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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Describimos a un no-invasivo multimodal enfoque basado en la tomografía molecular Micro-CT y la fluorescencia para la evaluación longitudinal del modelo ratón pulmonar la fibrosis inducido por la instilación intratraqueal doble de bleomicina la proyección de imagen.

Resumen

Fibrosis pulmonar idiopática (IPF) es una enfermedad pulmonar mortal caracterizada por la destrucción progresiva e irreversible de la arquitectura del pulmón, que causa un deterioro significativo en la función pulmonar y posterior muerte por insuficiencia respiratoria.

La patogenia de IPF en modelos animales experimentales ha sido inducida por la administración de bleomicina. En este estudio, investigamos un modelo IPF-como ratón inducido por una instilación de bleomicina intratraqueal doble. Las evaluaciones histológicas estándar utilizadas para el estudio de la fibrosis pulmonar son procedimientos invasivos con el terminal. El objetivo de este trabajo es controlar fibrosis pulmonar a través de técnicas no invasivas de imagen como tomografía Molecular fluorescente (FMT) y Micro-CT. Estas dos tecnologías validadas con los resultados de histología podrían representar un revolucionario acercamiento funcional para tiempo real monitoreo no invasivo de la progresión y severidad de la enfermedad IPF. La fusión de los diferentes enfoques representa un paso más para la comprensión de la enfermedad de la IPF, donde se observan los eventos moleculares que ocurren en una condición patológica con FMT y los subsecuentes cambios anatómicos pueden ser monitoreados por el Micro-CT.

Introducción

La fibrosis pulmonar idiopática (IPF) es la enfermedad pulmonar crónica con disminución progresiva de las funciones de pulmón que suele ser por desgracia fatal dentro de cuatro años de diagnóstico1. Las características principales de IPF son deposición de matriz extracelular y la proliferación de fibroblastos, pero la patogénesis no se entiende todavía completamente. La hipótesis más compatible es que múltiples ciclos de lesiones pulmonares provocan la destrucción de células epiteliales alveolares que conduce a alteración de la proliferación mesenquimal ciclo celular, la acumulación exagerada de fibroblastos y miofibroblastos, y producción de la matriz aumentada. Mediadores involucrados en estos procesos como metaloproteinasas de matriz (MMPs) se han encontrado normales en el desarrollo de fibrosis en IPF humana o en modelos animales inducido por la bleomicina. La producción de MMP incontrolada conduce a un depósito de colágeno desequilibrada dentro del intersticio del pulmón y el espacio alveolar, mímico herida anormal reparación1,2.

Uno de los principales obstáculos para el desarrollo y descubrimiento de fármacos es la disponibilidad de modelos de ratón accesible que mímico humano patogenesia y el fenotipo de la enfermedad. Diferentes agentes se han utilizado para inducir la fibrosis de pulmón en modelos animales: daño de la irradiación, administración de asbesto y sílice, la administración de citoquinas fibrinogenic y bleomicina3,4; sin embargo la bleomicina es la más utilizada en ratones, ratas, cobayas, hámsteres, conejos5 o en grandes animales (primates no humanos, caballos, perros y rumiantes)6,7. La bleomicina es un antibiótico de la bacteria Streptomyces mezcla8 y se utiliza como un agente contra el cáncer9. La fibrosis pulmonar es un efecto secundario común de la droga y por esta razón, se utiliza en modelos animales experimentales para inducir fibrosis pulmonar.

En los modelos de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina, las lesiones fibróticas ocurren 14 a 21 días después de la administración de bleomicina. En el trabajo presentado, se utilizó un nuevo protocolo para inducir fibrosis de pulmón en ratones por instilación endotraqueal de bleomicina doble. El modelo de ratón de bleomicina es muy lento porque nuevos fármacos deben evaluarse en las lesiones fibróticas establecidas y probadas para distinguir sus efectos anti-fibróticos de efectos antiinflamatorios.

Determinación bioquímica del contenido de colágeno, morfométricas y análisis histológico se basaron en análisis de post mortem, limitando la posibilidad de seguir la patogenesia de la enfermedad en el animal mismo. Aunque estos parámetros eran considerados un estándar de oro para la evaluación de fibrosis, no proporcionan ninguna distribución temporal o espacial de la lesión fibrótica y excluye una manera de investigar el proceso de progresión de la enfermedad. 10

Recientemente, se han aplicado tecnologías de proyección de imagen no invasivas para monitor remodelación vía aérea, la inflamación y la progresión de la fibrosis en modelos murinos: proyección de imagen de resonancia magnética (MRI), tomografía de computadora Micro (Micro-CT), fluorescencia Molecular Tomografía (FMT) y bioluminiscentes (BLI)11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21. Proponemos un enfoque de proyección de imagen no invasiva para monitorear longitudinalmente progresión de fibrosis pulmonar por la FMT y Micro-CT en diferentes momentos después de que un bleomicina desafío22.

Muchos caminos están involucrados en la creación y desarrollo de fibrosis, y no se sabe mucho. Sólo una comprensión más profunda de estos procesos podría traducirse a más blancos de la droga que pueden transferir a la clínica. La capacidad para monitorear longitudinalmente activación de MMP por tomografía de fluorescencia molecular juntada a la detección de cambios parenquimatosos pulmonares por Micro-CT podría utilizarse en el futuro para acceder a la respuesta clínica al tratamiento.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité de bienestar animal intramuros para experimentación animal de Chiesi Farmaceutici y ERASMUS MC bajo el número de protocolo: EMC 3349 (138-14-07) con la UE europea de la Directiva 2010/63, D.l. italiano 26/2014 y la revisada de la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio"23.

Nota: Antes de usar ratones C57Bl/6 (7-8 semanas) consanguíneos femeninos fueron aclimatados durante al menos 7 días para las condiciones locales del vivero (temperatura ambiente: 20-24 ° C; humedad relativa: 40-70%; ciclo de luz-oscuridad de 12 h), tener acceso gratuito a chow roedor estándar y agua del grifo ablandada.

1. intratraqueal tratamiento de ratones con bleomicina

  1. Preparar el equipo para la instilación intra traqueal12,13,14.
  2. Pusieron los ratones en la cámara de anestesia conectada a un vaporizador de isoflurano en 2.5% mezclado con oxígeno. Compruebe la profundidad de la anestesia por la falta de una respuesta del pellizco del dedo del pie. El efecto de la anestesia se produjo después de 3-5 minutos.
  3. Coloque el ratón anestesiado en la plataforma de la intubación, colgando de sus incisivos colocados en el cable.
  4. Encienda el laringoscopio, tomar un par de pinzas terminados embotados y utilizar los fórceps o punta del laringoscopio para abrir suavemente la boca.
  5. Saque la lengua y mantenga al lado con pinzas. Coloque la pala del laringoscopio hacia la parte posterior de la boca hasta que se visualiza la apertura de la tráquea y mantener el laringoscopio en su lugar.
  6. Con la otra mano, inserte el tubo de entrega conectado con el extremo de la tubería de PE en la tráquea, la válvula de tres vías. Entregar 50 μl de bleomicina (0,020 μg/ratón). Después de la instilación, rápidamente Retire el tubo de la tráquea para evitar la asfixia. Sostenga el ratón verticalmente durante unos segundos.
    1. Administrar PCSC bleomicina en el día 0 y repetir en el día 4 (figura 1).
  7. Quitar el ratón de la plataforma de la intubación y controlar el ratón durante 30 minutos (el tiempo necesario para recuperarse completamente de la anestesia).
  8. Realizar en vivo la proyección de imagen de los pulmones de ratones por la FMT y Micro-CT después de la instilación de bleomicina doble en el día 7, 14 y 21.

2. en vivo la proyección de imagen por tomografía Molecular de la fluorescencia

Nota: De antemano, preparar una solución fresca de 6 nmol/mL de MMP sensible fluorescente sustrato 680 en solución salina (0.9% cloruro de sodio) y el almacén protegido de la luz a 4 ° C antes de usar. Es estable hasta por 6 meses a 4 ° C. Permiten MMP de agente se equilibren a temperatura ambiente antes de inyectar en animales.

  1. Sonda de inyección
    1. Preparar el equipo para la inyección intravenosa de la solución de sonda MMP. Pre-calentar el agua a 50 ° C para calentar la cola de ratón.
    2. Para Sujete con firmeza el pescuezo de ratón, tomar por la cola y deje que se sujete la tapa de la jaula. Mantener los ratones en los hombros del animal, poner la cola en un vaso de agua tibia, para 4 a máximo 8 lesión termal de s para evitar lesiones térmicas en la piel de la cola.  Compruebe las venas inflamación de más fácil visualización e inserción de la aguja.
    3. Durante el procedimiento de inyección, pusieron los ratones en un limitador de plástico para mantener constante y tire de la cola a través de un agujero especial en la parte posterior. Encontrar las dos venas caudales a ambos lados de la cola; no la arteria en la parte inferior de la cola.
    4. Insertar la aguja (26G) de la jeringa de 1 mL en la vena. Si la aguja está correctamente colocada, la inyección será fácil y fluirá a la solución de la sonda en el recipiente.
    5. Inyecte la solución de sonda MMP a 10 mL/kg.
    6. Deseche la aguja.
      Nota: El punto óptimo de tiempo imagen es 24 h después de la inyección de la punta de prueba MMP porque es el tiempo requerido por la sonda para activarse. Si se realizan estudios longitudinales, el tiempo óptimo de reinyección es 7 días, que permite la separación completa del agente desde el ratón.
  2. Proyección de imagen de FMT
    Nota: Antes de comenzar, siempre quite la piel en y alrededor de las áreas del animal que son de imagen, en este caso el pecho, para evitar la dispersión y absorción en el tejido.
    1. Para anestesiar el ratón, poner en cámara anestésica y gire el isoflurano a 2.5% para la inducción y 2% para mantenimiento.
    2. Inicializar el software de adquisición de datos y un nuevo estudio de la base de datos para el experimento.
    3. Antes de iniciar la proyección de imagen con FMT, transferir el ratón en el cartucho de proyección de imagen. Coloque el ratón anestesiado en medio imagen cassette para utilizar óptimamente el campo de visión de la FMT. Mantener los ratones plana, seguro y suavemente comprimido contra ambas ventanas del cartucho de proyección de imagen. Ajuste la altura de los botones de la cinta y luego deslice en la estación de acoplamiento.
    4. Haga clic en objeto en la ventana de exploración y haga clic en vista previa para ver la imagen en directo.
    5. Dibuje la región de análisis suficientemente grande para que el tejido que rodea el área anticipada de fluorescencia es capturado. Incluyendo un total de exploración 25 puntos garantiza la región pulmonar será totalmente digitalizada.
    6. Una vez que el ROI es dibujado, primero haga clic en Agregar a cola de reconstrucción y haga clic en escanear para el ratón de la imagen. Asegúrese de que el láser correcto en 680 nm está seleccionada.
    7. Cuando se ha completado la adquisición de la imagen, coloque el ratón en su jaula. Asegúrese de que se recupera completamente de la anestesia.
    8. Cuantificar las picomoles de fluorescencia en la ventana de análisis de lo software de análisis de uso de la herramienta ROI y reducir el retorno de la inversión alrededor de 700-800 mm3 la señal proveniente de la región pulmonar. Tenga cuidado de excluir a la señal del hígado. Copiar el ROI sobre los otros temas tienen similares en dimensión y ajustar su posición en cada imagen animal.
    9. Exportar las imágenes como archivos jpg.

3. en Vivo la proyección de imagen por Micro-CT

PRECAUCIÓN: Antes de comenzar, siempre Remueva cualquier joyería de metal u objetos metálicos cerca de la zona de proyección de imagen, para evitar la dispersión de rayos x.

Nota: La fibrosis pulmonar inducida por la radiación es un hallazgo frecuente durante la radiación inducida por lesión de pulmón24. Micro-CT en índices derivados ni resultados histológicos asociados con fibrosis pulmonar estaban presentes en ratones control tratados salina día 21 sometidos a cuatro Micro-CT en las sesiones de proyección de imagen, lo que indica que la dosis de rayos x entregados a los animales durante Micro-CT exámenes no fue suficiente para afectar los resultados.

  1. Encienda el Micro-CT pulsando el botón verde de encendido y ejecutar el programa para calentar la fuente de rayos x. Utilice el agujero pequeño y la cama de animales para la proyección de imagen de ratones.
  2. Crear la base de datos haciendo clic en nueva base de datos para una nueva y construir el navegador basado en el número de ratones en el experimento, o haga clic en conexión a la base de datos existente para guardar los datos en uno previamente creado.
  3. Antes de iniciar la exploración, seleccione los parámetros de adquisición en la ventana de control de software: voltaje de tubo de rayos x, 90 kV; Corriente del tubo de rayos x CT, 160 mA; En tubo de rayos x actual, 80 μA; Campo de visión, 36 mm; No bloquea técnica; Exploración técnica, alta resolución 4 min.
  4. Anestesiar los ratones por la inhalación de 3% de isoflurano y en la cama insertada en el agujero con un cono de nariz, proporcionando una fuente constante de anestésico. Inmovilizar las patas de los ratones con la cinta en la cama para permitir que el pecho de ser expuesto.
  5. Deslice la puerta del instrumento y activar el Modo de vivir para ver la posición del ratón en tiempo real pulsando el botón de captura. Mueva la cama animal para alinear el pecho con el campo de visión (FOV) utilizando los botones situados directamente en el instrumento de CT. Centro de la exploración en el ratón; Si no ajusta la posición con las flechas izquierdas y derecha en el instrumento de CT.
  6. Confirmar la posición óptima de la cama girando el pórtico selección 90 ° y haga clic en establecer. Asegúrese de que la región de la imagen está completamente dentro del campo de visión.
  7. No aplicar cualquier técnica bloquea y empezar la exploración haciendo clic en el botón de exploración por TAC . Haga clic en sí en el mensaje que informa que la fuente de rayos x se encenderá.
    Nota: Una vez que los rayos x se encienden, se enciende la lámpara naranja en la parte superior del instrumento y la puerta corredera será imposible de abrir por la seguridad del operador. Una vez finalizado el análisis, aparecerá una ventana nueva del software visor 2D mostrando la transaxial, coronal y sagital rebanada de la reconstrucción.
  8. Comprobar la calidad de la imagen y asegúrese de no han borrado las imágenes de movimientos debido al bajo nivel de anestesia. Si es necesario, repetir la exploración.
  9. Coloque los animales en la jaula y que recuperan completamente de la anestesia.

4. lavado broncoalveolar

  1. Anestesiar los animales con 3% de isoflurano y el sacrificio por el sangrado de la aorta abdominal.
  2. Utilizar tijeras para exponer la caja torácica y el cuello. Luego exponer la tráquea y hacer una pequeña incisión para permitir que el procedimiento de BAL se realizará con un tubo de calibre 21 lavado conectado a una jeringa de 1 mL sin la aguja. Preste atención de no cortar a través de la tráquea.
  3. Para realizar el BAL, llene la jeringa de 1 mL sin aguja con 0,6 mL de solución estéril [10 x madeja equilibrada solución de sal (HBSS), ácido de 100 mM etilendiaminotetracético (EDTA), ácido 4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazineethansulphonic 1 mM (HEPES), agua destilada agua].
  4. Inserte el tubo de lavado en la incisión en la tráquea y lentamente inyectar y retirar la solución 3 veces, pausa en el tercer retiro para permitir una óptima colección de BALF para posterior análisis.

5. histología y la histomorfometría

  1. Exponer y eliminar de los pulmones, inflarlos con una cánula a través de la tráquea por infusión suave con 0,6 mL de formol neutro tamponado al 10% y almacenar las muestras a temperatura ambiente durante 24 h.
  2. Deshidratan las muestras a través de diferentes pasos en el aumento de las concentraciones de las soluciones de alcohol (etanol al 60% durante 1 h, etanol 70% durante 1 h, 90% etanol para 1 h, etanol al 95% para 2 h y 100% etanol por 2 h) utilizando un procesador de tejidos automático.
  3. Coloque las muestras en xileno durante 2 h para que sean translúcidos. Al final de la deshidratación, infiltrarse en las muestras en parafina a 60 ° C para 3 h e incrustarlos en el procesador automatizado.
  4. Obtener 5 μm secciones serial de espesor utilizando un micrótomo rotatorio.
  5. Desparafinizar y rehidratar diapositivas en grados descendentes de etanol y de la mancha con TRICROMICA de Masson con un procesador de tejidos automático.
  6. Manualmente se centran en segmentos de pulmón, exploración con 20 aumentos utilizando un escáner de diapositivas y captura imágenes digitales de las secciones del pulmón entero usando el software de visualización con una resolución de 451 nm/pixel.
  7. Morfológicamente evaluar lesiones fibróticas pulmonares por parámetros cuantitativos y semi cuantitativos como sigue:
    1. Determinar la puntuación de Ashcroft. Semi-cuantitativamente grado cambios morfológicos en las secciones de pulmón según la escala definida por Ashcroft10 modificado por Hübner et al. 25 uso del sistema de 0-8 puntuación para evaluar todo el parénquima en las secciones de pulmón.
    2. Determinar el contenido de colágeno. Cuantificar el grado de fibrosis10,25 por el software de análisis de imagen de microscopio. Seleccionar al azar tres ROIs con 10 aumentos por cada diapositiva. Por la normalización de los parámetros de umbral del color, detectar el colágeno como área de teñido de verde.
    3. Determine el área de aire Alveolar. Cuantificar el área de aire alveolar como un parámetro indirecto de fibrosis10,25. Mediante el mismo software y ROIs aplicadas para la fracción de fibrosis, detectar la zona de aire dentro de los ROIs utilizando un umbral blanco.

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Resultados

La resolución espontánea de las lesiones de fibrosis pulmonar observados tres semanas después de administración única bleomicina y moderados cambios estructurales destacan los límites de este modelo. El tratamiento preventivo sólo pudo realizarse debido a la estrecha ventana terapéutica que representan práctica clínica17.

Aquí, demostramos que nuestro protocolo de instilación endotraqueal de b...

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Discusión

A pesar de muchos grupos de investigación centrado en el desarrollo de nuevos fármacos para el tratamiento de IPF en el momento sólo dos están disponibles para los pacientes. Hay una necesidad médica urgente para encontrar tratamientos más eficaces7 porque sólo un pulmón transplantationis capaces de prolongar la supervivencia de 4-5 años26. La condición esencial para la medicina traslacional y el desarrollo de nuevos fármacos es la disponibilidad de un modelo ani...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses que compiten.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Dr. Daniela Pompilio y Roberta Ciccimarra ayuda técnica.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
FMT 2500 Fluorescence Tomography SystemPerkin Elmer Inc.Experimental Builder
MMPsense 680Perkin Elmer Inc.NEV10126Protect from light, store the probe at 4 °C
TrueQuant softwarePerkin Elmer Inc.
Female inbred C57BL/6San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD), Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
IsofluraneESTEVE spa571329.8Do not inhale
Automated cell counterDasit XT 1800JExperimental Builder
Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl)Eurospital15A2807
Quantum FX Micro-CT scanner Perkin Elmer Inc.
Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus Sigma B2434 
Automatic tissue Processor ATP700 Histo-Line LaboratoriesATP700 
Embedding system EG 1160 Leica BiosystemsEG 1160
Rotary microtome Slee Cut 6062
Digital slide scanner NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics
NIS-AR image analysis software Nikon
Masson’s Trichrome StainingHisto-Line Laboratories
10% neutral-buffered formalinSigmaHT5012-1CS
Penn-century model DP-4M Dry power insufflatorPenn-centuryDPM-EXT
PE190 micro medical tubing2biological instruments sncBB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mLTerumoSS*05SE1Cut the boards of the piston by scissors
Hamilton 0.10 mL (model 1710)Gastight81022
Discofix 3-way StopcockBraun4095111
Syringe with needle 1 mLPic solution3,071,260,300,320Use without needle
Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm2biological instruments sncFTP-18-50Cut obliquely the tip 

Referencias

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