Um Multimodal abordagem de imagem baseado em Micro-CT e fluorescência Molecular tomografia para avaliação Longitudinal de fibrose pulmonar induzida por bleomicina em ratos

Resumo

Descrevemos um não-invasivo multimodal de imagem abordagem baseada na Micro-CT e fluorescência molecular tomografia computadorizada para avaliação longitudinal do rato modelo fibrose pulmonar induzida por instilação intratraqueal duplo da bleomicina.

Resumo

Fibrose pulmonar idiopática (IPF) é uma doença pulmonar fatal caracterizada pela destruição progressiva e irreversível da arquitetura do pulmão, que causa deterioração significativa na função pulmonar e subsequente morte por insuficiência respiratória.

A patogênese da IPF em modelos animais experimentais tem sido induzida pela administração de bleomicina. Neste estudo, investigamos um modelo IPF-como rato induzido por uma duplo intratraqueal instilação de bleomicina. Padrão histológicas Avaliações para estudar fibrose pulmonar são procedimentos invasivos de terminais. O objetivo deste trabalho é monitorar a fibrose pulmonar através de técnicas de imagem não invasivas, como tomografia computadorizada Molecular fluorescente (FMT) e Micro-CT. Essas duas tecnologias validadas com as conclusões de histologia poderiam representar uma abordagem revolucionária funcional para monitoramento invasivo em tempo real de progressão e severidade da doença IPF. A fusão das diferentes abordagens representa mais um passo para a compreensão da doença IPF, onde os eventos moleculares que ocorrem em uma condição patológica podem ser observados com a FMT e as subsequentes alterações anatômicas podem ser monitoradas por Micro-CT.

Introdução

Fibrose pulmonar idiopática (IPF) é uma doença pulmonar crônica, com diminuição progressiva das funções pulmonares que infelizmente muitas vezes fatal dentro de quatro anos de diagnóstico¹. Os principais recursos do IPF são proliferação de fibroblastos e deposição de matriz extracelular, mas a patogênese não é ainda totalmente compreendida. A hipótese mais apoiada é que vários ciclos de lesões pulmonares causam a destruição das células epiteliais alveolares que leva à alteração da proliferação mesenquimal ciclo celular, exagerado acúmulo de fibroblastos e miofibroblastos, e produção de matriz aumentada. Mediadores envolvidos nestes processos, tais como metaloproteinases de matriz (MMPs) foram encontrados prejudicado no desenvolvimento de fibrose na IPF humana ou em modelos animais induzida por bleomicina. A produção descontrolada de MMP leva a uma deposição de colágeno desequilibrada dentro do interstício pulmonar e o espaço alveolar, imitando anormal ferida reparo^1,2.

Um dos principais obstáculos para a descoberta de medicamentos e desenvolvimento é a disponibilidade de modelos de mouse acessível que imitam a patogênese humana e o fenótipo da doença. Diferentes agentes têm sido utilizados para induzir fibrose pulmonar em modelos animais: danos de irradiação, administração de asbesto e sílica, administração de citocinas fibrinogenic e bleomicina^3,4; no entanto, bleomicina é a mais usada em ratos, ratos, cobaias, hamsters, coelhos⁵ ou em grandes animais (primatas não-humanos, cavalos, cães e ruminantes)^6,7. Bleomicina é um antibiótico feito pela bactéria Streptomyces verticillus⁸ e é usada como um agente anticâncer⁹. Fibrose pulmonar é um efeito colateral comum da droga e por esta razão, é usado em modelos animais experimentais para induzir fibrose pulmonar.

Em modelos de fibrose pulmonar induzida por bleomicina, as lesões fibróticas ocorrerem 14-21 dias após a administração de bleomicina. No trabalho apresentado, usamos um novo protocolo para induzir fibrose pulmonar em camundongos por instilação intratraqueal de bleomicina duplo. O modelo do rato de bleomicina é muito demorado, porque novos medicamentos precisam ser avaliadas em lesões fibróticas estabelecidas e testada para distinguir seus efeitos antifibróticos de efeitos anti-inflamatórios.

Bioquímica determinação do teor de colágeno, morfométricas e análise histológica foram baseadas na análise de post mortem, limitando a possibilidade de acompanhar a patogênese da doença no mesmo animal. Apesar desses parâmetros considerados padrão ouro para avaliação de fibrose, eles não fornecem qualquer distribuição espacial ou temporal da lesão fibrótica e impede uma maneira de investigar o processo de progressão da doença. ¹⁰

Recentemente, as tecnologias de imagem não-invasivos foram aplicadas ao monitor remodelação de vias aéreas, inflamação e progressão da fibrose em modelos murino: ressonância magnética (MRI), Micro Tomography do computador (Micro-CT), fluorescência Molecular Tomografia computadorizada (FMT) e bioluminescentes (BLI)^{11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21}. Propomos uma abordagem de imagem não-invasivos para monitorar a progressão de fibrose pulmonar por FMT e Micro-CT em diferentes pontos de tempo após uma bleomicina desafiar²²longitudinalmente.

Muitos caminhos estão envolvidos na criação e no desenvolvimento de fibrose, e não se sabe muito. Somente uma compreensão mais profunda destes processos poderia traduzir para mais alvos de drogas que podem transferir para a clínica. A capacidade de monitorar longitudinalmente ativação MMP por tomografia de fluorescência molecular acoplada para a detecção de alterações parenquimatosas pulmonares por Micro-CT pode ser usada no futuro para acessar a resposta clínica ao tratamento.

Protocolo

Todas as experiências com animais aqui descritas foram aprovadas pelo Comité de bem-estar animal intramural a experimentação animal de Chiesi Farmaceutici e ERASMUS MC sob número de protocolo: EMC 3349 (138-14-07), em conformidade com o Europeu UE Directiva 2010/63, LGS italiano 26/2014 e a revista "Guia para o cuidado e uso de animais de laboratório"²³.

Nota: Antes da utilização, camundongos C57Bl/6 (7-8 semanas de idade) puras fêmeas foram aclimatados pelo menos 7 dias para as condições de viveiro local (temperatura: 20-24 ° C; umidade relativa do ar: 40-70%; ciclo claro-escuro de 12-h), tendo acesso gratuito ao comer roedor padrão e água de torneira amaciada.

1. intratraqueal de tratamento dos ratos com bleomicina

1. Prepare o equipamento para a instilação traqueal intra^12,13,14.
2. Coloque os ratos na câmara anestésica, conectada a um vaporizador de isoflurano fixado em 2,5%, misturado com oxigênio. Verifique a profundidade da anestesia pela falta de uma resposta de dedo-pinch. O efeito da anestesia ocorreu após 3-5 min.
3. Posicione o mouse anestesiado na plataforma de intubação, pendurá-lo pelos seus incisivos colocada no fio.
4. Ligue o laringoscópio, levar um par de pinças terminou sem corte e usar a pinça ou ponta do laringoscópio suavemente, abrir a boca.
5. Puxe a língua para fora e segure-o para o lado com fórceps. Coloque a lâmina do laringoscópio rumo à parte posterior da boca até a abertura da traqueia é visualizada e mantenha o laringoscópio no lugar.
6. Com a outra mão, inserir a extremidade do tubo conectada à extremidade do tubo na traqueia, girando a válvula de três vias de PE. Entrega 50 µ l de bleomicina (0,020 µ g/mouse). Após a instilação, rapidamente Retire o tubo da traqueia para evitar asfixia. Segure os ratos na posição vertical por alguns segundos.
   1. Administrar intratraquealmente bleomicina no dia 0 e repita no dia 4 (Figura 1).
7. Retire o mouse da plataforma de intubação e monitorar o mouse por 30 min (o tempo necessário para se recuperar totalmente da anestesia).
8. Execute na vivo de imagem nos pulmões de ratos por FMT e Micro-CT após a instilação de bleomicina duplo no dia 7, 14 e 21.

2. Imaging in vivo por fluorescência Molecular Tomography

Nota: De antemão, prepare uma solução de stock fresca 6 nmol/ml de MMP sensível fluorescente substrato 680 em solução salina (0,9% de cloreto de sódio), loja e protegido da luz a 4 ° C antes do uso. É estável por até 6 meses a 4 ° C. Permitir que a MMP imagem agente para equilibrar a temperatura ambiente antes de injetar em animais.

1. Injeção de sonda
   1. Prepare o equipamento para injecção intravenosa de solução de sonda a MMP. Pré-aquecer a água a 50 ° C para aquecer a cauda de rato.
   2. Para Segure com firmeza a nuca de rato, levá-lo pela cauda e permitir que ele Segure a tampa da gaiola. Segurando os ratos através de ombros do animal, coloque o rabo num copo de água morna, para 4 a 8 lesões s de térmicas de máxima para evitar queimaduras na pele da cauda.  Verifique as veias inchaço para mais fácil visualização e inserção da agulha.
   3. Durante o procedimento de injeção, colocar os ratos em uma retenção de plástico para mantê-lo firme e puxar o rabo, através de um furo na parte de trás. Encontrar as duas veias caudais em ambos os lados da cauda; Não a artéria, na parte inferior da cauda.
   4. Introduza a agulha (26G) de seringa de 1 mL na veia. Se a agulha está colocada correctamente, injeção será fácil e a solução de sonda fluirá no recipiente.
   5. Injecte a solução de sonda MMP 10ml/kg.
   6. Descarte a agulha.
      Nota: O ponto ideal de tempo imagem é 24 h após a injeção de sonda MMP porque é o tempo necessário pela sonda para ser ativado. Se forem realizados estudos longitudinais, o tempo ideal de re-injecção é 7 dias, o que permite a liberação completa do agente do mouse.
2. Imagem de FMT
   Nota: Antes de começar, retire sempre a pele em e em torno das áreas do animal que estão a ser fotografada, neste caso, o peito, para evitar a dispersão e a absorbância no tecido.
   1. Para anestesiar o mouse, colocá-lo na câmara anestésica e gire o dial de isoflurano para indução de 2,5% e 2% para manutenção.
   2. Inicializar o software de aquisição de dados e abrir um novo estudo do banco de dados para o experimento.
   3. Antes de iniciar a imagem com a FMT, transferi o mouse dentro da imagem. Coloque o mouse anestesiado no meio da imagem latente gaveta para otimamente, use o campo de visão do FMT. Manter os ratos plana, seguro e suavemente compactado contra ambas as janelas da fita de imagem. Ajuste de altura por botões na fita e em seguida, deslize-o na estação de ancoragem.
   4. Clique sobre o assunto na janela de verificação e clique em Visualização para ver a imagem ao vivo.
   5. Desenhe a região de varredura suficientemente grande para que o tecido circundante área antecipada da fluorescência é capturado. Incluindo um total de garantias de varredura 25 pontos na região do pulmão será totalmente digitalizada.
   6. Uma vez que o ROI é desenhado, primeiro clique em Adicionar à fila de reconstrução e clique em digitalizar para o mouse de imagem. Certifique-se que o laser correto em 680 nm é selecionado.
   7. Quando estiver concluída a aquisição da imagem, posicione o mouse volta para sua jaula. Certifique-se de que ele se recupere totalmente da anestesia.
   8. Quantificar os picomoles de fluorescência na janela de análise do software de análise usando a ferramenta ROI e reduzir o ROI em torno de 700-800 mm³ do sinal proveniente da região de pulmão. Tenha cuidado para excluir o sinal do fígado. Copie o ROI sobre os outros assuntos para tê-los semelhantes em dimensão e ajustar sua posição em cada imagem animal.
   9. Exporte imagens como arquivos jpg.

3. imagem latente na Vivo por Micro-CT

Atenção: Antes de começar, retire sempre qualquer metal joias ou objetos de metal perto da área de imagem, para evitar o espalhamento de raios-x.

Nota: A fibrose pulmonar induzida por radiação é que um achado comum durante a radiação induzida de lesão pulmonar²⁴. Micro-CT derivado índices nem achados histológicos associados com fibrose pulmonar estavam presentes nos ratos controle tratados salina no dia 21 sujeitado a Micro-CT quatro sessões de imagem, indicando que a dose de raios-x entregues aos animais durante a Micro-CT exames não foi suficiente para afetar as conclusões.

1. Ligue o Micro-CT premindo o botão verde poder e lançar o software para aquecer a fonte de raios-x. Use o pequeno furo e a cama do animal para os ratos de imagem.
2. Criar o banco de dados clicando no novo banco de dados para um novo e construir o navegador baseado no número de ratos no experimento, ou clique em conexão com o banco de dados existente para salvar os dados para um criado anteriormente.
3. Antes de iniciar a varredura, selecione os parâmetros de aquisição na janela de controle do software: tensão do tubo de raio x, 90 kV; Corrente de tubo de raio x CT, 160 µA; Viver o tubo de raio x atual, 80 µA; FOV, 36 mm; Nenhuma técnica associada; Verificação técnica, alta resolução 4 min.
4. Anestesiar os ratos por inalação de 3% de isoflurano e colocá-los na cama inserida o furo com um cone de nariz, proporcionando um fornecimento constante de anestésico. Imobilize as patas dos ratos com fita em cima da cama, para permitir que o peito para ser exposto.
5. Deslize a porta do instrumento e ativar o Modo de viver para ver a posição do mouse em tempo real, pressionando o botão de captura. Afastar a cama animal para alinhar o peito com o campo de visão (FOV) usando os botões diretamente no instrumento CT. Centro da varredura do mouse; Se não ajustar a posição com as setas esquerda e direita localizadas no instrumento CT.
6. Confirme a posição da cama ideal girando o pórtico selecionando 90 ° e clicando em definir. Certifique-se que a região a imagem está totalmente dentro do FOV.
7. Não aplicar qualquer técnica associada e iniciar a varredura clicando no botão de tomografia computadorizada . Clique em Sim para a mensagem que informa que a fonte de raios-x será ativada.
   Nota: Uma vez que as radiografias estão ativadas, acende a lâmpada cor de laranja em cima do instrumento e a porta de correr será impossível de abrir para a segurança do operador. Quando a digitalização estiver concluída, uma nova janela do software 2D Viewer aparece mostrando o transaxial, coronal e sagital fatia da reconstrução.
8. Verificar a qualidade da imagem e não se esqueça de ter borrado imagens de movimentos devido ao baixo nível de anestesia. Se necessário, repita o exame.
9. Coloque os animais de volta para a jaula e certifique-se de que eles se recuperar totalmente da anestesia.

4. broncoalveolar

1. Anestesia animais com 3% de isoflurano e sacrifício por sangramento da aorta abdominal.
2. Use uma tesoura para expor a caixa torácica e pescoço. Em seguida, expor a traqueia e faça uma pequena incisão para permitir que o procedimento de BAL, a ser realizada com um tubo de calibre 21 lavagem anexado a uma seringa de 1 mL sem a agulha. Preste atenção para não cortar a traqueia.
3. Para executar o BAL, encha a seringa de 1 mL sem agulha com 0,6 mL de solução estéril [10 x Hank está equilibrada solução salina (HBSS); ácido de 100mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido 4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazineethansulphonic de 1mm (HEPES); água destilada água].
4. Insira o tubo de lavagem a incisão na traqueia e, lentamente, injetar e retirar a solução 3 vezes, pausando sobre a terceira retirada para permitir a melhor coleção da LBA para análise posterior.

5. histologia e Histomorfometria

1. Expor e remover os pulmões, inflando-os com uma cânula através da traqueia por infusão suave com 0,6 mL de formol a 10% neutro-tampão e armazenar as amostras à temperatura ambiente por 24 h.
2. Desidratar amostras através de diferentes passagens em concentrações crescentes de soluções de álcool (etanol 60% por 1h, etanol a 70% para 1 h, 90% de etanol por 1h, etanol a 95% para 2h e 100% de etanol para 2h) usando um processador automático de tecidos.
3. Colocar as amostras em xilol para 2h para torná-los translúcidos. No final da desidratação, infiltrar-se amostras em parafina a 60 ° C por 3 h e incorporá-los no processador automatizado.
4. Obter 5 µm espessura seções de serial usando um micrótomo rotativo.
5. Deparaffinize e reidratar slides em graus decrescentes de etanol e mancha com Masson Trichrome usando um processador automático de tecidos.
6. Concentre-se em fatias de pulmão, digitalização ampliação de X 20 usando um scanner de slides e capturar imagens digitais de seções de pulmão inteiro usando o software de visualização com uma resolução de 451 nm/pixel manualmente.
7. Morfologicamente avalie lesões pulmonares fibróticas pelos parâmetros quantitativos e semi-quantitativa da seguinte forma:
   1. Determine a pontuação de Ashcroft. Semi-quantitativamente grau mudanças morfológicas nas seções de pulmão, de acordo com a escala definida por Ashcroft¹⁰ modificado por et al . Hübner ²⁵ a utilização do sistema de 8-0 Pontuação para avaliar o parênquima todas as seções do pulmão.
   2. Determine o teor de colágeno. Quantificar o grau de fibrose^10,25 pelo software de análise de imagem do microscópio. Selecione aleatoriamente três ROIs na ampliação de 10x, por cada slide. Pela padronização das configurações de limite de cor, detecta o colágeno como área manchada de verde.
   3. Determine a área de ar Alveolar. Quantificar a área de ar alveolar como um parâmetro indireto de fibrose^10,25. Através do mesmo software e ROIs aplicados para a fração de fibrose, detecta a área de ar dentro do ROIs usando um limite branco.

Resultados

Resolução espontânea das lesões fibrose pulmonar observado três semanas após a administração única de bleomicina e moderadas alterações estruturais destacam os limites deste modelo. Tratamento preventivo só pôde ser executado devido a estreita janela terapêutica que não representam a prática clínica¹⁷.

Aqui, demonstramos que nosso protocolo de instilação intratraqueal de duplo bleomicin...

Discussão

Apesar de muitos grupos de pesquisa se concentra no desenvolvimento de novos medicamentos para tratar o IPF, no momento apenas dois estão disponíveis para os pacientes. Há uma necessidade urgente de médica para encontrar mais eficazes terapias⁷ porque só pulmão transplantationis capaz de prolongar a sobrevivência de 4-5 anos²⁶. O pré-requisito essencial para o desenvolvimento de novas drogas e medicina translacional é a disponibilidade de um modelo animal que imita...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
FMT 2500 Fluorescence Tomography System	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
MMPsense 680	Perkin Elmer Inc.	NEV10126	Protect from light, store the probe at 4 °C
TrueQuant software	Perkin Elmer Inc.
Female inbred C57BL/6	San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD),		Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
Isoflurane	ESTEVE spa	571329.8	Do not inhale
Automated cell counter	Dasit XT 1800J	Experimental Builder
Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl)	Eurospital	15A2807
Quantum FX Micro-CT scanner	Perkin Elmer Inc.
Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus	Sigma	B2434
Automatic tissue Processor	ATP700 Histo-Line Laboratories	ATP700
Embedding system	EG 1160 Leica Biosystems	EG 1160
Rotary microtome	Slee Cut 6062
Digital slide scanner	NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics
NIS-AR image analysis software	Nikon
Masson’s Trichrome Staining	Histo-Line Laboratories
10% neutral-buffered formalin	Sigma	HT5012-1CS
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator	Penn-century	DPM-EXT
PE190 micro medical tubing	2biological instruments snc	BB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mL	Terumo	SS*05SE1	Cut the boards of the piston by scissors
Hamilton 0.10 mL (model 1710)	Gastight	81022
Discofix 3-way Stopcock	Braun	4095111
Syringe with needle 1 mL	Pic solution	3,071,260,300,320	Use without needle
Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm	2biological instruments snc	FTP-18-50	Cut obliquely the tip