יחידנית או משולבת הדמיה גישה המבוססת על מיקרו-CT וקרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית להערכת האורך של ריאות הנגרמת Bleomycin פיברוזיס בעכברים

Summary

אנו מתארים הדמיה גישה המבוססת על מיקרו-CT וקרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית להערכת האורך של המודל פיברוזיס הריאות העכבר המושרה על ידי החדרה intratracheal כפול של bleomycin יחידנית או פולשני משולבת.

Abstract

Idiopathic פיברוזיס ריאתי (IPF) היא מחלת ריאות קטלנית המאופיינת על ידי הרס הריאה אדריכלות, אשר גורם משמעותי להידרדרות תפקודי ריאה ומוות עוקבות של כשל נשימתי הדרגתיים ובלתי הפיכים.

בפתוגנזה של IPF במודלים חייתיים ניסיוני יש נגרמו bleomycin המינהל. במחקר זה, אנו לחקור מודל עכבר דמוי-IPF המושרה על ידי החדרה bleomycin intratracheal זוגי. הערכות היסטולוגית סטנדרטי עבור פיברוזיס של הריאה הם הליכים פולשניים מסוף. מטרת עבודה זו היא לעקוב אחר פיברוזיס של הריאה באמצעות טכניקות הדמיה לא פולשנית כגון טומוגרפיה מולקולרית פלורסנט (FMT), מיקרו-טי אלה שתי טכנולוגיות חוקיותו עם היסטולוגיה ממצאים יכול לייצג מהפכנית פונקציונלי ניטור בזמן אמת לא פולשנית של חומרת המחלה IPF והתקדמות. היתוך גרעיני של גישות שונות מייצג צעד נוסף להבנת המחלה משקפות את עמדות, שבו ניתן לראות את האירועים המולקולריים המתרחשים במצב פתולוגי עם FMT ו ניתן לנטר שינויים אנטומיים הבאים על ידי מיקרו-טי

Introduction

Idiopathic פיברוזיס ריאתי (IPF) היא מחלת ריאות כרונית עם ירידה הדרגתית של פונקציות ריאות כי היא למרבה הצער לעיתים קרובות קטלנית תוך 4 שנים מיום אבחון¹. התכונות הגדולות של IPF מטריצה חוץ-תאית התצהיר והתפשטות פיברובלסט, אך בפתוגנזה אינה כבר מובנת במלואה. ההיפותזה נתמכת ביותר הוא כי מספר מחזורים של פציעות בריאות לגרום להרס של תאים אפיתל מכתשי שמוביל שינוי של התפשטות mesenchymal מחזור התא, הצטברות מוגזמת של fibroblasts, myofibroblasts, ו ייצור מוגבר מטריקס. מתווכים המעורבים בתהליכים אלה כגון מטריקס metalloproteinases (MMPs) התגלו dysregulated בפיתוח פיברוזיס IPF אנושי או במודלים חייתיים bleomycin-induced. ההפקה MMP לא מבוקרת מוביל התצהיר קולגן לא מאוזנת בתוך הריאות interstitium ואת שטח מכתשי, מחקה את הפצע חריג תיקון^1,2.

אחד המכשולים העיקריים גילוי תרופות ופיתוח הוא הזמינות של מודלים העכבר נגיש המחקים הפתוגנזה אנושי ו פנוטיפ של המחלה. סוכנים שונים שימשו לזירוז פיברוזיס של הריאה במודלים של בעלי חיים: הקרנה נזק, הניהול של אסבסט, סיליקה, מנהלה של ציטוקינים fibrinogenic ו-^3,bleomycin⁴; אולם bleomycin ביותר בשימוש עכברים, עכברושים, שרקנים, אוגרים, ארנבות⁵ או^6,חיות גדולות (פרימטים לא אנושי, סוסים, כלבים ומעלי גירה)⁷. Bleomycin היא אנטיביוטיקה שנעשו על ידי החיידק Streptomyces verticillus⁸ ומשמש בתור סוכן אנטי סרטניים⁹. פיברוזיס ריאתי היא תופעת לוואי נפוצה של הסם ומסיבה זו, הוא משמש במודלים חייתיים ניסיוני לזירוז לייפת.

במודלים פיברוזיס ריאות הנגרמת bleomycin, נגעים שהותירה להתרחש 14-21 יום לאחר bleomycin המינהל. עבודה שהוצגו, השתמשנו פרוטוקול חדש לזירוז פיברוזיס של הריאה בעכברים על ידי החדרה intratracheal bleomycin כפול. המודל העכבר bleomycin הוא מאוד זמן רב כי תרופות חדשות צורך להעריך על נגעים שהותירה הוקמה, ונבדק לבידול והשפעותיהם anti-fibrotic השפעות אנטי דלקתיות.

נחישות הביוכימי של קולגן תוכן, morphometrical וניתוח היסטולוגית התבססו על ניתוח פוסט מורטם, הגבלת האפשרות לעקוב בפתוגנזה של המחלה אותה חיה. אף על פי הפרמטרים הללו נחשבו תקן הזהב להערכה פיברוזיס, הם לא לספק כל הפצה הזמנית או המרחבי של הנגע שהותירה וגם למנוע דרך לחקור את התהליך של התקדמות המחלה. ¹⁰

לאחרונה, טכנולוגיות הדמיה לא פולשנית הוחלו על צג שיפוץ דרכי הנשימה, דלקת, פיברוזיס התקדמות במודלים מאתר: דימות תהודה מגנטית (MRI), מיקרו מחשב טומוגרפיה (מיקרו-CT), קרינה פלואורסצנטית מולקולרית טומוגרפיה (FMT) וזוהרים (רבנות בלי)^{11,12,13,14,15,16,17,18,19 20, ,21}. אנו מציעים גישה הדמיה לא פולשנית לנטר longitudinally ריאות פיברוזיס על ידי התקדמות FMT ו- Micro-CT בנקודות שונות בזמן-לאחר bleomycin אתגר²².

משעולים רבים מעורבים הקמה ופיתוח של פיברוזיס, לא הרבה ידוע. רק הבנה מעמיקה יותר של תהליכים אלה יכול לתרגם עוד סמים מטרות זה רשאי להעביר לתוך המרפאה. היכולת לנטר MMP ההפעלה longitudinally על-ידי קרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית מצמידים זיהוי שינויים parenchymal הריאה על ידי מיקרו-CT עשויה לשמש בעתיד כדי לגשת התגובה הקלינית לטיפול.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים המתוארים בזאת אושרו על ידי ועדת רווחת בעלי החיים מגזר עבור ניסויים בבעלי חיים של Chiesi Farmaceutici, ארסמוס MC תחת פרוטוקול מספר: 3349 EMC (138-14-07) הציות מורה הוראה 2010/63 האירופית, איטלקי D.Lgs 26/2014, מתוקנת "מדריך עבור טיפול, שימוש של מעבדה החיות"²³.

הערה: לפני השימוש, עכברים C57Bl/6 (בן 7-8 שבועות) המפגרים הנשי היו התאקלם לפחות 7 ימים לתנאים המקומיים ביבר (בטמפרטורת החדר: 20-24 מעלות צלזיוס; לחות יחסית: 40-70%; מחזור בהירה-כהה 12-h), בעל גישה חופשית תקן האוכל מכרסמים, מי ברז מרוככת.

1. Intratracheal טיפול של עכברים עם Bleomycin

1. הכינו ציוד החדרה אינטרה-הנשימה^12,13,14.
2. לשים העכברים בבית הבליעה הרדמה מחובר מאדה איזופלוריין שוכן בגובה 2.5% מעורבב עם חמצן. לבדוק לעומק של הרדמה לתחושה של חוסר תגובה הבוהן-קורט. השפעת ההרדמה אירעה לאחר 3-5 דקות.
3. מיקום העכבר anesthetized על פלטפורמת צנרור, לתלות אותה על ידי החותכות שלה מניחים על החוט.
4. להפעיל את laryngoscope, קח זוג מלקחיים שהסתיימה בוטה ולהשתמש המלקחיים או העצה של laryngoscope בעדינות לפתוח את הפה.
5. . תוציא את הלשון והחזק אותו לצד עם מלקחיים. מקם את הלהב laryngoscope לכיוון החלק האחורי של הפה עד הפתח של קנה הנשימה הוא מדמיין ולשמור את laryngoscope במקום.
6. עם היד השנייה, הכנס את הצינור משלוח מחובר בסוף צינורות PE לתוך קנה הנשימה, לסובב את הברז-כיוונית. לספק 50 µL של bleomycin (µg 0.020/עכבר). לאחר החדרה, להסיר במהירות את הצינור קנה הנשימה כדי למנוע חנק. החזק את העכברים זקוף במשך כמה שניות.
   1. לנהל bleomycin intratracheally ביום 0 וחזור ביום 4 (איור 1).
7. הסר את העכבר של פלטפורמת צנרור ונטר את העכבר במשך 30 דקות (הזמן הדרוש להחלים לחלוטין מן ההרדמה).
8. לבצע ויוו הדמיה של הריאות עכברים מאת FMT ו- Micro-CT לאחר החדרה bleomycin זוגי ביום 7, 14, ו- 21.

2. הדמיה in vivo על-ידי קרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית

הערה: להכין מראש, פתרון מניות טריים של 6 nmol/mL של MMP רגיש פלורסנט מצע 680 תמיסת מלח (0.9% נתרן כלורי), וכן חנות מוגנת מפני האור ב 4 ° C לפני השימוש. זה יציב עד 6 חודשים ב 4 º C. לאפשר MMP הדמיה לסוכן equilibrate לטמפרטורת החדר לפני הזרקת לתוך חיות.

1. בדיקה הזרקה
   1. הכינו ציוד ורידיות הפתרון בדיקה MMP. לחמם מים ב 50 מעלות צלזיוס לחמם זנב העכבר.
   2. לאחוז בחוזקה את עורפה העכבר, קח את זה בזנבו ולאפשר לו לאחוז את המכסה את הכלוב. החזקת העכברים לרוחב הכתפיים של החיה, לשים את הזנב בתוך מים חמים, עבור 4 לפגיעה מקסימום 8 s תרמית כדי למנוע פציעה של העור הזנב תרמי.  בדוק הורידים נפיחות ויזואליזציה קל והוספה המחט.
   3. במהלך ההליך הזרקה, מכניסים את העכברים restrainer פלסטיק שמור על יציבות ולשלוף את הזנב דרך חור מיוחד בגב. למצוא את שני הוורידים סימטרית משני צדי הזנב; לא את העורק בצד התחתון של הזנב.
   4. הכנס את המחט (26 גרם) של המזרק 1 מ"ל לווריד. אם המחט ממוקם כראוי, הזרקת יהיה קל, הפתרון בדיקה יזרום לתוך הכלי.
   5. להזריק את הפתרון בדיקה MMP-10 מ"ל/ק"ג.
   6. למחוק את המחט.
      הערה: נקודת הזמן דימות אופטימלית הוא 24 שעות אחרי הזריקה בדיקה MMP כי זה הזמן הנדרש על-ידי המכשיר להיות מופעל. אם האורך מחקרים מתבצעים, הזמן האופטימלי הזרקת מחדש הוא 7 ימים, אשר מאפשר להשלמת אישור של הסוכן מן העכבר.
2. FMT הדמיה
   הערה: לפני הפעלת, תמיד להסיר את הפרווה סביב האזורים של החיה כי הם לדימות, במקרה זה החזה, כדי למנוע פיזור ספיגת ברקמות.
   1. עזים ומתנגד העכבר, לשים אותו בתא הרדמה ולהפוך את החוגה איזופלוריין 2.5% עבור אינדוקציה, 2% לצורך תחזוקה.
   2. לאתחל את נתוני רכישת התוכנה ולפתוח מחקר חדש במסד הנתונים לניסוי.
   3. לפני שמתחילים ההדמיה עם FMT, להעביר את העכבר בקלטת הדמיה. הנח את העכבר anesthetized באמצע הדמיה קלטת לשימוש בצורה אופטימלית את שדה הראייה של FMT. שמור העכברים שטוח, מאובטח ודחוס בעדינות כנגד שני החלונות של קלטת הדמיה. להתאים את הגובה ידיות בקלטת ולאחר מכן החלק את זה לתוך תחנת העגינה.
   4. לחץ על נושא בחלון הסריקה, לחץ על תצוגה מקדימה כדי לראות את התמונה בשידור חי.
   5. לצייר את אזור הסריקה גדול מספיק כך רקמות המקיפים את האזור הצפויה של קרינה פלואורסצנטית נלכד. כולל סך של סריקת 25 נקודות ערבויות האזור ריאות יהיה לגמרי שנסרקו.
   6. ברגע רועי נמשך, לחץ תחילה להוסיף לתור שחזור ולאחר מכן לחץ על סרוק תמונה העכבר. ודא כי הלייזר הנכון-680 nm נבחרה.
   7. השלמת רכישת התמונה, מקם את העכבר בחזרה לכלוב שלו. להיות בטוח שזה מלא מתאושש מן ההרדמה.
   8. לכמת את picomoles של קרינה פלואורסצנטית בחלון ניתוח של תוכנת ניתוח ROI כלי ולהפחית את רועי סביב 700-800 מ"מ³ על האות מגיע מאזור ריאות. להיות זהירים כדי לא לכלול את האות בכבד. העתק את רועי על הנושאים אותם דומה בממד ולהתאמת המיקום של כל תמונה חיה.
   9. ייצוא תמונות כמו קבצי jpg.

3. הדמיה in Vivo על ידי מיקרו-CT

התראה: לפני שתתחיל, תמיד להסיר כל תכשיטי מתכת או חפצי מתכת ליד אזור ההדמיה, כדי למנוע פיזור קרני רנטגן.

הערה: פיברוזיס ריאות הנגרמת קרינה היא שממצא נפוץ במהלך קרינה המושרה ריאות פציעה²⁴. מיקרו-CT נגזר מדדים וגם היסטולוגית ממצאים המשויכים פיברוזיס של הריאה נכחו בעכברים מלוחים שליטה שטופלו ביום 21 נתון מיקרו ארבעה-CT הדמיה הפעלות, המציין כי המינון הרנטגן יועברו החיות במהלך מיקרו-CT בדיקות לא היה מספיק כדי להשפיע על הממצאים.

1. הפעלת ה-Micro-CT על-ידי לחיצה על כפתור ירוק כוח ולהפעיל את התוכנה כדי לחמם את מקור רנטגן. השתמש נשא קטן והמיטה בבעלי חיים עבור עכברים הדמיה.
2. יצירת מסד הנתונים על-ידי לחיצה על מסד נתונים חדש אחד חדש, לבנות הדפדפן מבוסס על מספר עכברים בניסוי, או לחץ על חיבור למסד נתונים קיים כדי לשמור את הנתונים אחד שנוצרה בעבר.
3. לפני תחילת הסריקה, בחר את הפרמטרים רכישה בחלון בקרת התוכנה: שפופרת רנטגן מתח, 90 kV; זרם שפופרת רנטגן CT, 160 µA; חיים שפופרת רנטגן עדכני, 80 µA; FOV, 36 מ מ; אין טכניקה המגביל; סרוק טכניקה, רזולוציה גבוהה 4 דקות.
4. עזים ומתנגד העכברים על ידי שאיפה של 3% איזופלוריין ולמקם אותם על המיטה מוכנס לתוך נשא עם קונוס האף מתן אספקה קבועה של הרדמה. לשתק את כפות רגליו של העכברים עם הקלטת על המיטה כדי לאפשר בחזה חשוף.
5. להחליק את הדלת כלי והפעל את מצב לחיות כדי לראות את מיקום העכבר בזמן אמת על ידי לחיצה על לחצן הלכידה. להזיז את המיטה בעלי חיים כדי ליישר את החזה עם שדה הראייה (FOV) באמצעות הלחצנים הממוקמים ישירות על המכשיר CT. מרכז הסריקה על העכבר; אם לא להתאים את המיקום עם החיצים ימינה ושמאלה הנמצאים על המכשיר CT.
6. לאשר את מיקום המיטה אופטימלית על ידי לסובב gantry על-ידי בחירה ב- 90 ° ולאחר לחיצה על הגדר. ודא אזור התמונה במלואה בתוך FOV.
7. לא להחיל בכל טכניקה המגביל ולהתחיל את הסריקה באמצעות לחיצה על לחצן בדיקת Ct . לחץ על כן כדי המסר מיידע מקור רנטגן תופעל.
   הערה: לאחר צילומי הרנטגן מופעלים, המנורה כתום על גבי המכשיר תהיה מוארת, לדלת הזזה יהיה בלתי אפשרי לפתוח לשלומם של המפעיל. לאחר הסריקה הסתיימה, מופיע חלון חדש של התוכנה Viewer 2D מציג את transaxial הפרונטליים, פרוסה הווריד של השחזור.
8. בדוק את איכות התמונה ולהיות בטוח שלא לקבל מטושטשים תמונות מתנועות בשל הרמה הנמוכה של הרדמה. אם יש צורך, חזור על הסריקה.
9. מקום החיות בחזרה לתוך הכלוב ולהיות בטוח שהם יתאושש לגמרי מן ההרדמה.

4. Bronchoalveolar שטיפה

1. עזים ומתנגד חיות עם 3% איזופלוריין והקרבה מדממים של העורק.
2. להשתמש במספריים כדי לחשוף את כלוב בית החזה והצוואר. לאחר מכן לחשוף את קנה הנשימה, עושים חתך קטן כדי לאפשר את ההליך BAL שיש לבצע עם צינור שטיפה 21-מד המצורפת מזרק 1 מ"ל ללא המחט. שים לב שלא לחתוך קנה הנשימה.
3. כדי לבצע את הכדור, למלא את המזרק 1 מ"ל בלי מחט עם 0.6 מ"ל של פתרון סטרילי [של האנק x 10 מאוזן תמיסת מלח (HBSS); 100 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA); 1 מ"מ חומצה 4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazineethansulphonic (HEPES); מזוקקים מים].
4. הכנס צינור שטיפה לתוך החתך לקנה, לאט לאט להחדיר ולסגת הפתרון 3 פעמים, השהיה על הנסיגה השלישית כדי לאפשר אופטימלי מאוסף BALF לצורך ניתוח מאוחר יותר.

5. היסטולוגיה ו Histomorphometry

1. לחשוף, להסיר את הריאות, ניפוח אותם עם בצינורית דרך קנה הנשימה על ידי אינפוזיה עדין עם 0.6 מ"ל של 10% באגירה נייטרלי פורמלין ולאחסן את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות ביממה.
2. מייבשים דגימות דרך מעברים שונים להגדיל את ריכוז של אלכוהול פתרונות (60% אתנול עבור 1 h, 70% אתנול 1 h, 90% אתנול עבור 1 h, אתנול 95% עבור 2 h ו- 100% אתנול כבר שעתיים) באמצעות מעבד רקמות אוטומטית.
3. מקום דגימות קסילן כבר שעתיים להפוך אותם לשקופים. בקצה של התייבשות, לחדור דוגמאות פרפין ב 60 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות, להטביע אותם במעבד אוטומטית.
4. להשיג 5 מיקרומטר עבה טורי מקטעים באמצעות מיקרוטום של רוטרי.
5. Deparaffinize נוזלים שקופיות בכיתות יורד של אתנול, כתם עם Trichrome של מאסון באמצעות מעבד רקמות אוטומטית.
6. באופן ידני להתמקד בפרוסות ריאות, סריקה ברזולוציה 20 X הגדלה באמצעות סורק שקופיות, לכידת תמונות דיגיטליות סעיפים הריאה כולה באמצעות התוכנה צופה עם רזולוציה של nm 451/פיקסל.
7. מורפולוגית להעריך פציעה שהותירה הריאה על ידי פרמטרים כמותיים למחצה, תפוקה כדלקמן:
   1. לקבוע את הציון אשקרופט. באופן כמותי חצי כיתה שינויים מורפולוגיים בסעיפים ריאות לקנה שהוגדרו על-ידי אשקרופט¹⁰ שונה על-ידי המלון. et al. ²⁵ שימוש במערכת של 0-8 ניקוד להערכת כל parenchyma הריאה המקטעים.
   2. לקבוע את התוכן של קולגן. לכמת את מידת^10,פיברוזיס²⁵ על ידי תוכנת ניתוח תמונת מיקרוסקופ. לבחור באקראי שלוש ROIs בהגדלה X 10, עבור כל שקופית. על ידי סטנדרטיזציה של הגדרות הסף צבע, לזהות הקולגן כאזור שהוכתמו ירוק.
   3. קובעים את האזור מכתשי אוויר. לכמת את האזור אוויר מכתשי בתור פרמטר עקיף של פיברוזיס^10,25. באמצעות תוכנה ו ROIs הוחל על השבר פיברוזיס אותו, לאתר את שטחה של אוויר ROIs באמצעות סף לבן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

רזולוציה ספונטנית של נגעים פיברוזיס הריאה ציין שלושה שבועות. לאחר bleomycin יחיד המינהל ושינויים מבניים מתונה לסמן את הגבולות של מודל זה. רק ובמרפאה יכול להתבצע בשל חלון טיפולי צר שאינו מייצג הקלינית¹⁷.

. הנה, נדגים כי הפרוטוקול של...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

למרות הרבה קבוצות מחקר המתמקד בפיתוח תרופות חדשות לטיפול IPF, כרגע רק שניים זמינים עבור חולים. יש צורך רפואי דחוף למצוא טיפולים יעילים יותר⁷ כי עד כדי כך הישרדות של 4-5 שנים²⁶רק ריאות transplantationis. תנאי מוקדם חיוני translational רפואה ופיתוח של תרופות חדשות היא הזמינות של מודל ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FMT 2500 Fluorescence Tomography System	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
MMPsense 680	Perkin Elmer Inc.	NEV10126	Protect from light, store the probe at 4 °C
TrueQuant software	Perkin Elmer Inc.
Female inbred C57BL/6	San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD),		Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
Isoflurane	ESTEVE spa	571329.8	Do not inhale
Automated cell counter	Dasit XT 1800J	Experimental Builder
Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl)	Eurospital	15A2807
Quantum FX Micro-CT scanner	Perkin Elmer Inc.
Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus	Sigma	B2434
Automatic tissue Processor	ATP700 Histo-Line Laboratories	ATP700
Embedding system	EG 1160 Leica Biosystems	EG 1160
Rotary microtome	Slee Cut 6062
Digital slide scanner	NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics
NIS-AR image analysis software	Nikon
Masson’s Trichrome Staining	Histo-Line Laboratories
10% neutral-buffered formalin	Sigma	HT5012-1CS
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator	Penn-century	DPM-EXT
PE190 micro medical tubing	2biological instruments snc	BB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mL	Terumo	SS*05SE1	Cut the boards of the piston by scissors
Hamilton 0.10 mL (model 1710)	Gastight	81022
Discofix 3-way Stopcock	Braun	4095111
Syringe with needle 1 mL	Pic solution	3,071,260,300,320	Use without needle
Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm	2biological instruments snc	FTP-18-50	Cut obliquely the tip