Evaluación defectos de obstrucción urinaria cruce por la inyección de tinte de azul de metileno

Resumen

Inyección de colorante azul de metileno en la pelvis renal facilita la evaluación de los defectos de obstrucción urinaria cruce durante el desarrollo embrionario las vías urinarias del ratón. Aquí, se describe un protocolo para la inyección de colorante azul de metileno en la pelvis renal.

Resumen

Defectos de la obstrucción urinaria cruce son anomalías congénitas inducción de hidronefrosis e Hidrouréter. Defectos de obstrucción urinaria murino cruce pueden evaluarse mediante el seguimiento flujo de tinte de azul de metileno dentro del sistema urinario. Se inyecta azul de metileno en la pelvis renal de riñones embrionarios perinatales y flujo del tinte es monitoreado desde la pelvis renal del riñón por el uréter y en el lumen de la vejiga después de aplicar presión hidrostática. Acumulación de tinte será evidente en el lumen de la vejiga del tracto urinario perinatal normal, pero será limitada entre la pelvis renal y el punto final de un uréter anormal, si se producen obstrucciones del tracto urinario. Este método facilita la confirmación de obstrucción de vías urinarias cruce y visualización del hydronephrosis y del hydroureter. Este manuscrito describe un protocolo para la inyección de tinte de azul de metileno en la pelvis renal para confirmar obstrucciones de cruce de las vías urinarias.

Introducción

El sistema urinario consiste en un par de riñones y uréteres comunes vejiga y uretra. La función principal del sistema urinario es mantener la homeostasis del cuerpo al administrar el equilibrio de agua y electrolitos de la sangre. Los riñones filtran la sangre para control las concentraciones de electrolitos y equilibrio acido-base y producen orina para excretar el exceso de agua y residuos incluidos los solutos y metabolitos. Orina es transportada a través del uréter de la pelvis renal del riñón a la bladderin una manera unidireccional donde se almacenan y finalmente eliminado a través de la uretra¹.

Los uréteres son tubos rectos que se origina en el conducto nephric. Después de la brotación del conducto nephric en el día embrionario 10.5 (E10.5) en el ratón, el tallo del uréter se alarga y distingue a una estructura de varias capas llamada urotelio que es impermeable entre ratón E12.5 y E16.5. Las células mesenquimales que rodea el tallo del uréter también se diferencian en tres capas que consiste de internas células del estroma, células de grosor intermedio del músculo liso y fibroblastos adventitial externos. Se propagan las ondas peristálticas ureterales iniciando en la pelvis renal a través de la capa de músculo liso de la pared del uréter a la vejiga para el transporte de orina^2,3, que se produce a partir de E16.5 en el ratón¹.

Anomalías congénitas del riñón y vías urinarias (CAKUT) se encuentran entre las enfermedades genéticas más frecuentes, presentes en aproximadamente el 1% de fetos humanos^1,4y compuesto de una variedad de fenotipos como hidronefrosis e Hidrouréter. La acumulación anormal de orina en el riñón y del uréter produce hydronephrotic del riñón e Hidrouréter formación. Una causa de hidronefrosis o Hidrouréter formación es una obstrucción de las vías urinarias. Obstrucción de la UUP (UPJO) es causada por el flujo de orina aberrantes debido a una obstrucción entre el uréter proximal y la pelvis renal, dando por resultado hydronephrosis y estrechamiento proximal Hidrouréter con forma angular o persistente plegable^{5, 6}. Además, la inserción ectópica del uréter distal en la pared de la vejiga o el tracto reproductivo se denomina obstrucción ureterovesical (UVJO). UVJO también puede inducir la hidronefrosis y hydromegaureter de^7,de formación⁸. Un defecto de unión (UVJ) ureterovesical adicional es el reflujo vesicoureteral (RVU). VUR se caracteriza por flujo retrógrado de orina desde la vejiga hacia el riñón en UVJ. En comparación con UVJO, perinatales embriones con RVU no claramente muestran un riñón hydronephrotic dilatado o Hidrouréter severa fenotipo⁹.

En el ratón de laboratorio, flujo de orina puede ser examinado por la inyección de un colorante, como azul de metileno, en la pelvis renal⁹. La solución de azul de injectedmethylene traza la trayectoria de la orina desde la pelvis renal a través del uréter y la vejiga. La hidronefrosis puede ser reconocida por una expansión del tinte en el riñón. UPJO puede ser detectado como una obstrucción del flujo del tinte en el uréter proximal con pelvis renal dilatada⁵. Cualquier dilatación del uréter indicada un diámetro ensanchado muestra un ejemplo de Hidrouréter. Finalmente, acumulación de tinte en la pared de la vejiga o en el sitio del tracto reproductivo indica UVJO con riñón hydronephrotic distendido y dilatado hydromegaureter^7,10. Para detectar el RVU, la solución de tinte se inyecta en la vejiga y el posterior flujo retrógrado es monitoreado en el riñón⁹.

Aquí, se presenta un protocolo para la inyección de tinte de azul de metileno en la pelvis renal de un embrión perinatal. Este protocolo permite el rastreo de flujo de la orina desde la pelvis renal a través del uréter y la vejiga y verifica posibles obstrucciones de cruce vías urinarias tales como UPJO o UVJO.

Protocolo

ratones (Wnt5a flox / flox ratones (Wnt5a ^tm1.1Tpy) y la línea Dll1Cre, modelo UVJO) ⁷ fueron manejados según pautas de NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y estudió con un protocolo aprobado por el NCI Frederick Animal cuidado y uso.

1. preparación de la solución de colorante azul de metileno

1. medir 0,1 g de azul de metileno en polvo.
2. Disolver el azul de metileno en solución salina normal 10 mL o 1 x de tampón fosfato salino (PBS) completamente por Vortex.
3. Filtro con un filtro de jeringa (tamaño del poro de la membrana 0.45µm) para eliminar la obstrucción durante la inyección de la solución de azul de metileno 10 mg/mL.
4. Montar un estéril cuero cabelludo vena set (27GX3/4 ″) con una jeringa desechable de 3 mL y llene la jeringa con 3 mL filtrada azul de metileno solución.
   Nota: Para evitar la presión hidrostática y el tinte posterior flujo, coloque la punta de la aguja sobre la jeringa llenada de solución de azul de metileno.

2. Disección de embriones prenatales

1. limpio de disección, tijeras y pinzas con etanol al 70%.
2. Para recolectar embriones perinatales en E18.5 o E19.5, eutanasia ratones embarazadas primero mediante inhalación de CO ₂ y llevar a cabo la dislocación cervical según las pautas de NIH.
   Nota: El ratón hembra embarazado generalmente da nacimiento partida en E18.5, sin embargo, los riñones más grandes son más fáciles de manipular. Por lo tanto, son más fáciles de realizar este análisis en riñones en E19.5 más cercano al nacimiento. Sin embargo, cachorros con troquel de obstrucciones urinarias bilateral después del nacimiento. Dependiendo de las características de los ratones experimentales, un día/hora de recogida apropiado debe determinarse empíricamente.
3. Rociar etanol al 70% en la superficie ventral abdominal y luego abrir la cavidad abdominal ventral mediante disección tijeras y fórceps.
4. Levantar el útero entero y separado del cuerpo cortando con tijeras en las puntas de los cuernos uterinos de disección.
5. Lavar el útero entero con PBS 1 x en una placa Petri.
6. Cortar el útero segmentally con tijeras de disección y retirar decidua placentaria con disección pinzas para exponer los embriones en sacos vitelinos.
7. Primero retire el saco vitelino y después retire la membrana amniótica con fórceps para liberar los embriones perinatales de disección.
8. Decapitar a un embrión con tijeras de disección. Limpie el exceso de sangre con gasas estériles. Precisar el embrión con su superficie ventral hacia arriba en un microscopio de disección equipado con una cámara digital para la proyección de imagen. Recoger la cola para genotipificación si es necesario.
   Nota: Realizar un embrión las inyecciones a la vez.
9. Abra cuidadosamente la cavidad abdominal del embrión con pinzas por el desgarramiento de la piel. Entonces, Remueva cuidadosamente el exceso órganos y tejidos como el hígado, el estómago y el intestino con fórceps por cortarlos o tirando de los mismos para exponer los riñones, los uréteres y la vejiga que se encuentran dorsalmente ( figura 1A). Absorber el exceso de sangre de embrión disecado con gasas estériles si fuera necesario.
   Nota: Sangre exceso interfiere con la identificación de la pelvis renal para la inyección del tinte.

3. Inyección de colorante azul de metileno en la Pelvis Renal y el control de flujo de tinte

1. quitar burbujas en la aguja y el tubo por expulsión de solución de azul de metileno de la punta de la aguja de presión hidrostática. Levantar la jeringa que contiene la solución de colorante por encima del nivel de la punta de la aguja para iniciar el flujo y luego baje la jeringa para detener flujo.
2. Insertar la aguja en la pelvis renal cerca de uréter proximal, procurando no para lo una vez colocado molestar a. Realizar la inyección de colorante en un riñón para determinar la obstrucción del tracto urinario.
   Nota: Ejecutar el tinte inyección en cualquier renal anormal ⁷ primera siguiendo la misma forma para determinar la obstrucción del tracto urinario.
3. Levante la jeringa hasta unos 20 cm para proporcionar presión hidrostática y dejar 15 μl - 60 μL del flujo de la solución colorante. La tasa de flujo será aproximadamente 3 μl/s si la jeringa se eleva a esta altura el embrión.
4. Monitorear el color azul del colorante a partir de primero en la pelvis renal, entonces en la longitud del uréter y finalmente en el lumen de la vejiga.
   Nota: Tarda cerca de 5 s para ver un color de tinte débiles emergen dentro del lumen de la vejiga si el uréter se inserta correctamente en la vejiga. Permitir que el tinte que se acumulan en el sitio bloqueado cerca de 15 s si no hay color de tinte en el lumen de la vejiga aparece.
5. Coloque la jeringa hasta la parada de tinte flujo y retire la aguja del riñón.
6. Tomar imágenes de los riñones, el uréter y la vejiga trazado con solución colorante usando la cámara y programa la proyección de imagen conectan a un estereomicroscopio.
7. Hacer un registro de hidronefrosis del riñón, hydroureter y la posición final de la solución de colorante en un cuaderno de laboratorio.
8. Realizar la inyección del riñón contralateral como se describe en las secciones 3.1) a 3.5) y permitir el flujo del tinte cerca de 20 s en total.
   Nota: La luz de la vejiga se llenará con solución colorante, indicado por un color azul fuerte, si el uréter se inserta adecuadamente en el lumen de la vejiga. Después de la evaluación de obstrucción de la Unión de las vías urinarias, los uréteres y la vejiga pueden ser fijados para seccionamiento.

Resultados

Los riñones y sistema urinario inferior se encuentran dorsal a la mayoría de los otros órganos internos como el hígado y el intestino. Después de quitar estos otros órganos internos, un par de riñones y los uréteres y la vejiga de una sola son visibles (figura 1A). Sobre disección exitosa, fluirá el colorante inyectado en la pelvis renal del riñón en la vejiga vía el uréter. La pelvis renal es la forma de embudo parte proximal dilatada del urét...

Discusión

Riñones de ratón son funcionales a partir de las E16.5 y una prueba de inyección de tinte es teóricamente posible a partir de este momento. Sin embargo, el riñón es demasiado pequeño para ser inyectada con la solución de tinte y fenotipos como hidronefrosis Hidrouréter no se observan claramente puesto que estos fenotipos son un efecto secundario de orina acumulado debido al transporte anormal de la orina. Estos fenotipos, de los obstáculos como UPJO o UVJO, son evidentes en E18.5 por distensión de los riñones...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML	Fisherscientific	50-983-204
3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip	BD	309657
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane	Pall corporation	4614
Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12"	EXELINT	26709
Delicate Operating Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6702
Micro Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5135
Dumont Tweezers; Pattern #5	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5045
BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2"	BD	305106