Avaliar defeitos de obstrução do trato urinário junção por injeção de corante azul de metileno

Resumo

Injeção de corante azul de metileno em pelve renal facilita a avaliação de defeitos de obstrução do trato urinário junção durante o desenvolvimento embrionário do trato urinário de rato. Aqui, um protocolo para injeção de corante azul de metileno na pelve renal é descrito.

Resumo

Defeitos de obstrução do trato urinário junção são anomalias congênitas induzindo hidronefrose e hidroureter. Defeitos de obstrução urinária murino junção podem ser avaliados pelo controle de fluxo do corante azul de metileno dentro do sistema urinário. Corante azul de metileno é injetado em pelve renal dos rins embrionários perinatais e fluxo do corante é monitorado da pelve renal do rim através do ureter e para dentro do lúmen da bexiga após a aplicação de pressão hidrostática. Acumulação de tintura será evidente no lúmen do tracto urinário perinatal normal da bexiga, mas vai ser restrita entre a pelve renal e o ponto final de um ureter anormal, se ocorrerem obstruções do trato urinário. Esse método facilita a visualização de hidronefrose e hidroureter e a confirmação da obstrução de junção do trato urinário. Este manuscrito descreve um protocolo para injeção de corante azul de metileno na pelve renal para confirmar obstruções de junção do trato urinário.

Introdução

O sistema urinário consiste de um par de rins e ureteres e um comum da bexiga e uretra. A principal função do sistema urinário é manter a homeostase do corpo gerindo o equilíbrio de água e eletrólitos do sangue. Os rins filtram o sangue para controle concentrações de eletrólitos e equilíbrio ácido-base e produzem urina para excretar o excesso de água e resíduos, incluindo solutos e metabólitos. Urina é então transportada através do ureter da pelve renal do rim para o bladderin de uma maneira unidirecional, onde é armazenado e, finalmente, eliminada através da uretra¹.

Os ureteres são tubos retos, proveniente do ducto nephric. Após a brotação do ducto nephric em dia embrionário 10.5 (E10.5) no mouse, o caule do uréter alonga e diferencia em uma estrutura de várias camada chamada Urotélio, que é impermeável entre rato, E12.5 e E16.5. As células mesenquimais em torno do caule de ureter também são diferenciadas em três camadas consistindo de células do estroma internas, células de músculo liso grosso e intermediário e fibroblastos adventícia exteriores. Ondas peristálticas ureterais iniciando na pelve renal são propagadas através da camada de músculo liso da parede da uretra à bexiga para transportar urina^2,3, que é produzido começando em E16.5 no rato¹.

Anomalias congênitas do rim e trato urinário (CAKUT) estão entre as mais frequentes doenças genéticas, presentes em cerca de 1% dos fetos humanos^1,4e composto por uma variedade de fenótipos incluindo hidronefrose e hidroureter. O acúmulo anormal de urina nos resultados da rim e do ureter no rim e hidroureter formação de hydronephrotic. Uma das causas da formação de hidronefrose e/ou hidroureter é uma obstrução do tracto urinário. Obstrução de junção de ureteric (UPJO) é causada pelo fluxo de urina aberrante, devido a um bloqueio entre o ureter proximal e a pelve renal, resultando em hidronefrose e hidroureter proximal estreitando com angulação ou dobramento persistente^{5, 6}. Além disso, a inserção ectópica do ureter distal na parede da bexiga ou do trato reprodutivo é chamada ureter obstrução de junção (UVJO). UVJO também pode induzir a hidronefrose e hydromegaureter formação^7,8. Defeito de junção (como) um ureter adicional é refluxo vesicoureteral (RVU). VUR é caracterizada pelo fluxo retrógrado de urina da bexiga para o rim em como. Em comparação com UVJO, perinatais embriões com RVU não distintamente mostra um rim distendido hydronephrotic ou grave hidroureter fenótipo⁹.

No rato de laboratório, o fluxo de urina pode ser examinado por injeção de um corante, tais como o azul de metileno, para a pelve renal⁹. A solução de azul de injectedmethylene irá traçar a trajetória de urina da pelve renal, através da uretra e na bexiga. Hidronefrose pode ser reconhecido por uma expansão do corante no rim. UPJO pode ser detectado como uma obstrução do fluxo do corante para o ureter proximal com distendido pelve renal⁵. Qualquer dilatação do ureter indicado por um diâmetro ampliado demonstra um exemplo de hidroureter. Finalmente, acúmulo de tinta na parede da bexiga ou no site do tracto reprodutivo indica UVJO com rim hydronephrotic distendido e dilatada hydromegaureter^7,10. Para detectar o RVU, a solução corante é injectada na bexiga e subsequente fluxo retrógrado é monitorado na renal⁹.

Aqui, um protocolo para injeção de corante azul de metileno em pelve renal de um embrião perinatal é apresentado. Este protocolo permite o rastreamento do fluxo de urina da pelve renal, através da uretra e na bexiga e verifica possíveis obstruções de junção do trato urinário como UPJO ou UVJO.

Protocolo

ratos (Wnt5a flox / ratos flox (Wnt5a ^tm1.1Tpy) e Dll1Cre linha, modelo de mouse UVJO) ⁷ eram geridas de acordo com as diretrizes do NIH para o cuidado e o uso de animais de laboratório e estudado sob um protocolo aprovado pelo Comitê de uso e cuidado do Animal de NCI-Frederick.

1. preparação da solução de corante azul de metileno

1. medir pó de azul de metileno 0,1 g.
2. Dissolver o azul de metileno em solução salina normal de 10 mL ou 1 x salina tamponada fosfato (PBS) completamente vortexing.
3. A 10 mg/mL solução de azul de metileno de filtragem com um filtro de seringa (tamanho dos poros da membrana 0.45µm) para eliminar a obstrução durante a injeção.
4. Montar um escalpe estéril veia conjunto (27GX3/4 ″) com uma seringa descartável de 3 mL e encha a seringa com 3ml filtrado solução de azul de metileno.
   Nota: Para evitar a pressão hidrostática e fluxo subsequente tintura, coloque a ponta da agulha acima a seringa preenchida com solução de azul de metileno.

2. Dissecação de pré-natal de embriões

1. limpo, dissecando a tesoura e pinça com etanol a 70%.
2. Para coletar embriões perinatais em E18.5 ou E19.5, eutanásia de ratos grávidas primeiro usando a inalação de CO ₂ e então executar o deslocamento cervical de acordo com as diretrizes do NIH.
   Nota: O rato fêmea grávido geralmente dá à luz partida no E18.5, no entanto, os rins maiores são mais fáceis de manipular. Portanto, os rins em E19.5 perto de nascimento são mais fáceis de realizar esta análise em. No entanto, filhotes com bilateral do trato urinário obstruções morre após o nascimento. Dependendo das características dos ratos experimentais, uma dia e hora de recolha deve ser determinada empiricamente.
3. Spray etanol a 70% na superfície ventral abdominal e então abrir a cavidade abdominal ventralmente usando dissecação tesoura e pinça.
4. Levantar o útero inteiro e separá-lo do corpo cortando com tesoura nas pontas dos cornos uterinos de dissecação.
5. Lavar o útero todo com PBS 1x em uma placa de Petri.
6. Corte o útero desenvolve com tesoura de dissecação e retire da placenta decídua com dissecando o fórceps para expor os embriões em gema sacs.
7. Primeiro remover o saco vitelino e remova a membrana amniótica com dissecando o fórceps para libertar os embriões perinatais.
8. Decapitar um embrião com tesoura de dissecação. Limpe o excesso de sangue com gaze estéril. Levanta o embrião para baixo com sua superfície ventral na dissecação microscópio equipado com uma câmera digital para a imagem latente. Recolher a sua cauda para a genotipagem, se necessário.
   Nota: Executar um embrião de injeções de cada vez.
9. Abra cuidadosamente a cavidade abdominal de um embrião com fórceps, rasgando a pele. Em seguida, remover cuidadosamente o excesso órgãos e tecidos como fígado, estômago e intestino com fórceps cortá-los ou puxá-los para fora para expor os rins, os ureteres e a bexiga, que está localizado dorsalmente ( figura 1A). Absorver o excesso de sangue do embrião dissecado com gaze estéril, se necessário.
   Nota: Sangue excesso interfere com a identificação da pelve renal para a injeção do corante.

3. Injeção de corante azul de metileno na pelve Renal e monitorando o fluxo de tintura

1. remover bolhas na agulha e tubulação, expulsando a solução de azul de metileno da ponta de agulha por pressão hidrostática. Levantar a seringa contendo a solução de tintura acima do nível da ponta da agulha para iniciar o fluxo e em seguida baixar a seringa para parar o fluxo.
2. Insira a agulha na pelve renal perto do ureter proximal, tomando cuidado para não perturbá-lo depois de colocado. Realizar injeção de corante em um rim para determinar sua obstrução do tracto urinário.
   Nota: Executar tingir a injeção em qualquer anormal do rim ⁷ primeiro, seguindo a mesma maneira para determinar sua obstrução do tracto urinário.
3. Levantar a seringa até cerca de 20 cm para fornecer a pressão hidrostática e deixe 15 µ l - 60 µ l do fluxo de solução corante. A taxa de fluxo será cerca de 3 µ l/s, se a seringa é gerada para esta altura acima do embrião.
4. Monitor a cor azul do corante começando primeiro na pelve renal e, em seguida, no comprimento do ureter e finalmente no lúmen da bexiga.
   Nota: Demora cerca de 5 s para ver uma cor de tintura fraca emergem dentro do lúmen da bexiga se o ureter está correctamente inserido na bexiga. Permitir que a tintura a acumular-se no site bloqueado cerca de 15 s se nenhuma cor corante aparece no lúmen da bexiga.
5. Coloque a seringa fluxo a tintura pare e retire a agulha do rim.
6. Tomar imagens do rim, ureter e bexiga rastreados com solução corante usando a câmera e imagem programa conectem a um estereomicroscópio.
7. Fazer um registro de hidronefrose do rim, hidroureter e a posição final da solução corante em um caderno de anotações.
8. Realizar injeção do rim contralateral conforme descrito nas seções 3.1) para 3.5) e permitir o fluxo de tinta cerca de 20 s total.
   Nota: O lúmen da bexiga será preenchido com solução corante, indicada por uma cor azul forte, se o ureter está correctamente inserido o lúmen da bexiga. Após a avaliação da obstrução de junção do tracto urinário, os ureteres e a bexiga podem ser corrigidos para secionar.

Resultados

Rins e sistema urinário inferior estão localizados dorsal à maioria dos outros órgãos internos como o fígado e intestino. Depois de remover esses outros órgãos internos, um par de rins e ureteres e bexiga única são visíveis (figura 1A). Após dissecação bem sucedida, o corante injetado em pelve renal fluirá do rim para a bexiga através da uretra. A pelve renal é a funil-como dilatada porção proximal do ureter no rim. Portanto, o ponto de inj...

Discussão

Rins de mouse são funcional início em E16.5 e um teste de injeção de corante é teoricamente possível deste ponto do tempo. No entanto, o rim é muito pequeno para ser injetado com a solução de corante e fenótipos como hidronefrose e hidroureter não são claramente observados desde que estes fenótipos são um efeito secundário da urina acumulada devido ao transporte de urina anormal. Estes fenótipos, desde as obstruções, como UPJO ou UVJO, são evidentes no E18.5 por distendido rins e ureteres. Maiores rins...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML	Fisherscientific	50-983-204
3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip	BD	309657
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane	Pall corporation	4614
Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12"	EXELINT	26709
Delicate Operating Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6702
Micro Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5135
Dumont Tweezers; Pattern #5	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5045
BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2"	BD	305106