متعدد الوسائط التصوير النهج استناداً إلى التصوير المقطعي الجزيئية الصغيرة-الأشعة المقطعية والأسفار لتقييم طولية لتليف الرئة الناجمة عن بليوميسين في الفئران

Summary

يصف لنا النقل المتعدد الوسائط غير الغازية التصوير النهج القائم على التصوير المقطعي الجزيئية الصغيرة-الأشعة المقطعية والأسفار لتقييم طولية من طراز تليف الرئة الماوس الناجم عن تقطير إعطاء مزدوجة من بليوميسين.

Abstract

تليف رئوي مجهول السبب (IPF) هو مرض الرئة قاتلة تتميز بتدمير بنية الرئة، مما يسبب تدهورا كبيرا في وظائف الرئة والوفاة اللاحقة من فشل في الجهاز التنفسي تدريجيا ولا رجعة فيها.

وقد حملت الآلية المرضية للفريق الحكومي الدولي في نماذج حيوانية تجريبية بليوميسين الإدارة. في هذه الدراسة، ونحن التحقيق طراز ماوس مثل الفريق الحكومي الدولي الناجم عن تقطير بليوميسين إعطاء مزدوجة. تقييمات النسيجي القياسية المستخدمة لدراسة تليف الرئة إجراءات المحطة الغازية. والهدف من هذا العمل رصد تليف الرئة عن طريق موسع تقنيات التصوير مثل التصوير المقطعي الجزيئية الفلورسنت (FMT) والصغرى-قيراط يمكن أن تمثل هذه التقنيات اثنين التحقق من صحتها مع النتائج التي توصل إليها علم الأنسجة ثورية وظيفية لرصد الوقت الحقيقي غير الغازية من شدة المرض الحكومي والتقدم. الدمج بين نهج مختلفة تمثل خطوة أخرى لفهم هذا المرض الحكومي، حيث يمكن ملاحظة الأحداث الجزيئية التي تحدث في حالة مرضية مع معاهدة المواد الانشطارية، ويمكن رصد التغيرات التشريحية اللاحقة بالدقيقة-قيراط

Introduction

تليف رئوي مجهول السبب (IPF) مرض الرئة المزمن مع الانخفاض التدريجي لوظائف الرئة التي للأسف غالباً ما تكون قاتلة في غضون أربع سنوات من تشخيص¹. السمات الرئيسية لمقترحات ترسب المصفوفة خارج الخلية، وانتشار تنتجها الخلايا الليفية، ولكن الآلية المرضية غير مفهومة تماما حتى الآن. الفرضية الأكثر المعتمدة هو أن دورات متعددة لإصابات الرئة يسبب تدمير الخلايا الظهارية السنخية تؤدي إلى تغيير انتشار دورة الخلية الوسيطة، وتراكم مبالغ فيها الخلايا الليفية وميوفيبروبلاستس، و مصفوفة زيادة الإنتاج. الوسطاء المتورطين في هذه العمليات مثل مصفوفة ميتالوبروتيناسيس (يتولى) وقد تم العثور على dysregulated في التليف التنمية البشرية الحكومي أو في النماذج الحيوانية المستحثة بليوميسين. إنتاج نظام التمثيل التناسبي المختلط غير المنضبط يؤدي إلى ترسيب الكولاجين غير متوازن داخل الرئة إينتيرستيتيوم والفضاء السنخية، محاكاة الجرح غير طبيعي إصلاح^1،2.

واحدة من العقبات الرئيسية لاكتشاف المخدرات والتنمية هو توافر نماذج الماوس موجوداً التي تحاكي البشرية المرضية والنمط الظاهري المرض. عوامل مختلفة قد استخدمت للحث على تليف الرئة في نماذج حيوانية: أضرار الإشعاع، وإدارة الأسبستوس ووالسليكا، الإدارة من السيتوكينات فيبرينوجينيك و^3،بليوميسين⁴؛ لكن بليوميسين الأكثر استخداماً في الفئران، خنازير غينيا، الهامستر، الأرانب⁵ الجرذان، أو في الحيوانات الكبيرة (الرئيسيات غير البشرية والخيول والكلاب والحيوانات المجترة)^6،7. هو مضاد حيوي أدلى به بكتيريا فيرتيسيلوس متسلسلة⁸ بليوميسين ويستخدم ك عامل مضاد لسرطان⁹. التليف الرئوي أحد آثار الجانبية شائعة للدواء ولهذا السبب، ويتم استخدامه في نماذج حيوانية تجريبية للحث على التليف الرئوي.

في نماذج تليف الرئة الناجمة عن بليوميسين، تحدث الآفات تليفية بعد الإدارة بليوميسين 14-21 يوما. في الأعمال المعروضة، استخدمنا بروتوكولا جديداً لحمل تليف الرئة في الفئران بتقطير إعطاء بليوميسين مزدوجة. الطراز الماوس بليوميسين هو وقتاً طويلاً جداً للعقاقير الجديدة بحاجة إلى تقييم على آفات تليفية الراسخة، واختبار للتمييز بين آثارها تليفية المضادة الآثار المضادة للالتهابات.

البيوكيميائية تحديد محتوى الكولاجين، مورفوميتريكال والتحليل النسيجي استندت إلى تحليل ما بعد الوفاة، يحد من إمكانية متابعة الآلية المرضية لهذا المرض في الحيوان نفسه. على الرغم من أن تعتبر هذه البارامترات معيار الذهب لتقييم التليف، أنها لم تقدم أي التوزيع المكاني أو الزماني للآفة تليفية ويحول دون وسيلة للتحقيق في عملية تطور المرض. ¹⁰

في الآونة الأخيرة، قد طبقت تقنيات التصوير غير الغازية لمراقبة إعادة عرض مجرى الهواء، والتهاب، وتقدم التليف في نماذج مورين: "التصوير بالرنين المغناطيسي" (التصوير بالرنين المغناطيسي)، والتصوير المقطعي بالكمبيوتر الصغير (الصغرى-CT)، Fluorescence الجزيئية التصوير المقطعي (FMT) وطرحه (BLI)^11،،من^{1213،14،15،16،،}من^{1718،19 ،،}من²⁰²¹. أننا نقترح نهجاً تصوير غير الغازية لرصد التقدم تليف الرئة بمعاهدة المواد الانشطارية والصغرى-CT في نقاط زمنية مختلفة بعد تحدي بليوميسين²²طوليا.

مسارات عديدة تشارك في إنشاء وتطوير التليف، ولا يعرف الكثير. يمكن ترجمة فقط إلى فهم أعمق لهذه العمليات إلى المزيد من الأهداف المخدرات التي قد نقل إلى المستشفى. القدرة على رصد تفعيل نظام التمثيل التناسبي المختلط طوليا بالتصوير المقطعي الجزيئية الأسفار بالإضافة إلى الكشف عن التغييرات متني الرئة بالأشعة المقطعية الصغرى قد تستعمل في المستقبل الوصول إلى الاستجابة السريرية للمعالجة.

Protocol

جميع التجارب على الحيوانات المبينة في هذا التقرير قد وافقت لجنة الرفق بالحيوان داخلية للتجارب الحيوانية فارماسيوتيسي كايسي وايراسموس مولودية تحت رقم البروتوكول: EMC 3349 (138-14-07) الامتثال "رق" 63/2010 التوجيه الأوروبي، أقر الإيطالية 26/2014 و "دليل لرعاية واستخدام لمختبر الحيوانات" المنقحة²³.

ملاحظة: قبل الاستخدام، الإناث من الفئران C57Bl/6 (7-8 أسابيع من العمر) الفطرية كانت أقلمة لمدة 7 أيام على الأقل للظروف المحلية فيفاريوم (درجة حرارة الغرفة: 20-24 درجة مئوية؛ والرطوبة النسبية: 40-70%؛ ودورة الضوء الظلام 12-ح)، إمكانية الوصول مجاناً إلى تشو القوارض القياسية و خففت من ماء الصنبور.

1-إعطاء معاملة الفئران مع بليوميسين

1. إعداد المعدات لتقطير داخل الرغامى^12،،من¹³¹⁴.
2. وضعت الفئران في قاعة مخدر متصلاً المبخر isoflurane المحددة في 2.5% مختلطة مع الأكسجين. التحقق من وجود عمق التخدير بسبب عدم استجابة قرصه أخمص القدمين. حدث تأثير التخدير بعد 3-5 دقائق.
3. ضع الماوس أنيسثيتيزيد على منصة تنبيب، معلقة عليه بالقواطع وضعها على السلك.
4. تشغيل المنظار وأخذ زوج من كليلة الملقط المنتهية واستخدام أما الملقط أو تلميح بالمنظار لفتح الفم بلطف.
5. سحب اللسان والاحتفاظ بها إلى الجانب مع الملقط. ضع شفرة المنظار نحو الجزء الخلفي الفم حتى يتم تصور فتح القصبة الهوائية والاحتفاظ المنظار في المكان.
6. ناحية أخرى، مع إدراج إيصال أنبوب متصل بنهاية الأنبوب PE إلى القصبة الهوائية، تناوب صمام ثلاثي. تسليم 50 ميليلتر من بليوميسين (0.020 ميكروغرام/الماوس). بعد تقطير، بسرعة إزالة الأنبوب من القصبة الهوائية لمنع الاختناق. عقد الفئران تستقيم لبضع ثوان.
   1. إدارة إينتراتراتشيلي بليوميسين في اليوم 0 وكرر في يوم 4 (الشكل 1).
7. إزالة الماوس من منصة تنبيب ورصد الماوس لمدة 30 دقيقة (الوقت اللازم للتعافي تماما من التخدير).
8. أداء في فيفو تصوير الرئتين الفئران بمعاهدة المواد الانشطارية والصغرى-CT بعد تقطير بليوميسين مزدوجة في اليوم 7 و 14 و 21.

2-التصوير في فيفو بواسطة "التصوير المقطعي Fluorescence الجزيئية"

ملاحظة: تعد مسبقاً، حل أسهم طازجة نمول 6/مل من MMP الحساسة الفلورسنت الركازة 680 في المحلول الملحي (كلوريد الصوديوم 0.9%)، وتخزين محمية من الضوء في 4 درجات مئوية قبل الاستخدام. أنها مستقرة لمدة تصل إلى 6 أشهر في 4 درجات مئوية. يسمح نظام التمثيل التناسبي المختلط التصوير عامل حجته إلى درجة حرارة الغرفة قبل الحقن في الحيوانات.

1. حقن مسبار
   1. إعداد معدات الحقن الوريدي من الحل مسبار MMP. قبل حرارة المياه عند 50 درجة مئوية لتسخين ذيل الماوس.
   2. أمسك قوة القفا الماوس، اعتبر من ذيله والسماح لها بقبضة غطاء القفص. عقد الفئران عبر الكتفين الحيوان، وضع الذيل في كوب ماء دافئ، 4 كحد أقصى 8 s الضرر الحراري لمنع الإصابة الحرارية للجلد الذيل.  فحص الأوردة تورم للتصور أسهل وغرز الإبرة.
   3. أثناء إجراء الحقن، وضع الفئران في ريسترينير بلاستيكية لإبقائه المطرد وسحب الذيل من خلال فتحه خاصة في الظهر. إيجاد الأوردة والذيلية اثنين على جانبي الذيل؛ لا الشريان في الجانب السفلي الذيل.
   4. إدراج الإبرة (26 ز) من المحاقن 1 مل في هذا السياق. إذا تم وضع الإبرة بشكل صحيح، يكون سهلاً على حقن والحل المسبار سوف يتدفق إلى السفينة.
   5. حقن الحل مسبار MMP 10 مل/كجم.
   6. تجاهل الإبرة.
      ملاحظة: نقطة وقت التصوير الأمثل ح 24 بعد حقن مسبار نظام التمثيل التناسبي المختلط لأنه الوقت المطلوب بالتحقيق لتفعيلها. إذا كان يتم إجراء الدراسات الطولية، الوقت الأمثل إعادة حقن 7 أيام، الذي يسمح بإزالة كاملة للوكيل من الماوس.
2. تصوير معاهدة المواد الانشطارية
   ملاحظة: قبل البدء، دائماً إزالة الفراء في وحول مناطق الحيوان تصويرها، في هذه الحالة الصدر، لتجنب تشتت وامتصاص في الأنسجة.
   1. لتخدير الماوس ووضعه في غرفة التخدير وتحويل الطلب isoflurane إلى 2.5 في المائة لتحريض و 2% للصيانة.
   2. تهيئة البيانات اقتناء البرمجيات وفتح دراسة جديدة في قاعدة البيانات للتجربة.
   3. قبل البدء التصوير مع معاهدة المواد الانشطارية، نقل الماوس إلى كاسيت التصوير. ضع الماوس أنيسثيتيزيد في منتصف التصوير كاسيت استخدامها على النحو الأمثل في مجال الرؤية لمعاهدة المواد الانشطارية. تبقى الفئران مسطحة وآمنة ومضغوط بلطف ضد كل من ويندوز للكاسيت التصوير. ضبط الارتفاع بالمقابض على الكاسيت ومن ثم أدخلها في محطة الإرساء.
   4. انقر فوق حول هذا الموضوع في إطار المسح الضوئي، وانقر فوق معاينة لرؤية الصورة الحية.
   5. رسم منطقة المسح كبيرة بما فيه الكفاية حتى أن يتم التقاطها الأنسجة المحيطة بالمنطقة المتوقعة للأسفار. بما في ذلك ما مجموعة 25 مسح نقاط الضمانات ستكون منطقة الرئة الممسوحة ضوئياً تماما.
   6. حالما يتم رسم العائد على الاستثمار، أولاً انقر فوق إضافة إلى قائمة انتظار إعادة الإعمار وثم انقر فوق مسح الصورة الماوس. تأكد من أن الليزر الصحيح في 680 نانومتر محدداً.
   7. عندما يتم الانتهاء من الحصول على صورة، ضع الماوس مرة أخرى في قفصة. ومن المؤكد أنه يتعافى تماما من التخدير.
   8. قياس بيكوموليس الأسفار في إطار التحليل برمجيات التحليل باستخدام أداة العائد على الاستثمار وتخفيض العائد على الاستثمار حوالي 700-800 مم³ في إشارة قادمة من منطقة الرئة. كن حذراً لاستبعاد الإشارات الكبد. نسخ دوروا على مواضيع أخرى يكون لهم مماثلة في البعد وضبط وضعها في كل صورة الحيوان.
   9. تصدير الصور كملفات jpg.

3. في فيفو التصوير بالأشعة المقطعية الصغرى

تنبيه: قبل البدء، دائماً إزالة أي مجوهرات معدنية أو الأجسام المعدنية القريبة مجال التصوير، لتجنب تشتت الأشعة السينية.

ملاحظة: التليف الرئوي الناتج عن الإشعاع استنتاج مشترك خلال الإشعاع الناجم عن إصابة الرئة²⁴. لا الصغرى-CT اشتقاق مؤشرات لا النسيجي النتائج المرتبطة بتليف الرئة كانت موجودة في الفئران مراقبة المعالجة المالحة في يوم 21 تعرض للصغرى-CT أربعة دورات التصوير، مما يشير إلى أن جرعة الأشعة السينية تسليمها للحيوانات خلال مايكرو-CT الامتحانات لم تكن كافية للتأثير على النتائج.

1. تشغيل مايكرو-الأشعة المقطعية عن طريق الضغط على الزر الأخضر السلطة وإطلاق برامج الاحماء مصدر الأشعة السينية. استخدام تتحمل صغيرة والسرير الحيوان للفئران التصوير.
2. إنشاء قاعدة البيانات بالنقر فوق قاعدة بيانات جديدة عن واحدة جديدة وبناء المتصفح على أساس عدد من الفئران في التجربة، أو انقر فوق الاتصال بقاعدة بيانات موجودة لحفظ البيانات إلى واحد تم إنشاؤها مسبقاً.
3. قبل بدء تشغيل المسح الضوئي، حدد لبارامترات في إطار مراقبة البرمجيات: أنبوب الأشعة السينية من الجهد، 90 كيلو فولت؛ أنبوب "الأشعة المقطعية" الحالية، µA 160؛ يعيش أنبوب الأشعة السينية الحالية، µA 80؛ فوف، 36 مم؛ لا يوجد أسلوب النابضة؛ مسح تقنية عالية القرار 4 دقيقة.
4. تخدير الفئران باستنشاق إيسوفلوراني 3% ووضعها على السرير إدراج تتحمل مع مخروط الآنف توفير إمدادات ثابتة من مخدر. شل الكفوف الفئران مع الشريط على السرير للسماح للصدر ليكون عرضه.
5. حرك الباب صك وتشغيل وضع العيش لترى موضع الماوس في الوقت الحقيقي عن طريق الضغط على زر الالتقاط. نقل السرير الحيوان محاذاة الصدر مع مجال الرؤية (FOV) باستخدام الأزرار الموجودة مباشرة على الصك CT. مركز مسح على الماوس; أن لم يكن ضبط الموضع مع الأسهم الأيمن والأيسر الموجود على الصك CT.
6. تأكيد موقف سرير الأمثل بالتناوب الهزال بتحديد 90 ° النقر فوق تعيين. تأكد من أن المنطقة بصورة كاملة داخل فوف.
7. لا تطبق أية تقنية النابضة وبدء المسح الضوئي عن طريق النقر فوق الزر مسح CT . انقر فوق نعم إلى الرسالة التي يعلم أن مصدر الأشعة السينية سوف تكون قيد التشغيل.
   ملاحظة: بمجرد تشغيل الأشعة السينية، سوف يضيء المصباح البرتقالي على رأس هذا الصك وانزلاق الباب سيكون من المستحيل فتح الأمان للمشغل. بمجرد الانتهاء من المسح الضوئي، تظهر نافذة جديدة من البرنامج عارض 2D تظهر ترانساكسيال وكرونال، وشريحة السهمي لإعادة الإعمار.
8. التحقق من جودة الصورة وتأكد من لا يكون عدم وضوح الصور من الحركات بسبب المستوى المنخفض للتخدير. إذا لزم الأمر، كرر المسح الضوئي.
9. ضع الحيوانات مرة أخرى إلى القفص وتأكد من أنها التعافي تماما من التخدير.

4-للفيسيولوجيا الغسل

1. تخدير الحيوانات مع إيسوفلوراني 3% والتضحية بالنزيف من الشريان الاورطي البطني.
2. استخدام مقص لفضح في القفص الصدري والرقبة. ثم فضح القصبة الهوائية وجعل شق صغير للسماح بالإجراء BAL المراد تنفيذها مع أنبوب غسل 21-مقياس المرفقة بحقنه 1 مل دون الإبرة. انتبه لا إلى قطع طريق القصبة الهوائية.
3. للقيام البال، ملء المحاقن 1 مل دون إبرة مع 0.6 مل من محلول معقم [x 10 هانك في متوازنة الحل الملح (حبس)؛ حمض الإيثيلين 100 مم (يدتا)؛ حمض 4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazineethansulphonic 1 مم (حبيس)؛ المقطر المياه].
4. إدراج أنبوب الغسل في الشق في القصبة الهوائية وبطء حقن وسحب الحل 3 مرات، التوقف عن انسحاب ثالث للسماح لمجموعة الأمثل من بالف للتحليل اللاحق.

5-علم الأنسجة وهيستومورفوميتري

1. كشف وإزالة الرئتين، وتضخيم لهم مع قنية من خلال القصبة الهوائية بضخ لطيف مع 0.6 مل فورمالين 10% مخزنة المحايدة وتخزين العينات في درجة حرارة الغرفة ح 24.
2. يذوي عينات من خلال مقاطع مختلفة من التركيزات المتزايدة لحلول الكحول (الإيثانول 60% ح 1، 70% إيثانول ح 1, الإيثانول 90% ح 1, الإيثانول 95% ح 2، والايثانول 100% ح 2) باستخدام معالج أنسجة تلقائي.
3. وضع العينات في زيلين نفط ح 2 لجعلها شفافة. في نهاية الجفاف، التسلل عينات في البارافين في 60 درجة مئوية ح 3 وتضمينها في المعالج الآلي.
4. الحصول على 5 ميكرومتر سميكة المسلسل المقاطع استخدام مبضع دوارة.
5. ديبارافينيزي وترطيب الشرائح في الدرجات تنازلياً من الإيثانول ووصمة عار مع Trichrome ماسون باستخدام معالج أنسجة تلقائي.
6. التركيز على شرائح الرئة، المسح الضوئي في 20 X التكبير باستخدام ماسح ضوئي شريحة والتقاط صور رقمية لأقسام الرئة كاملة باستخدام برامج عرض مع قرار من 451 نيوتن متر/بكسل يدوياً.
7. تقييم شكلياً إصابة الرئة تليفية بمعلمات شبه كمي وكمي على النحو التالي:
   1. تحديد نقاط أشكروفت. شبه كمي الصف التغييرات الشكلية في أقسام الرئة طبقاً لمقياس يحددها أشكروفت¹⁰ تعديل بواسطة أوبنر et al. ²⁵ استخدام نظام 0-8 نقاط لتقييم جميع حمة في أقسام الرئة.
   2. تحديد محتوى الكولاجين. قياس درجة التليف^10،25 من برمجيات تحليل صورة مجهر. حدد عشوائياً رويس ثلاثة في 10 X التكبير، لكل شريحة. بتوحيد اللون إعدادات العتبة، الكشف عن الكولاجين كمنطقة الملون الأخضر.
   3. تحديد المجال الجوي السنخية. تحديد حجم منطقة إير السنخية كمعلمة غير مباشرة من التليف^10،25. عن طريق نفس البرنامج ورويس طلبا للكسر التليف, الكشف عن منطقة الهواء داخل رويس استخدام عتبة بيضاء.

النتائج

ولاحظ القرار العفوي للآفات تليف الرئة بعد الإدارة بليوميسين واحدة والتغييرات الهيكلية المعتدلين تسليط الضوء على حدود هذا النموذج ثلاثة أسابيع. يمكن أن يقوم إلا العلاج الوقائي بسبب نافذة علاجية ضيقة تمثل الممارسة السريرية¹⁷.

Discussion

وعلى الرغم من العديد من المجموعات البحثية مع التركيز على تطوير أدوية جديدة لعلاج الحكومي، في هذه اللحظة اثنين فقط المتاحة للمرضى. هناك حاجة طبية عاجلة لإيجاد علاجات أكثر فعالية⁷ نظراً لأن فقط الرئة ترانسبلانتاتيونيس قادرة على إطالة البقاء على قيد الحياة من 4-5 سنوات^2...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FMT 2500 Fluorescence Tomography System	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
MMPsense 680	Perkin Elmer Inc.	NEV10126	Protect from light, store the probe at 4 °C
TrueQuant software	Perkin Elmer Inc.
Female inbred C57BL/6	San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD),		Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
Isoflurane	ESTEVE spa	571329.8	Do not inhale
Automated cell counter	Dasit XT 1800J	Experimental Builder
Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl)	Eurospital	15A2807
Quantum FX Micro-CT scanner	Perkin Elmer Inc.
Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus	Sigma	B2434
Automatic tissue Processor	ATP700 Histo-Line Laboratories	ATP700
Embedding system	EG 1160 Leica Biosystems	EG 1160
Rotary microtome	Slee Cut 6062
Digital slide scanner	NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics
NIS-AR image analysis software	Nikon
Masson’s Trichrome Staining	Histo-Line Laboratories
10% neutral-buffered formalin	Sigma	HT5012-1CS
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator	Penn-century	DPM-EXT
PE190 micro medical tubing	2biological instruments snc	BB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mL	Terumo	SS*05SE1	Cut the boards of the piston by scissors
Hamilton 0.10 mL (model 1710)	Gastight	81022
Discofix 3-way Stopcock	Braun	4095111
Syringe with needle 1 mL	Pic solution	3,071,260,300,320	Use without needle
Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm	2biological instruments snc	FTP-18-50	Cut obliquely the tip