JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем неинвазивные смешанных изображений подход, основанный на микро-CT и флуоресценции молекулярные томографии для продольной оценки модели фиброз легких мыши, вызванных двойной трахею инстилляции блеомицин.

Аннотация

Идиопатического легочного фиброза (МГЛ) является фатальной легких заболевание, характеризующееся постепенного и необратимого уничтожения легкого архитектуры, которая вызывает значительное ухудшение в легочной функции и последующей смерти от дыхательной недостаточности.

Патогенез МГЛ в экспериментальных моделях на животных были индуцированных блеомицин администрации. В этом исследовании мы исследуем модель МГЛ как мышь, вызванных инстилляции блеомицин двойной трахею. Стандартный гистологические оценки, используются для изучения фиброз легких являются инвазивные процедуры терминала. Целью этой работы является для мониторинга фиброз легких через неинвазивные методы визуализации как флуоресцентные молекулярной томография (ДРМ) и микро-CT. Эти две технологии, проверяются с выводами Гистологическая картина может представлять революционный функциональный подход для Неинвазивный мониторинг в реальном времени тяжести заболевания МГЛ и прогрессии. Сочетание различных подходов представляет собой шаг вперед для понимания болезни МГЛ, где молекулярные события, происходящие в патологические состояния могут наблюдаться с ДРМ и последующие анатомические изменения можно контролировать с помощью микро-CT.

Введение

Идиопатического легочного фиброза (МГЛ) — хроническое заболевание легких с постепенное уменьшение функции легких, к сожалению, часто со смертельным исходом в течение четырех лет диагноз1. Основные функции МГЛ внеклеточной матрицы осаждения и пролиферации фибробластов, но патогенез еще не полностью понял. Наиболее поддерживаемых гипотеза является, что несколько циклов легких травм вызывает разрушение альвеолярных клеток эпителия, что приводит к изменения мезенхимальных клеточного цикла распространения, преувеличенные накопление фибробластов и миофибробласты, и увеличение матрица производства. Посредников, участвующих в этих процессах, такие, как матрицы металлопротеиназ (MMPs) были обнаружены dysregulated в развитие фиброза в человека МГЛ или блеомицин индуцированного животных моделях. Неконтролируемого производства ММЗ приводит к несбалансированным коллаген осаждения в интерстиции легких и альвеолярного пространства, подражая аномальные рану ремонт1,2.

Одним из основных препятствий для обнаружения наркотиков и развития является наличие доступных мыши моделей, которые имитируют человека патогенеза и фенотип болезни. Различные агенты были использованы, чтобы побудить фиброз легких в животных моделях: облучение повреждения, администрация асбеста и кремнезема, администрация fibrinogenic цитокинов и блеомицин3,4; Однако блеомицин является наиболее используемым в мышей, крыс, морские свинки, хомячки, кролики5 или в крупных животных (нечеловеческих приматов, лошадей, собак и жвачных животных)6,7. Блеомицин является антибиотиком, сделанные бактерией Streptomyces verticillus8 и используется в качестве агента противораковых9. Легочный фиброз общий побочный эффект препарата и по этой причине, он используется в экспериментальных моделях на животных побудить легочного фиброза.

В легких, блеомицин индуцированного фиброза модели фиброзных поражениях происходят 14-21 дней после блеомицин администрации. В представленной работе мы использовали новый протокол побудить фиброз легких у мышей с двойной блеомицин трахею инстилляции. Блеомицин модель мыши очень много времени, потому что новые препараты должны оцениваться по установленным фиброзных поражениях и испытания, чтобы отличить их анти фиброзный эффект от противовоспалительным действием.

Биохимические определение содержания коллагена, морфометрических и гистологический анализ основывались на анализе mortem пост, ограничивая возможность следовать патогенез заболевания в то же самое животное. Хотя эти параметры были считается золотым стандартом для оценки фиброза, они не обеспечивают любой временной или пространственной распределение фиброзных поражения и исключает возможность исследовать процесс прогрессирования заболевания. 10

Недавно, неинвазивной визуализации технологии были применены к монитор сократимость Ремоделирование, воспаления и прогрессии фиброза в мышиных моделях: магнитно-резонансной томографии (МРТ), компьютерная томография микро (Micro-CT), флуоресценции молекулярной Томография (ДРМ) и биолюминесцентных (BLI)11,12,13,14,,1516,,1718,19 ,,2021. Мы предлагаем неинвазивная изображений подход для мониторинга продольно прогрессии фиброза легких ДРМ и микро-CT в разные время очки после блеомицин вызов22.

В создании и развитии фиброза участвуют многие пути, и не так много известно. Только глубокое понимание этих процессов может перевести на более лекарственных препаратов, которые могут передавать в клинику. Возможность продольно контролировать MMP активации по молекулярной томография флуоресценции сочетании для обнаружения изменений легких Паренхиматозный микро-CT может использоваться в будущем для доступа к клинической реакции на лечение.

протокол

Все описываемые опыты на животных были утверждены Комитетом интрамуральных-животных для экспериментов на животных Chiesi Farmaceutici и ERASMUS MC под номером протокола: EMC 3349 (138-14-07) соблюдения Европейской директивы 2010/63 УП, Итальянские D.Lgs 26/2014 и пересмотренный «Руководство для ухода и использования лабораторных животных»23.

Примечание: Перед использованием, женский инбредных мышей C57Bl/6 (7-8 недель) были акклиматизированы для по крайней мере 7 дней к условиям местной виварий (комнатной температуре: 20-24 ° C, относительная влажность: 40-70%; 12-h свето тени цикла), имея свободный доступ к стандартным грызунов Чоу и размягченного водопроводной воды.

1. трахею лечение мышей с блеомицин

  1. Подготовка оборудования для intra трахеи инстилляции12,,1314.
  2. Положите мышей в зале цистит, подключенных к изофлюрановая испаритель установлен на 2,5%, смешанной с кислородом. Проверка глубины анестезии, отсутствие реакции мыс пинча. Влияние анестезии произошло после 3-5 мин.
  3. Позиции наркотизированных мыши на платформе интубации, висит на его резцов размещены на проволоку.
  4. Включите ларингоскопа, взять пару тупых закончился щипцов и использовать щипцы или ларингоскопа кончик аккуратно открыть рот.
  5. Вытащить язык и держать его в сторону с щипцами. Ларингоскоп лезвие в задней части рта до открытия трахеи визуализируется и удержание Ларингоскоп на месте.
  6. С другой стороны вставьте доставки трубки подключены к концу трубы PE в трахею, вращающихся трехходовой клапан. Доставить 50 мкл Блеомицин (0,020 мкг/мышь). После инстилляции быстро снять трубку от трахеи для предотвращения удушья. Держите мышей в вертикальном положении на несколько секунд.
    1. Администрировать блеомицин intratracheally в день 0 и повторить на день 4 (рис. 1).
  7. Удалите мышь от платформы интубации и контролировать мышь для 30 мин (время, необходимое для полного восстановления от анестезии).
  8. Выполните в vivo томографии легких мышей ДРМ и микро-CT после инстилляции двойной блеомицин на 7, 14 и 21 день.

2. в естественных условиях изображений по флуоресценции молекулярной томография

Примечание: Заранее, готовить свежий раствор 6 нмоль/мл ММП чувствительных флуоресцентные субстрата 680 в физиологический раствор (0,9% хлорида натрия) и хранить защищенный от света на 4 ° C перед использованием. Он стабилизирован на срок до 6 месяцев при 4 ° C. Разрешить MMP изображений агента, чтобы сбалансировать до комнатной температуры перед инъекцией в животных.

  1. Зонд инъекций
    1. Подготовка оборудования для внутривенного введения раствора зонд ММП. Предварительно теплой водой при 50 ° C тепла хвост мыши.
    2. Возьмите мышь загривок, взять его за хвост и позволяют ему сцепление крышку отсека. Проведение мышей через плечи животного, положите хвост в стакан теплой воды, для 4 до максимум 8 s термической травмы для предотвращения тепловой травмы кожи хвост.  Проверьте вен, отеки легче визуализации и иглы.
    3. Во время процедуры инъекции, положите мышей в пластиковый фиксатор, чтобы держать неподвижно и тянуть хвост через специальное отверстие в задней части. Найти два хвостового вен по бокам хвоста; не артерии на нижней части хвоста.
    4. Вставьте иглу (26G) 1 мл шприца в Вену. Если правильно размещен иглы, инъекции будет легко и зонд решение будет поступать в судна.
    5. Внедрять решение MMP зонд на 10 мл/кг.
    6. Выбросите иглу.
      Примечание: Оптимальный изображений время суть 24 ч после введения зонда MMP потому что это время зонд активируется. Если выполняются продольного исследования, время оптимальный повторные инъекции составляет 7 дней, который позволяет для полного разминирования агента от мыши.
  2. ДРМ изображений
    Примечание: Перед началом, всегда удалить мех на и вокруг области животного, которые должны быть imaged, в данном случае груди, чтобы избежать рассеяния и поглощения в ткани.
    1. Анестезировать мыши, положить его в камере обезболивающий и повернуть ручку изофлюрановая, 2,5% для индукции и 2% на техническое обслуживание.
    2. Инициализация программы для сбора данных и открыть новое исследование в базе для эксперимента.
    3. Перед началом съемки с ДРМ, передача мышь в изображений кассету. Поместите наркотизированных мыши в середине изображений кассету оптимально использовать поле зрения ДРМ. Держите мышей плоский, безопасный и аккуратно сжатых против обоих windows изображений кассету. Отрегулируйте высоту, ручки на кассету, а затем вставьте его в док-станции.
    4. Нажмите на предмет в окне сканирования и нажмите кнопку Просмотр , чтобы увидеть живой.
    5. Нарисуйте область сканирования достаточно большой так что захватили ткани вокруг предполагаемой области флуоресценции. Включая в общей сложности 25 сканирования точек гарантии легких регион будет полностью проверенных.
    6. После того, как рисуется ROI, сначала нажмите Добавить в очередь реконструкции и нажмите Сканировать изображения мышью. Убедитесь, что правильной лазера на 680 нм выбран.
    7. После завершения загрузки изображений, поместите курсор мыши обратно в своей клетке. Убедитесь, что он полностью восстанавливается от анестезии.
    8. Количественно пикомоль флуоресценции в окне анализа с использованием ROI инструмент программного обеспечения для анализа и снизить рентабельность около3 700-800 мм на сигнал из региона легких. Будьте осторожны, чтобы исключить печени сигнала. Скопируйте ROI по другим предметам у них аналогичные в измерении и скорректировать свои позиции в каждом изображении животных.
    9. Экспорт изображений в jpg файлы.

3. в естественных условиях изображений по микро CT

Предупреждение: Перед началом, всегда удалите любые ювелирных изделий металла или металлических объектов вблизи области изображения, чтобы избежать рассеяния рентгеновских лучей.

Примечание: Фиброз легких, радиационно индуцированных является общий вывод во время излучения индуцированных повреждений легких24. Микро-CT производные индексы ни гистологические результаты, связанные с фиброзом легких присутствовали в солевой обработки управления мышей на 21 день подвергали четыре микро-КТ изображений сессий, указав, что дозы рентгеновского доставлены к животным во время микро-CT экзамены не был достаточно, чтобы повлиять на результаты.

  1. Включите микро-CT, нажав на кнопку зеленый питания и запуск программного обеспечения для разогрева источник рентгеновского излучения. Использование малого диаметра и животного кровать для мышей изображений.
  2. Создайте базу данных, нажав на новой базы данных для нового и построить браузер основанный на количество мышей в эксперименте, или нажмите кнопку Подключение к существующей базе данных для сохранения данных в один ранее созданный.
  3. Перед началом сканирования, выберите приобретение параметры в окне программного обеспечения управления: Рентгеновская трубка напряжения, 90 кв; КТ рентгеновские трубки тока, 160 МКА; Live ток, рентгеновская трубка 80 МКА; ПЗ, 36 мм; Не стробирования технику; Высокое разрешение сканирования технику, 4 мин.
  4. Анестезировать мышей при вдыхании 3% изофлюрановая и разместить их на кровати, вставляется в отверстие с носовой конус, обеспечивая постоянную поставку анестетика. Иммобилизации лапы мышей с лентой на кровать, чтобы дать грудь, чтобы подвергаться.
  5. Сдвиньте дверцу инструмента и включите Режим Live , чтобы увидеть положение мыши в режиме реального времени, нажав на кнопку захвата. Перемещение животных кровати для выравнивания груди с поля зрения (FOV) с помощью кнопок, расположенных непосредственно на инструменте CT. Центр сканирования мыши; Если не настроить положение с стрелками влево и вправо, расположенный на инструменте CT.
  6. Подтвердите положение оптимального кровати, вращающейся портальный, выбрав 90 ° и нажав кнопку задать. Убедитесь, что регион изображение полностью внутри ПЗ.
  7. Не применять любые шлюзовые технику и запустите сканирование, нажав на кнопку компьютерной томографии . Нажмите кнопку Да в сообщение, которое сообщает, что будет включен источник рентгеновского излучения.
    Примечание: После рентгена включены, оранжевая лампа на вершине инструмента будет освещаться и раздвижные двери будет невозможно открыть для безопасности оператора. После завершения сканирования, откроется новое окно просмотра программное обеспечение 2D показаны transaxial, корональных и сагиттальной ломтик реконструкции.
  8. Проверьте качество изображения и будьте уверены, чтобы не размыть изображения от движений из-за низкого уровня анестезии. При необходимости повторите сканирование.
  9. Поместите животных обратно в отсек и убедитесь, что они полностью оправиться от анестезии.

4. Бронхоальвеолярный лаваж

  1. Анестезировать животных с 3% изофлюрановая и жертву, кровотечение из брюшной аорты.
  2. Используйте ножницы, чтобы разоблачить грудной клетки и шеи. Затем подвергать трахеи и сделать небольшой надрез, чтобы позволить бал процедуры должны быть выполнены с 21-го калибра промывание труб, прилагается к 1 мл шприц без иглы. Обратите внимание, чтобы не прорезать трахеи.
  3. Чтобы выполнить BAL, заполните 1 мл шприц без иглы с 0,6 мл стерильного раствора [10 x Хэнк сбалансированного солевого раствора (HBSS); 100 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА); 1 мм 4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazineethansulphonic кислоты (HEPES); дистиллированной вода].
  4. Вставьте трубу промывание в разрез в трахею и медленно вдохнуть и отозвать решение 3 раза, останавливаясь на третьем вывода позволяет оптимальную коллекцию BALF для последующего анализа.

5. гистология и Histomorphometry

  1. Разоблачить и удаление легких, надувать их с катетер через трахею нежный инфузии с 0,6 мл 10% буферизацией нейтрального формалина и хранить образцы при комнатной температуре в течение 24 ч.
  2. Обезвоживает образцы через различные ходы в повышении концентрации спиртовых растворов (60% этанола за 1 ч, этанол 70% для 1 h, 90% этанола за 1 ч, этанол 95% для 2 h и 100% этанола для 2 h) с использованием автоматического ткани процессора.
  3. Поместите образцы в ксилоле 2 h сделать их полупрозрачными. В конце обезвоживания проникнуть образцов в парафин при 60 ° C 3 h и вставлять их в автоматизированных процессор.
  4. Получите 5 мкм толщиной серийный разделы, используя микротом роторный.
  5. Deparaffinize и увлажняет слайды в убывающем сортов этанола и пятна с Массон в Trichrome с использованием автоматического ткани процессора.
  6. Сосредоточиться на кусочки легких, сканирование при 20-кратном с помощью слайд-сканер и захвата цифровых изображений всей легких разделов, используя программное обеспечение для просмотра с разрешением 451 Нм/пиксель вручную.
  7. Морфологически оценить повреждения фиброзных легких, полу количественных и качественных параметров следующим образом:
    1. Определите показатель Ashcroft. Полу-количественно класс морфологические изменения в легких секций по шкале определяется Эшкрофт10 изменена Hübner et al. 25 использование системы 0-8 Оценка оценить все паренхимы легких секций.
    2. Определите содержание коллагена. Количественно оценить степень фиброза10,25 , программное обеспечение для анализа изображения микроскопа. Случайным образом выберите три ROIs при 10-кратном, показа каждого слайда. По стандартизации параметров порог цвета обнаружить коллагена как Грин окрашенные области.
    3. Определите области альвеолярного воздуха. Количественную оценку участка альвеолярного воздуха как параметр косвенные фиброз10,25. С помощью же программное обеспечение и трансформирования, применяется для фракция фиброз обнаружить области воздуха в пределах ROI, с использованием белого порог.

Результаты

Спонтанное резолюции поражений фиброз легких наблюдается через три недели после одного блеомицин администрации и умеренные структурные изменения выделения пределы этой модели. Только профилактическое лечение может быть выполнена из-за узких терапевтических окно, ?...

Обсуждение

Несмотря на многие исследовательские группы упором на разработке новых препаратов для лечения МГЛ на данный момент только два доступны для пациентов. Есть медицинские срочно найти более эффективные методы лечения7 , потому что только легких микротрансплантатов возможнос...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие интересы.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Daniela Pompilio и Роберта Ciccimarra за технической помощью.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
FMT 2500 Fluorescence Tomography SystemPerkin Elmer Inc.Experimental Builder
MMPsense 680Perkin Elmer Inc.NEV10126Protect from light, store the probe at 4 °C
TrueQuant softwarePerkin Elmer Inc.
Female inbred C57BL/6San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD), Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
IsofluraneESTEVE spa571329.8Do not inhale
Automated cell counterDasit XT 1800JExperimental Builder
Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl)Eurospital15A2807
Quantum FX Micro-CT scanner Perkin Elmer Inc.
Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus Sigma B2434 
Automatic tissue Processor ATP700 Histo-Line LaboratoriesATP700 
Embedding system EG 1160 Leica BiosystemsEG 1160
Rotary microtome Slee Cut 6062
Digital slide scanner NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics
NIS-AR image analysis software Nikon
Masson’s Trichrome StainingHisto-Line Laboratories
10% neutral-buffered formalinSigmaHT5012-1CS
Penn-century model DP-4M Dry power insufflatorPenn-centuryDPM-EXT
PE190 micro medical tubing2biological instruments sncBB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mLTerumoSS*05SE1Cut the boards of the piston by scissors
Hamilton 0.10 mL (model 1710)Gastight81022
Discofix 3-way StopcockBraun4095111
Syringe with needle 1 mLPic solution3,071,260,300,320Use without needle
Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm2biological instruments sncFTP-18-50Cut obliquely the tip 

Ссылки

  1. Wynn, T. A. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J. Exp. Med. 208 (7), 1339-1350 (2011).
  2. Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18 (7), 1028-1040 (2012).
  3. Moore, B. B. Animal models of fibrotic lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (2), 167-179 (2013).
  4. Ackermann, M., et al. Effects of nintedanib on the microvascular architecture in a lung fibrosis model. Angiogenesis. , (2017).
  5. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (2), 152-160 (2008).
  6. Organ, L., et al. A novel segmental challenge model for bleomycin-induced pulmonary fibrosis in sheep. Exp Lung Res. 41 (3), 115-134 (2015).
  7. Organ, L., et al. Structural and functional correlations in a large animal model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. BMC Pulm Med. 15, 81 (2015).
  8. Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D. J., Chen, M., Murrell, J. M. Cloning and characterization of the bleomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces verticillus ATCC15003. J Nat Prod. 65 (3), 422-431 (2002).
  9. Yu, Z., et al. Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review. Curr Cancer Drug Targets. 16 (6), 509-521 (2016).
  10. Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
  11. Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
  12. Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
  13. Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PloS one. 7 (6), 39716 (2012).
  14. Stellari, F. F., et al. Enlightened Mannhemia haemolytica lung inflammation in bovinized mice. Vet Res. 45, 8 (2014).
  15. Tassali, N., et al. MR imaging, targeting and characterization of pulmonary fibrosis using intra-tracheal administration of gadolinium-based nanoparticles. Contrast Media Mol Imaging. 11 (5), 396-404 (2016).
  16. Ma, X., et al. Assessment of asthmatic inflammation using hybrid fluorescence molecular tomography-x-ray computed tomography. J Biomed Opt. 21 (1), 15009 (2016).
  17. Van de Velde, G., et al. Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume. Dis Model Mech. 9 (1), 91-98 (2016).
  18. Stellari, F. F., et al. Heterologous Matrix Metalloproteinase Gene Promoter Activity Allows In Vivo Real-time Imaging of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Transiently Transgenized Mice. Front Immunol. 8, 199 (2017).
  19. Hellbach, K., et al. X-ray dark-field radiography facilitates the diagnosis of pulmonary fibrosis in a mouse model. Sci Rep. 7 (1), 340 (2017).
  20. Zhou, Y., et al. Noninvasive imaging of experimental lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (1), 8-13 (2015).
  21. Ruscitti, F., et al. Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by Micro-CT correlates with histological evaluation in mice. Multidiscip Respir Med. 12, 8 (2017).
  22. Stellari, F., et al. Monitoring inflammation and airway remodeling by fluorescence molecular tomography in a chronic asthma model. J Transl Med. 13, 336 (2015).
  23. . . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed. , (2011).
  24. Meganck, J. A., Liu, B. Dosimetry in Micro-computed Tomography: a Review of the Measurement Methods, Impacts, and Characterization of the Quantum GX Imaging System. Mol Imaging Biol. , (2016).
  25. Hubner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples). BioTechniques. 44 (4), 507-514 (2008).
  26. King, T. E., Pardo, A., Selman, M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 378 (9807), 1949-1961 (2011).
  27. De Langhe, E., et al. Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography. PloS one. 7 (8), 43123 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

134vivoFMTCTMMPs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены