Un Multimodal Imaging approccio basato su Micro-CT e fluorescenza molecolare tomografia per valutazione longitudinale della fibrosi polmonare indotta da bleomicina in topi

Riepilogo

Descriviamo un multimodali non invasive imaging approccio basato su Micro-CT e fluorescenza molecolare tomografia per valutazione longitudinale del modello di fibrosi del polmone del topo indotto mediante instillazione intratracheale doppia di bleomicina.

Abstract

Fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è una malattia polmonare mortale caratterizzata dalla distruzione progressiva e irreversibile dell'architettura polmonare, che provoca il deterioramento significativo nella funzione polmonare e la successiva morte da guasto respiratorio.

La patogenesi della IPF in modelli sperimentali animali è stata indotta tramite la somministrazione di bleomicina. In questo studio, indaghiamo su un modello di topo IPF-come indotto da un'instillazione di bleomicina endotracheale doppia. Valutazioni istologiche standard usate per lo studio della fibrosi polmonare sono procedure invasive terminale. L'obiettivo di questo lavoro è quello di monitorare la fibrosi polmonare attraverso tecniche di imaging non invasive come tomografia molecolare fluorescente (FMT) e Micro-CT. Queste due tecnologie convalidate con i risultati di istologia potrebbero rappresentare un rivoluzionario approccio funzionale per tempo reale il monitoraggio non invasivo della progressione e della severità di malattia IPF. La fusione di diversi approcci rappresenta un ulteriore passo avanti per la comprensione della malattia IPF, dove gli eventi molecolari che si verificano in una condizione patologica possono essere osservati con FMT e i successivi cambiamenti anatomici possono essere monitorati da Micro-CT.

Introduzione

Fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è l'affezione polmonare cronica con progressiva diminuzione delle funzioni polmonari che purtroppo è spesso fatale entro quattro anni dalla diagnosi¹. Le caratteristiche principali di IPF sono deposizione di matrice extracellulare e la proliferazione dei fibroblasti, ma la patogenesi non è ancora pienamente compreso. L'ipotesi più sostenuto è che i cicli multipli di lesioni polmonari causano la distruzione delle cellule epiteliali alveolari che conduce alla alterazione della proliferazione ciclo delle cellule mesenchimali, esagerato accumulo di fibroblasti e miofibroblasti, e produzione aumentata della matrice. Mediatori coinvolti in questi processi come metalloproteinasi della matrice (MMPs) sono stati trovati dysregulated nello sviluppo di fibrosi IPF umano o in modelli animali indotta da bleomicina. La produzione di MMP incontrollata conduce ad una deposizione di collagene sbilanciato all'interno dell'interstizio del polmone e dello spazio alveolare, imitante la ferita anormale riparazione^1,2.

Uno dei principali ostacoli per drogare scoperta e sviluppo è la disponibilità di modelli murini accessibile che imitano la patogenesi umana e il fenotipo della malattia. Diversi agenti sono stati usati per indurre fibrosi polmonare in modelli animali: danni di irradiazione, la somministrazione di amianto e silice, somministrazione di citochine fibrinogenic e bleomicina^3,4; Tuttavia la bleomicina è il più usato in topi, ratti, cavie, criceti, conigli⁵ o in animali di grossa taglia (primati non umani, cavalli, cani e ruminanti)^6,7. Bleomicina è un antibiotico fatto dal batterio Streptomyces verticillus⁸ e viene utilizzato come un agente anti-cancro⁹. La fibrosi polmonare è un comune effetto collaterale del farmaco e per questo motivo, è usato nei modelli animali sperimentali per indurre fibrosi polmonare.

Nei modelli di fibrosi polmonare indotta da bleomicina, le lesioni fibrotiche verificano 14-21 giorni dopo la somministrazione di bleomicina. Nei lavori presentati, abbiamo usato un nuovo protocollo per indurre fibrosi polmonare in topi mediante instillazione intratracheale doppia bleomicina. Modello del topo di bleomicina è richiede molto tempo perché i nuovi farmaci devono essere valutati su lesioni fibrotiche stabilite e testato per distinguere i loro effetti anti-fibrotici da effetti antinfiammatori.

Biochimici determinazione del contenuto di collagene, morphometrical e analisi istologica erano basati su analisi di post mortem, limitando la possibilità di seguire la patogenesi della malattia nello stesso animale. Anche se questi parametri sono stati considerati un gold standard per la valutazione della fibrosi, non fornire qualsiasi distribuzione temporale o spaziale della lesione fibrotica e precludono un modo per indagare il processo di progressione di malattia. ¹⁰

Recentemente, sono state applicate tecnologie di imaging non invasivo monitor vie respiratorie che ritoccano, infiammazione e progressione della fibrosi in modelli murini: Imaging a risonanza magnetica (MRI), tomografia del calcolatore Micro (Micro-CT), fluorescenza molecolare Tomografia (FMT) e bioluminescenti (BLI)^{11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21}. Noi proponiamo un approccio di imaging non invasivo per monitorare longitudinalmente la progressione della fibrosi polmonare da FMT e Micro-CT a diversi intervalli di tempo dopo un bleomicina sfida²².

Molte vie sono coinvolti nella creazione e sviluppo di fibrosi, e non si sa molto. Solo una più profonda comprensione di questi processi potrebbe tradurre a più bersagli farmacologici che possono trasferire in clinica. La possibilità di monitorare longitudinalmente l'attivazione MMP tramite tomografia molecolare fluorescenza accoppiata alla rilevazione di cambiamenti parenchimatica del polmone da Micro-CT potrebbe essere utilizzata in futuro per accedere la risposta clinica al trattamento.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti nel presente documento sono stati approvati dal Comitato intramurale di benessere degli animali per la sperimentazione animale di Chiesi Farmaceutici ed ERASMUS MC sotto numero di protocollo: EMC 3349 (138-14-07) conforme alle europee direttiva 2010/63 UE, Italiano d. Lgs 26/2014 e la rivista "Guida per la cura e uso di animali da laboratorio"²³.

Nota: Prima dell'uso, topi inbred femminili di C57Bl/6 (7-8 settimane) sono stati acclimatati per almeno 7 giorni per le condizioni locali Vivario (temperatura ambiente: 20-24 ° C, umidità: 40-70%; ciclo luce-buio di 12 h), avendo libero accesso al cibo del roditore standard e acqua del rubinetto addolcita.

1. intratracheale trattamento dei topi con bleomicina

1. Preparare l'attrezzatura per l'instillazione endotracheale^12,13,14.
2. Mettere i topi in camera di anestetico collegata a un vaporizzatore di isoflurane fissato a 2,5% mescolato con ossigeno. Verifica per la profondità dell'anestesia dalla mancanza di una risposta di punta-pizzico. L'effetto dell'anestesia si è verificato dopo 3-5 min.
3. Posizionare il mouse anestetizzato sulla piattaforma intubazione, appeso da suoi incisivi collocati sul filo.
4. Attivare il laringoscopio, prendere un paio di pinze si è conclusa smussate e utilizzare il forcipe o suggerimento di laringoscopio per aprire delicatamente la bocca.
5. Tirare fuori la linguetta e tenerlo al lato con il forcipe. Inserire la lama del laringoscopio verso la parte posteriore della bocca fino a quando non viene visualizzato all'apertura della trachea e mantenere il laringoscopio in luogo.
6. Con l'altra mano, inserire il tubo di mandata collegato all'estremità del tubo PE nella trachea, ruotare la valvola a tre vie. Consegnare 50 µ l di bleomicina (0.020 µ g/topo). Dopo l'instillazione, rimuovere rapidamente il tubo dalla trachea per evitare il soffocamento. Tenere i topi in posizione verticale per pochi secondi.
   1. Amministrare la bleomicina vari al giorno 0 e ripetere al giorno 4 (Figura 1).
7. Rimuovere il mouse dalla piattaforma intubazione e monitorare il mouse per 30 minuti (il tempo necessario per recuperare completamente dall'anestesia).
8. Eseguire in vivo imaging dei polmoni di topi da FMT e Micro-CT dopo instillazione di bleomicina doppia al giorno 7, 14 e 21.

2. in vivo Imaging di fluorescenza molecolare tomografia

Nota: In anticipo, preparare una soluzione stock fresca di 6 nmol/mL di MMP fluorescente substrato sensibile 680 in soluzione fisiologica (sodio cloruro 0,9%) e archivio protetto dalla luce a 4 ° C prima dell'uso. È stabile fino a 6 mesi a 4 ° C. Consentire MMP imaging agente stabilizzare a temperatura ambiente prima di iniettare in animali.

1. Sonda di iniezione
   1. Preparare l'attrezzatura per l'iniezione endovenosa della soluzione sonda MMP. Pre-riscaldare l'acqua a 50 ° C per riscaldare la coda di topo.
   2. Per afferrare saldamente la collottola del mouse, prendilo per la coda e consentirle di afferrare il coperchio di gabbia. Tenendo i mouse attraverso le spalle dell'animale, mettere la coda in un bicchiere di acqua tiepida, per 4 alla massima ferita termica 8 s per prevenire lesioni termiche alla pelle della coda.  Controllare le vene gonfiore per più facile visualizzazione ed inserimento dell'ago.
   3. Durante la procedura di iniezione, messo i topi in un dispositivo di ritenuta in plastica per tenerlo fermo e tirare la coda attraverso un apposito foro nella parte posteriore. Trovare le due vene caudale su entrambi i lati della coda; non l'arteria sul lato inferiore della coda.
   4. Inserire l'ago (26G) della siringa 1 mL nella vena. Se l'ago è posizionato correttamente, iniezione sarà facile e la soluzione della sonda fluirà nel recipiente.
   5. Iniettare la soluzione di sonda MMP a 10 mL/kg.
   6. Smaltire l'ago.
      Nota: Il punto ottimale di tempo imaging è 24 h dopo l'iniezione di sonda MMP perché è il tempo richiesto dalla sonda deve essere attivato. Se vengono eseguiti studi longitudinali, il tempo di re-iniezione ottimale è 7 giorni, che permette per la distanza completa dell'agente dal mouse.
2. Formazione immagine FMT
   Nota: Prima di iniziare, rimuovere sempre la pelliccia su ed intorno alle zone dell'animale che sono essere imaged, in questo caso il petto, per evitare la dispersione e l'assorbimento nel tessuto.
   1. Per anestetizzare il mouse, metterlo nella camera anestetico e girare il quadrante di isoflurane al 2,5% per induzione e 2% per la manutenzione.
   2. Inizializzare il software di acquisizione dati e aprire un nuovo studio nel database per l'esperimento.
   3. Prima di iniziare l'imaging con FMT, trasferire il mouse nel cassetto imaging. Posizionare il mouse anestetizzato nel mezzo di cassette per utilizzare in modo ottimale il campo di vista di FMT di imaging. Proteggere i topi, piatto e delicatamente compresso contro entrambe le finestre della cassetta imaging. Regolare l'altezza di manopole della cassetta e quindi farla scorrere nell'alloggiamento.
   4. Clicca sull' oggetto nella finestra scansione e fare clic su Anteprima per vedere l'immagine dal vivo.
   5. Disegnare la regione di scansione sufficientemente grande in modo che dei tessuti che circondano l'area prevista di fluorescenza sono catturato. Compreso un totale di scansione 25 punti garanzie della regione polmonare sarà totalmente digitalizzata.
   6. Una volta che il ROI è disegnato, in primo luogo fare clic su Aggiungi alla coda di ricostruzione e quindi fare clic su Scan per realizzare l'immagine del mouse. Assicurarsi che il laser corretto a 680 nm è selezionata.
   7. Quando viene completata l'acquisizione dell'immagine, posizionare il mouse indietro nella sua gabbia. Sia sicuro che completamente recupera dall'anestesia.
   8. Quantificare i picomoli di fluorescenza nella finestra di analisi del software di analisi utilizzando lo strumento ROI e ridurre il ROI intorno a 700-800 mm³ sul segnale proveniente dalla regione del polmone. Fare attenzione a escludere il segnale del fegato. Copiare il ROI su altri soggetti per averli simili in dimensione e regolare la loro posizione in ogni immagine animale.
   9. Esportare le immagini come file jpg.

3. in Vivo Imaging dal Micro-CT

Attenzione: Prima di iniziare, rimuovere sempre qualsiasi metallo gioielli o oggetti di metallo vicino l'area di imaging, per evitare la dispersione di raggi x.

Nota: Fibrosi polmonare indotta da radiazioni è che un'individuazione comune durante la radiazione indotta del polmone lesioni²⁴. Micro-CT derivato indici né i risultati istologici associati a fibrosi del polmone erano presenti nei topi di controllo trattati salino il giorno 21 sottoposto a Micro-CT quattro sessioni di imaging, che indica che la dose di raggi x consegnato agli animali durante la Micro-CT gli esami non era sufficiente per influenzare i risultati.

1. Accendere il Micro-CT premendo il pulsante verde di alimentazione e avviare il software per scaldare la sorgente di raggi x. Utilizzare il foro piccolo e il letto animale per topi di imaging.
2. Creare il database facendo clic su nuovo database per una nuova e costruire il browser basato sul numero di topi nell'esperimento, o fare clic sul collegamento a database esistente per salvare i dati a uno creato in precedenza.
3. Prima di iniziare la scansione, selezionare i parametri di acquisizione nella finestra di controllo del software: tensione di tubo di raggi x, 90 kV; Corrente del tubo di raggi x CT, 160 µA; Vivere attuale, tubo a raggi x 80 µA; FOV, 36 mm; Nessuna tecnica gating; Risoluzione di scansione elevata tecnica, 4 min.
4. Anestetizzare i topi da inalazione di 3% isoflurane e metterli sul letto inserito nel foro con un cono di naso permettendo un rifornimento costante di anestetico. Immobilizzare le zampe dei topi con nastro sul letto per consentire al petto di essere esposti.
5. Far scorrere la porta strumenti e attivare la Modalità Live per vedere la posizione del mouse in tempo reale premendo il tasto di acquisizione. Spostare il letto animale per allineare il petto con il campo visivo (FOV) utilizzando i pulsanti situati direttamente sullo strumento CT. Centro la scansione del mouse; in caso contrario regolare la posizione con le frecce destra e sinistra, che si trova sullo strumento CT.
6. Confermare la posizione ottimale letto ruotando il cavalletto selezionando 90 ° e facendo clic su imposta. Assicurarsi che la regione di immagine è completamente dentro il FOV.
7. Non applicare alcuna tecnica gating e avviare la scansione facendo clic sul pulsante di esplorazione di CT . Fare clic su Sì per il messaggio che informa che la sorgente di raggi x si accende.
   Nota: Una volta che i raggi x sono attivati, si illuminerà la spia arancione sulla parte superiore dello strumento e la porta scorrevole sarà Impossibile aprire per la sicurezza dell'operatore. Quando la scansione è terminata, appare una nuova finestra del software visualizzatore 2D mostrando il transaxial, coronale e sagittale fetta della ricostruzione.
8. Controllare la qualità dell'immagine ed essere sicuri di non avere immagini dai movimenti a causa del basso livello di anestesia sfocate. Se necessario, ripetere la scansione.
9. Mettete gli animali in gabbia ed essere sicuri che riprendersi completamente da anestesia.

4. lavaggio broncoalveolare

1. Anestetizzare gli animali con 3% isoflurane e sacrificio da spurgo dall'aorta addominale.
2. Usare le forbici per esporre la gabbia toracica e del collo. Quindi esporre la trachea e praticare una piccola incisione per consentire la procedura di BAL deve essere eseguito con un tubo di lavaggio 21-manometro collegato a una siringa da 1 mL senza ago. Prestare attenzione a non tagliare attraverso la trachea.
3. Per eseguire il BAL, riempire la siringa da 1 mL senza ago con 0,6 mL di soluzione sterile [di 10 x Hank equilibrata soluzione salina (HBSS); l'acido etilendiamminotetracetico 100mm (EDTA); 1 millimetro di acido 4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazineethansulphonic (HEPES); distillato acqua].
4. Inserire il tubo di lavaggio nell'incisione nella trachea e iniettare lentamente e aspirare la soluzione 3 volte, soffermandosi sul terzo ritiro per consentire la raccolta ottima di BALF per la successiva analisi.

5. istologia e istomorfometria

1. Esporre e rimuovere i polmoni, li gonfiare con una cannula attraverso la trachea da infusione delicata con 0,6 mL di formalina neutra tamponata al 10% e conservare i campioni a temperatura ambiente per 24 h.
2. Disidratare campioni attraverso diversi passaggi in aumento delle concentrazioni di soluzioni di alcool (etanolo al 60% per 1 h, etanolo al 70% per 1 h, 90% di etanolo per 1 h, etanolo al 95% per 2 h ed etanolo al 100% per 2 h) utilizzando un processatore automatico.
3. Posizionare gli esemplari in xilene per 2 h per renderli traslucido. Alla fine di disidratazione, infiltrarsi campioni in paraffina a 60 ° C per 3 h e incorporarli nel processore automatizzato.
4. Ottenere 5 µm spessore sezioni seriale utilizzando un microtomo rotativo.
5. Deparaffinizzare e reidratare diapositive nei gradi discendenti di etanolo e macchia con Trichrome di Masson utilizzando un processatore automatico.
6. Concentrarsi sulle fette di polmone, scansione a 20 ingrandimenti utilizzando un scanner per diapositive e catturare le immagini digitali delle sezioni del polmone intero utilizzando il software di visualizzazione con una risoluzione di 451 nm/pixel manualmente.
7. Morfologicamente valutare danno polmonare fibrotica dai parametri semi-quantitativa e quantitativi come segue:
   1. Determinare il Punteggio di Ashcroft. Semiquantitativo di grado i cambiamenti morfologici in sezioni del polmone secondo la scala definita da Ashcroft¹⁰ modificati da Hübner et al. ²⁵ uso il sistema di 0-8 Punteggio per valutare tutto il parenchima nelle sezioni del polmone.
   2. Determinare il contenuto di collagene. Quantificare il grado di fibrosi^10,25 dal software di analisi di immagine microscopio. Selezionare casualmente tre ROIs a 10 ingrandimenti, per ogni diapositiva. Standardizzazione delle impostazioni di soglia di colore, di rilevare il collagene come area verde tinto.
   3. Determinare l'Area di aria alveolare. Quantificare la zona di aria alveolare come parametro indiretto della fibrosi^10,25. Attraverso gli stessi software e ROIs applicato per la frazione di fibrosi, rilevare l'area di aria all'interno il ROIs utilizzando una soglia di bianca.

Risultati

La risoluzione spontanea delle lesioni fibrosi polmonare osservati tre settimane dopo la somministrazione di bleomicina singolo e moderati cambiamenti strutturali evidenziano i limiti di questo modello. Solo trattamento preventivo potrebbe essere effettuato dovuto la stretta finestra terapeutica che non rappresentano la pratica clinica¹⁷.

Qui, dimostriamo che il nostro protocollo di instillazione intratra...

Discussione

Nonostante molti gruppi di ricerca incentrati sullo sviluppo di nuovi farmaci per il trattamento di IPF, al momento solo due sono disponibili per i pazienti. C'è un urgente bisogno di mediche per trovare più efficaci terapie⁷ perché solo polmone transplantationis in grado di prolungare la sopravvivenza di 4-5 anni²⁶. Prerequisito essenziale per la medicina traslazionale e lo sviluppo di nuovi farmaci è la disponibilità di un modello animale che imita le caratteristiche...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
FMT 2500 Fluorescence Tomography System	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
MMPsense 680	Perkin Elmer Inc.	NEV10126	Protect from light, store the probe at 4 °C
TrueQuant software	Perkin Elmer Inc.
Female inbred C57BL/6	San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD),		Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
Isoflurane	ESTEVE spa	571329.8	Do not inhale
Automated cell counter	Dasit XT 1800J	Experimental Builder
Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl)	Eurospital	15A2807
Quantum FX Micro-CT scanner	Perkin Elmer Inc.
Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus	Sigma	B2434
Automatic tissue Processor	ATP700 Histo-Line Laboratories	ATP700
Embedding system	EG 1160 Leica Biosystems	EG 1160
Rotary microtome	Slee Cut 6062
Digital slide scanner	NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics
NIS-AR image analysis software	Nikon
Masson’s Trichrome Staining	Histo-Line Laboratories
10% neutral-buffered formalin	Sigma	HT5012-1CS
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator	Penn-century	DPM-EXT
PE190 micro medical tubing	2biological instruments snc	BB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mL	Terumo	SS*05SE1	Cut the boards of the piston by scissors
Hamilton 0.10 mL (model 1710)	Gastight	81022
Discofix 3-way Stopcock	Braun	4095111
Syringe with needle 1 mL	Pic solution	3,071,260,300,320	Use without needle
Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm	2biological instruments snc	FTP-18-50	Cut obliquely the tip