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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine nichtinvasive multimodale Bildgebung Ansatz basierend auf Mikro-CT und Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für längs-Beurteilung der Lunge Fibrose Mausmodell durch doppelte intratracheale Instillation von Bleomycin induziert.

Zusammenfassung

Idiopathischer Lungenfibrose (IPF) ist eine tödliche Lungenkrankheit zeichnet sich durch die fortschreitende und irreversible Zerstörung der Lunge Architektur, wodurch wesentlichen Verschlechterung der Lungenfunktion und anschließenden Tod durch Atemstillstand.

Die Pathogenese der IPF in experimentellen Tiermodellen hat von Bleomycin Verwaltung veranlasst. In dieser Studie untersuchen wir eine IPF-wie Maus-Modell durch eine doppelte intratrachealen Bleomycin Instillation induziert. Standard histologische Beurteilungen verwendet für das Studium der Lungenfibrose sind invasive terminal Verfahren. Das Ziel dieser Arbeit ist zu überwachen, Lungenfibrose durch nicht-invasive bildgebende Verfahren wie z. B. fluoreszierende Molekulare Computertomographie (FMT) und Micro-CT. Diese beiden Technologien validiert mit histologischen Befunde könnte einen revolutionäre funktionalen Ansatz für nicht-invasive Überwachung in Echtzeit von IPF krankheitschwierigkeit und Progression darstellen. Die Verschmelzung verschiedener Ansätze ist ein Schritt weiter für das Verständnis der IPF-Krankheit, wo der molekularen Ereignisse in einem pathologischen Zustand mit FMT beobachtet werden und die anschließende anatomischen Veränderungen von Mikro-CT überwacht werden kann

Einleitung

Idiopathischer Lungenfibrose (IPF) ist eine chronische Lungenerkrankung mit fortschreitende Abnahme der Lungenfunktion, die innerhalb von vier Jahren Diagnose1leider oft tödlich ist. Die wichtigsten Funktionen des IPF sind extrazelluläre Matrix Deposition und Fibroblasten-Proliferation, aber die Pathogenese ist noch nicht vollständig geklärt. Die meisten unterstützte Hypothese ist, dass mehrere Zyklen der Lunge Verletzungen verursachen die Zerstörung der alveolären Epithelzellen, das führt zur Veränderung der mesenchymalen Zellzyklus Proliferation, übertriebene Anhäufung von Fibroblasten und Myofibroblasts, und erhöhte Matrix Produktion. Mediatoren in diese Prozesse eingebunden, wie Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) Dysregulated Fibrose Entwicklung in menschlichen IPF oder Bleomycin-induzierte Tiermodelle gefunden wurden. Die unkontrollierte MMP Produktion führt zu eine unausgewogene Kollagen Ablagerung innerhalb der Lunge Interstitium und alveoläre Raum imitiert abnorme Wunde Reparatur1,2.

Eines der Haupthindernisse für die Wirkstoffforschung und -Entwicklung ist die Verfügbarkeit von zugänglich Mausmodelle, die menschlichen Pathogenese und der Krankheit Phänotyp zu imitieren. Verschiedene Mittel verwendet wurden, um Lungenfibrose in Tiermodellen zu induzieren: Bestrahlung Schaden, Verwaltung von Asbest und Kieselsäure, Verwaltung von fibrinogenic Zytokinen und Bleomycin3,4; Bleomycin ist die am häufigsten verwendete bei Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Hamster, Kaninchen5 oder große Tiere (Primaten, Pferde, Hunde und Wiederkäuer)6,7. Bleomycin ist ein Antibiotikum, das von dem Bakterium Streptomyces Verticillus8 gemacht und dient als ein Anti-Krebsmittel-9. Lungenfibrose ist eine häufige Nebenwirkung des Medikaments und aus diesem Grund, es wird zur experimentellen Tiermodellen pulmonalen Fibrose induzieren.

In Lunge Bleomycin-induzierten Fibrose Modelle auftreten die fibrotischen Läsionen 14-21 Tage nach Bleomycin Verwaltung. In der vorliegenden Arbeit haben wir ein neues Protokoll zu Lungenfibrose bei Mäusen durch doppelte Bleomycin intratracheale Instillation induzieren. Die Bleomycin-Maus-Modell ist sehr zeitaufwendig, da neue Medikamente müssen auf etablierten fibrotische Läsionen bewertet werden und getestet, um ihre Anti-fibrotische Effekte von Anti-inflammatorische Effekte zu unterscheiden.

Biochemische Bestimmung der kollagengehalt, morphometrischen und histologische Analyse basierten auf Post-Mortem-Analyse, die Möglichkeit, die Pathogenese der Krankheit im gleichen Tier folgen zu begrenzen. Obwohl dieser Parameter einen Gold-Standard für Fibrose Bewertung galten, sie nicht bieten zeitliche oder räumliche Verteilung der fibrotische Läsion und schließt eine Möglichkeit, den Prozess des Fortschreitens der Krankheit zu untersuchen. 10

Vor kurzem, nicht-invasiven bildgebende Verfahren angewandt worden, um Monitor Umbau Atemwege, Entzündung und Fibrose Fortschreiten in murinen Modellen: Magnetic Resonance Imaging (MRI), Micro-Computer-Tomografie (Micro-CT), molekularen Fluoreszenz Tomographie (FMT) und Biolumineszenz (BLI)11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21. Wir schlagen einen nicht-invasive bildgebenden Ansatz zur Lunge Fibrose Fortschreiten von FMT und Mikro-CT zu verschiedenen Zeitpunkten nach einem Bleomycin fordern22längs zu überwachen.

Viele Wege sind beteiligt an der Gründung und Entwicklung der Fibrose, und es ist nicht viel bekannt. Nur ein tieferes Verständnis dieser Prozesse kann zu mehr Drogeziele übersetzen, die in die Klinik übertragen kann. Die Möglichkeit, längs MMP Aktivierung durch Fluoreszenz Molekulare Computertomographie gekoppelt an die Erkennung von Lungenkrebs parenchymatösen Veränderungen von Mikro-CT überwachen könnte in Zukunft das klinische Ansprechen auf die Behandlung Zugriff auf verwendet werden.

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Protokoll

Alle Tierversuche, die hierin beschriebenen wurden genehmigt vom intramural Tierschutz Komitee für Tierversuche Chiesi Farmaceutici und ERASMUS MC unter Protokollnummer: EMC 3349 (138-14-07) Einhaltung der Europäischen Richtlinie 2010/63-UE Italienische D.Lgs 26/2014 und dem überarbeiteten "Guide for the Pflege und Verwendung von Laboratory Animals"23.

Hinweis: Vor Gebrauch, weibliche Inzucht C57Bl/6 (7-8 Wochen alt) Mäuse wurden akklimatisiert für mindestens 7 Tage zu den lokalen Vivarium Bedingungen (Raumtemperatur: 20-24 ° C; Relative Luftfeuchtigkeit: 40-70 %; 12-h-Hell-Dunkel-Zyklus), den freien Zugang zu standard Nagetier Chow und enthärtetes Wasser aus dem Wasserhahn.

1. Intratrachealen Behandlung von Mäusen mit Bleomycin

  1. Bereiten Sie die Ausrüstung für die Intra-trachealen Instillation12,13,14.
  2. Setzen Sie die Mäuse in der Narkose Kammer verbunden mit einer Isofluran Vaporizer mit 2,5 % mit Sauerstoff gemischt gesetzt. Für die Tiefe der Narkose durch das Fehlen einer Zehe-Prise Antwort überprüfen. Die Wirkung der Narkose ereignete sich nach 3-5 min.
  3. Positionieren Sie die narkotisierten Maus auf die Intubation Plattform, seidenen seine Schneidezähne auf dem Draht gelegt.
  4. Schalten Sie das Laryngoskop, nehmen ein paar stumpfe Pinzette endete und verwenden Sie die Zange oder Laryngoskop Tipp um sanft den Mund zu öffnen.
  5. Ziehen Sie die Zunge heraus und halten Sie ihn auf die Seite mit der Pinzette. Setzen Sie das Laryngoskop-Messer in Richtung der Rückseite des Mundes, bis die Öffnung der Luftröhre visualisiert wird und bewahren Sie das Laryngoskop.
  6. Legen Sie mit der anderen Hand die Lieferung Schlauch mit dem Ende der PE-Schlauch in der Luftröhre, drehen die drei-Wege-Ventil verbunden. 50 µL von Bleomycin (0,020 µg/Maus) zu liefern. Nach Instillation schnell zu entfernen das Rohr von der Luftröhre zu ersticken zu verhindern. Halten Sie die Mäuse für ein paar Sekunden aufrecht.
    1. Verwalten von Bleomycin Intratracheally am Tag 0 und wiederholen Sie am Tag 4 (Abbildung 1).
  7. Entfernen Sie die Maus von der Intubation Plattform und überwachen Sie die Maus für 30 min (die Zeit benötigt, um vollständig aus der Narkose zu erholen).
  8. Führen Sie die in-Vivo Bildgebung der Mäuse Lunge von FMT und Mikro-CT nach doppelten Bleomycin Instillation am Tag 7, 14 und 21.

2. in-Vivo Bildgebung durch molekulare Computertomographie Fluoreszenz

Hinweis: Im voraus, bereiten Sie eine frische Stammlösung von 6 Nmol/mL MMP sensible fluoreszierende Substrat 680 in Kochsalzlösung (0,9 % Natriumchlorid) und Store lichtgeschützt bei 4 ° C vor dem Gebrauch. Es ist stabil für bis zu 6 Monate bei 4 ° C. MMP imaging-Agent auf Raumtemperatur equilibrate vor der Injektion in die Tiere zu ermöglichen.

  1. Sonde-Injektion
    1. Bereiten Sie die Ausrüstung für die intravenöse Injektion von MMP-Sonde-Lösung. Pre-warmes Wasser bei 50 ° C, die Maus-Rute zu heizen.
    2. Um das Maus-Genick fest greifen, nehmen sie am Schwanz und lassen sie den Käfig Deckel greifen. Halten Sie die Mäuse über das Tier Schultern, setzen Sie die Rute in einer warmen Wasserbecher für 4 bis maximal 8 s thermische Schädigung, thermische Schädigung der Rute Haut zu verhindern.  Überprüfen Sie die Adern Schwellung einfacher Visualisierung und Nadel einsetzen.
    3. Während der Injektion setzen Sie die Mäuse in ein Kunststoff Restrainer halten es ruhig und ziehen das Ende durch ein spezielles Loch in den Rücken. Finden Sie die beiden kaudalen Venen auf beiden Seiten der Rute; nicht die Arterie auf der Unterseite der Rute.
    4. Stechen Sie die Nadel (26G) von 1 mL Spritze in die Vene. Wenn die Nadel korrekt platziert ist, Injektion wird einfach sein, und die Sonde Lösung wird in das Gefäß fließen.
    5. Spritzen Sie die MMP Sonde Lösung 10 mL/kg.
    6. Entsorgen Sie die Nadel.
      Hinweis: Die optimale Bildgebung Zeitpunkt ist 24 h nach der MMP-Sonde-Injektion, da ist der Zeitaufwand durch die Sonde aktiviert werden. Wenn Langzeitstudien durchgeführt werden, ist die optimale Re-Injektion Zeit 7 Tage, wodurch für die komplette Abheilung des Agenten von der Maus.
  2. FMT-Bildgebung
    Hinweis: Bevor Sie beginnen, entfernen Sie immer das Fell auf und rund um die Bereiche des Tieres, die abgebildet werden, in diesem Fall die Brust, Streuung und Absorption im Gewebe zu vermeiden sollen.
    1. Um die Maus zu betäuben, steckte es in Narkose Kammer und drehen Sie die Wählscheibe Isofluran auf 2,5 % für die Induktion und 2 % für die Wartung.
    2. Initialisieren Sie die Datenerfassungs-Software und öffnen Sie eine neue Studie in der Datenbank für das Experiment.
    3. Übertragen Sie bevor Sie die Bildgebung mit FMT die Maus in die bildgebenden Kassette. Platzieren Sie die narkotisierten Maus in der Mitte imaging Kassette um das Sichtfeld der FMT optimal zu nutzen. Halten Sie die Mäuse flach, sicher und sanft komprimiert gegen beide Fenster der bildgebenden Kassette. Passen Sie die Höhe von Knöpfen an der Kassette, und schieben Sie es in die Docking-Station.
    4. Klicken Sie auf Thema im Scanfenster und klicken Sie auf Vorschau , um das live-Bild zu sehen.
    5. Zeichnen Sie die Scan-Region ausreichend groß, so dass Gewebe rund um den erwarteten Bereich der Fluoreszenz erfasst wird. Einschließlich eine Gesamtmenge von 25 Scan Punkte Garantien werden die Lunge Region komplett gescannt.
    6. Nachdem der ROI gezeichnet ist, klicken Sie zunächst zur Rekonstruktion Warteschlange hinzufügen und klicken Sie dann auf Durchsuchen , um die Maus Bild. Stellen Sie sicher, dass der richtige Laser bei 680 nm ausgewählt ist.
    7. Wenn die Bildaufnahme abgeschlossen ist, platzieren Sie den Mauszeiger wieder in seinen Käfig. Achten Sie darauf, dass es vollständig aus der Narkose erholt.
    8. Quantifizierung der Picomoles der Fluoreszenz im Analyse -Fenster der Analyse-Software mit dem ROI-Tool und reduzieren den ROI um 700-800 mm3 auf das Signal aus der Lunge-Region. Achten Sie darauf, um die Leber Signal auszuschließen. Kopieren Sie den ROI auf die anderen Fächer haben sie ähnliche Dimension und passen ihre Position in jedem Tier Bild.
    9. Exportieren Sie Bilder als Jpg-Dateien.

3. in-Vivo Bildgebung von Mikro-CT

Achtung: Bevor Sie beginnen, immer entfernen Sie alle Metallschmuck oder metallische Gegenstände in der Nähe der imaging-Bereich, um Streuung von Röntgenstrahlen zu vermeiden.

Hinweis: Strahlung induzierten Lungenfibrose ist ein häufiger Befund während der Bestrahlung Lunge Verletzungen24induziert. Micro-CT abgeleitete Indizes weder histologische Befunde mit Lungenfibrose verbunden waren in Kochsalzlösung behandelten kontrollmäusen am Tag 21 unterzogen vier Mikro-CT imaging-Sitzungen, was darauf hinweist, dass die Strahlendosis in Mikro-CT an die Tiere geliefert Untersuchungen war nicht ausreichend, um die Ergebnisse zu beeinflussen.

  1. Schalten Sie die Mikro-CT durch drücken die grüne Power -Taste und starten Sie die Software zum Aufwärmen der Röntgenquelle. Verwenden Sie die kleine Bohrung und das Tier Bett für Mäuse imaging.
  2. Erstellen Sie die Datenbank, indem Sie auf neue Datenbank für eine neue und bauen den Browser basierend auf der Anzahl von Mäusen im Experiment, oder klicken Sie auf eine Verbindung zu vorhandenen Datenbank zum Speichern der Daten auf eine zuvor erstellte.
  3. Bevor Sie beginnen, das Scannen, wählen Sie die Aufnahmeparameter im Kontrollfenster Software: x-ray röhrenspannung, 90 kV; CT Röntgen Röhrenstrom, 160 µA; Leben Sie Röntgenröhre Strom, 80 µA; FOV, 36 mm; Keine gating Technik; Scan-Technik, hohe Auflösung 4 min.
  4. Betäuben Sie die Mäuse durch das Einatmen von 3 % Isofluran zu, und legen Sie sie auf dem Bett in die Bohrung mit einem Prüfkopf eine konstante Versorgung mit Betäubung eingesetzt. Immobilisieren Sie die Pfoten der Mäuse mit Klebeband auf dem Bett, um die Brust ausgesetzt sein können.
  5. Schieben Sie die Instrument-Tür und schalten Sie den Live-Modus , die Position des Mauszeigers in Echtzeit zu sehen, durch Drücken der Schaltfläche "aufzeichnen". Bewegen Sie das Tiere Bett auf die Brust das Sichtfeld (FOV) mit den Tasten befindet sich direkt auf das CT-Gerät ausrichten. Zentrieren Sie den Scan auf der Maus; Wenn nicht, passen Sie die Position mit Links und rechts Pfeile auf dem CT-Gerät.
  6. Bestätigen Sie optimale Bett Position durch Drehen der gantrys durch Auswahl von 90 ° und klicken Sie auf festlegen. Stellen Sie sicher, dass die Region um Bild vollständig in das Blickfeld.
  7. Nicht wenden Sie jede gating Technik an, und starten Sie den Scanvorgang mit dem CT-Scan Button. Klicken Sie auf Ja auf die Nachricht, die darüber informiert, dass die Röntgenquelle eingeschaltet wird.
    Hinweis: Sobald der Röntgenstrahlung eingeschaltet sind, leuchtet die orange Lampe auf der Oberseite des Instruments und die Schiebetür wird unmöglich sein, für die Sicherheit des Bedieners zu öffnen. Sobald der Scan beendet ist, erscheint ein neues Fenster für die 2D Viewer-Software zeigt die 2D-Einzelschicht, koronal und sagittaler Schnitt des Wiederaufbaus.
  8. Überprüfen Sie die Bildqualität und achten Sie nicht darauf, Bilder von Bewegungen durch das niedrige Niveau der Anästhesie verwischt haben. Falls erforderlich, wiederholen Sie den Scan.
  9. Platziere die Tiere zurück in den Käfig und sicher sein, dass sie vollständig aus der Narkose zu erholen.

4. alvéolaire Lavage

  1. Tiere mit 3 % Isofluran und Opfer von Blutungen aus der bauchschlagader zu betäuben.
  2. Setzen Sie den Brustkorb und Hals mit einer Schere. Dann setzen Sie die Luftröhre und machen Sie einen kleinen Schnitt ermöglicht das BAL-Verfahren mit einem 21-Gauge Lavage Schlauch befestigt, eine 1 mL Spritze ohne Nadel durchgeführt werden. Achten Sie nicht auf die Luftröhre durchtrennt.
  3. Um die BAL durchzuführen, füllen Sie 1 mL Spritze ohne Nadel mit 0,6 mL sterile Lösung [10 X Hank ausgewogen Salzlösung (HBSS); 100 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA); 1 mM 4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazineethansulphonic Säure (HEPES); destilliert Wasser].
  4. Die Lavage Schlauch in die Inzision in der Luftröhre und langsam injizieren und zurückziehen der Lösung 3 Mal anhalten zum dritten Ausstieg um optimale Sammlung von BALF für spätere Analysen zu ermöglichen.

5. Histologie und Histomorphometrie

  1. Setzen Sie aus und entfernen Sie Lungen aufzublähen mit einer Kanüle durch die Luftröhre durch sanfte Infusion mit 0,6 mL 10 % Neutral gepufferte Formalin zu und speichern Sie die Proben bei Raumtemperatur für 24 h.
  2. Entwässern Proben durch verschiedene Passagen in steigenden Konzentrationen von Alkohol-Lösungen (60 % Ethanol für 1 h, 70 % Ethanol zu 95 % igem Ethanol für 2 h, 1 h, 90 % Ethanol für 1 h und 100 % Ethanol für 2 h) mit einer automatischen Gewebe-Prozessor.
  3. Legen Sie Proben in Xylol 2 h, durchscheinend zu machen. Am Ende der Dehydrierung Proben in Paraffin bei 60 ° C für 3 h zu infiltrieren und eingebettet in die automatisierte Prozessor.
  4. Erhalten Sie 5 µm dicken Schnittserien mit einem rotierenden Mikrotom.
  5. Deparaffinize und Folien in absteigende Noten von Ethanol zu rehydrieren und Flecken mit Masson Trichrome mit einer automatischen Gewebe-Prozessor.
  6. Manuell fokussieren Sie Lunge Scheiben, mit 20 X Vergrößerung mit einem Diascanner Scannen und Aufnahmen Sie digitale der gesamten Lunge Abschnitte mit den Anzeige-Software mit einer Auflösung von 451 nm/Pixel.
  7. Bewerten Sie morphologisch fibrotische Lungenschädigung durch semi-quantitativen und qualitativen Parameter wie folgt:
    1. Die Ashcroft Partitur zu bestimmen. Semi-quantitativ Grade morphologische Veränderungen in der Lunge Abschnitte anhand der Skala definiert durch Ashcroft10 geändert durch Hübner Et al. 25 verwenden das System von 0-8 Punkte das Parenchym in den Abschnitten der Lunge zu beurteilen.
    2. Bestimmen der kollagengehalt. Quantifizieren Sie den Grad der Fibrose10,25 durch das Mikroskop Bildanalyse-Software. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip drei ROIs bei 10facher Vergrößerung, pro jede Folie. Erkennen Sie durch die Standardisierung von Farbeinstellungen Schwelle das Kollagen als grün gefärbten Bereich.
    3. Bestimmen Sie die alveoläre Open-Air-Bereich. Quantifizieren der alveolären Open-Air-Bereich als indirekte Parameter der Fibrose10,25. Erkennen Sie durch die gleiche Software und ROIs die Fibrose-Fraktion beantragt den Luft-Bereich innerhalb des ROIs mit einer weißen Schwelle.

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Ergebnisse

Spontane Auflösung der Lunge Fibrose Läsionen beobachtet drei Wochen, nachdem einzelne Bleomycin Verwaltung und moderate strukturelle Veränderungen die Grenzen dieses Modells markieren. Nur vorbeugende Behandlung konnte wegen der engen therapeutischen Fenster ausgeführt werden, die keine klinischen Praxis17darstellt.

Hier zeigen wir, dass unser Protokoll der doppelten Bleomycin intratracheale Instilla...

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Diskussion

Trotz vielen Forschungsgruppen mit Schwerpunkt auf der Entwicklung neuer Medikamente zur Behandlung von IPF im Moment sind nur zwei für Patienten zur Verfügung. Es muss dringend medizinische wirksamer Therapien7 weil finden nur Lunge Transplantationis in der Lage zu überleben von 4-5 Jahren26verlängern. Die wesentliche Voraussetzung für Translationale Medizin und Entwicklung neuer Medikamente ist die Verfügbarkeit von einem Tiermodell, die imitiert die Merkmalen des I...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenskonflikte.

Danksagungen

Die Autoren möchten Dr. Daniela Pompilio und Roberta Ciccimarra für technische Hilfe zu danken.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
FMT 2500 Fluorescence Tomography SystemPerkin Elmer Inc.Experimental Builder
MMPsense 680Perkin Elmer Inc.NEV10126Protect from light, store the probe at 4 °C
TrueQuant softwarePerkin Elmer Inc.
Female inbred C57BL/6San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD), Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
IsofluraneESTEVE spa571329.8Do not inhale
Automated cell counterDasit XT 1800JExperimental Builder
Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl)Eurospital15A2807
Quantum FX Micro-CT scanner Perkin Elmer Inc.
Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus Sigma B2434 
Automatic tissue Processor ATP700 Histo-Line LaboratoriesATP700 
Embedding system EG 1160 Leica BiosystemsEG 1160
Rotary microtome Slee Cut 6062
Digital slide scanner NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics
NIS-AR image analysis software Nikon
Masson’s Trichrome StainingHisto-Line Laboratories
10% neutral-buffered formalinSigmaHT5012-1CS
Penn-century model DP-4M Dry power insufflatorPenn-centuryDPM-EXT
PE190 micro medical tubing2biological instruments sncBB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mLTerumoSS*05SE1Cut the boards of the piston by scissors
Hamilton 0.10 mL (model 1710)Gastight81022
Discofix 3-way StopcockBraun4095111
Syringe with needle 1 mLPic solution3,071,260,300,320Use without needle
Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm2biological instruments sncFTP-18-50Cut obliquely the tip 

Referenzen

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