Gebärmutter segmentartig mit Präparierscheren schneiden und entfernen Sie plazentar Decidua mit sezieren Zange um die Embryonen im Dotter Sacs freizulegen.
7. Der Dottersack erst dann entfernen und die amniotische Membrane mit sezieren Zange um die perinatalen Embryonen zu befreien.
8. Enthaupten einen Embryo mit Präparierscheren. Wischen Sie überschüssiges Blut mit steriler Gaze-Pads. Festnageln des Embryos mit der ventralen Oberfläche bis auf einen sezierenden Mikroskop, ausgestattet mit einer digitalen Kamera für die Bildgebung. Seine Rute für die Genotypisierung zu sammeln, wenn nötig.
   Hinweis: Führen Sie Injektionen ein Embryo zu einem Zeitpunkt.
9. Öffnen Sie vorsichtig die Bauchhöhle des Embryos mit der Pinzette durch Aufreißen der Haut. Dann sorgfältig entfernen Sie überschüssige Organe und Gewebe wie Leber, Magen und Darm mit der Pinzette durch Schneiden oder herausziehen um zu entlarven, die Nieren, die Harnleiter und die Blase, die dorsal befinden ( Abbildung 1A). Absorbieren überschüssiges Blut aus den seziert Embryo mit steriler Gaze-Pads, wenn nötig.
   Hinweis: Überschüssige Blut stört bei der Identifizierung von Nierenbecken für die Injektion von Farbstoff.

3. Injektion von Methylenblau-Dye in das Nierenbecken und Überwachung fließen Dye

1. Entfernen Luftblasen in die Nadel und Schlauch durch Ausweisung Methylenblau-Lösung aus der Nadelspitze durch hydrostatischen Druck. Heben Sie die Spritze mit der Farbstofflösung über dem Niveau der Nadelspitze zu fließen beginnen, und senken Sie dann die Spritze zu unterbrechen.
2. Stechen Sie die Nadel in das Nierenbecken in der Nähe von den proximalen Harnleiter, kümmert sich nicht um ihn einmal stören. Dye Injektion in eine Niere zu bestimmen, Obstruktion der Harnwege führen.
   Hinweis: Führen Sie färben Injektion in jede abnorme Nieren ⁷ ersten folgen die gleiche Weise zu bestimmen, seine Harnwege Obstruktion.
3. Heben die Spritze bis etwa 20 cm hydrostatischen Druck und 15 µL - 60 µL Farbstoff Lösung fließen zu lassen. Die Durchflussmenge wird über 3 µL/s sein, wenn die Spritze zu dieser Höhe oberhalb des Embryos ausgelöst wird.
4. Überwachen die blaue Farbe des Farbstoffs zuerst in das Nierenbecken und dann in der Länge von den Harnleiter und schließlich in die Blase Lumen.
   Hinweis: Es dauert ca. 5 s zu sehen, eine schwache Farbe innerhalb der Blase Lumen entstehen, wenn die Harnleiter in die Blase richtig eingelegt ist. Den Farbstoff der Website blockiert ca. 15 ansammeln lassen s erscheint keine Farbe in die Blase Lumen.
5. Legen Sie die Spritze bis Haltestelle Farbstoff Strömung und ziehen Sie die Nadel aus der Niere.
6. Nehmen Sie Bilder von der Niere, der Harnleiter und der Blase mit Farbstofflösung verfolgt mit der Kamera und imaging-Programm verbunden zu einem Stereomikroskop.
7. Notieren Hydronephrose der Niere, Hydroureter und die endgültige Position der Farbstofflösung in einem Labor Notebook.
8. Perform Injektion der kontralateralen Niere wie beschrieben in Abschnitt 3.1), 3.5) und ermöglichen Farbstoff Fluss etwa 20 s insgesamt.
   Hinweis: Die Blase Lumen wird mit Farbstofflösung, durch eine starke blaue Farbe angezeigt, wenn der Harnleiter in die Blase Lumen richtig eingelegt ist gefüllt werden. Nach Bewertung der Harnwege Kreuzung Obstruktion, die Harnleiter und die Blase für Schnitt fixiert werden können.

Ergebnisse

Die Nieren und unteren Harnwege befinden sich dorsal zu den meisten anderen inneren Organe wie Leber und Darm. Nach dem Entfernen dieser andere innere Organe, sind ein paar Nieren und Harnleiter und einer einzelnen Blase sichtbar (Abb. 1A). Auf erfolgreiche Dissektion fließt der Farbstoff injiziert das Nierenbecken in die Blase über den Harnleiter von der Niere. Das Nierenbecken ist der trichterartige dilatative proximalen Teil der Harnleiter in die Niere. ...

Diskussion

Maus-Nieren sind funktionale Beginn E16.5 und ein Farbstoff-Injektion-Test ist ab diesem Zeitpunkt theoretisch möglich. Jedoch die Niere ist zu klein, um mit der Farbstofflösung injiziert werden und Phänotypen wie Hydronephrose und Hydroureter sind nicht eindeutig beobachtet, da diese Phänotypen als Nebeneffekt des Urins durch abnorme Urin Transport aufgebaut sind. Diese Phänotypen von Hindernissen wie UPJO oder UVJO, sind offensichtlich am E18.5 durch aufgeblähten Nieren und Harnleiter. Größere Nieren von Embryo...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML	Fisherscientific	50-983-204
3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip	BD	309657
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane	Pall corporation	4614
Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12"	EXELINT	26709
Delicate Operating Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6702
Micro Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5135
Dumont Tweezers; Pattern #5	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5045
BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2"	BD	305106