تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر [كنفوكل]

Summary

بلعم الفخاخ خارج الخلية كيان وصف حديثا. هذه المادة سوف تركز على أساليب الفحص المجهري [كنفوكل] وكيف أنها تصور في المختبر و في فيفو من عينات الرئة.

Abstract

وسيلة الرئيسية المستخدمة لتحديد وجود العَدلات الفخاخ خارج الخلية (شبكات) [كنفوكل] مجهرية. وقد قمنا بتعديل أساليب الفحص المجهري [كنفوكل] ثابتة لتصور بلعم الفخاخ خارج الخلية (ميتس). يتم تعريف هذه الفخاخ خارج الخلية بوجود الكروماتين خارج الخلية مع التعبير المشترك لمكونات أخرى مثل البروتياز الحبيبية وهيستونيس سيتروليناتيد بيبتيديل أرجيناسي ديميناسي (PAD). التعبير عن ميتس عموما يقاس بعد التعرض لحافز ومقارنة عينات تنشيط الأمم المتحدة. عينات مدرجة أيضا للتحكم بالخلفية وايستب. ويتم تحليل الخلايا باستخدام برمجيات التحليل صورة واضحة المعالم. يمكن استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] لتحديد وجود ميتس على حد سواء في المختبر و في فيفو في أنسجة الرئة.

Introduction

ووصفت الفخاخ خارج الخلية العَدلات (شبكات)، أولاً برينكمان et al. ¹ يتم إنتاجها في الغالب استجابة للعدوى (خاصة للبكتيريا) ولها دور هام في الدفاع المضيف^1،2. قد وصفت أيضا تحدث استجابة للأمراض غير المعدية، بما في ذلك التهاب الأوعية الدموية والذئبه الحمامية الجهازية (SLE)؛ وإلى mitogen phorbol 12-ميريساتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية)^2،3. وقد اعترف مؤخرا أن أنواع الخلايا الأخرى قد تنتج أيضا الفخاخ خارج الخلية، بما في ذلك الضامة. بلعم الفخاخ خارج الخلية (ميتس) ليست بعد كيان محدد جيدا في الأدب^4،5. وقد أنشأنا مؤخرا أساليب الكشف عن وجود ميتس في المختبر و في فيفو^6،7. في هذه المقالة، سيتم وصف قياس ميتس استخدام الفحص المجهري [كنفوكل].

السمات الرئيسية نيتوسيس التي تميزها عن سائر المسارات الخلوية (مثل المبرمج⁸) هي النتوء الكروماتين بالاقتران مع: (1) سيترولينيشن هيستونيس (H3Cit)⁹، (2) التعبير المشارك من البروتياز الحبيبية¹⁰ ، ومشاركة بيبتيديل ارجينين ديميناسي (PAD) 4 (3)^11،12. الضامة أيضا أن أعرب عن H3Cit، البروتياز الحبيبية، ومنصة، ويمكن استخدام هذه الميزات لتحديد وجود ميتس.

قد يكون ميتس دوراً بالغ أهمية في الرئة، كما بلعم هو المهيمن الخلية الحالية في الحويصلات الهوائية والخطوط الجوية في الرئة والدور الأولى في توجيه الاستجابة المناعية الخلوية للعدوى/التهاب. وباﻹضافة إلى ذلك، بينما الكثير من الرئة مساحة فارغة (مثلاً، داخل الحويصلات الهوائية)، ميتس، يحتمل أن تكون قادرة على التوسع في المساحة المتوفرة، على النقيض من الأجهزة الصلبة.

الأسلوب الأكثر استخداماً لتحديد وجود شبكات بالفحص المجهري [كنفوكل]. لا توجد حتى الآن طريقة محددة بوضوح لقياس ميتس. هذه التقنية لقياس شبكات تم تكييف لقياس وجود ميتس في هذا البروتوكول. المتطلبات الرئيسية لهذا الأسلوب هي الوصول إلى الفحص المجهري [كنفوكل] وبرامج التصوير المناسبة للتحليل.

Protocol

هذا البروتوكول يتبع التجارب التي تمت الموافقة عليها في: (1) البشر "أخلاقيات اللجنة من موناش الطبي المركز"، والحيوانات (2) لجنة الأخلاقيات التابعة لجامعة ملبورن.

1-الضامة للفيسيولوجيا الغسل (BAL)

1. "باستخدام ال" الحصول على الضامة الرئة في: الإنسان (1) مواضيع بالقصبات ⁶، و (2) الفئران باستخدام الشفط داخل الرغامى ¹³ .
   ملاحظة: يؤدي الحصول الضامة عموما بعض التنشيط لهذه الخلايا. يتم الحصول على الضامة من المرضى الذين يحتاجون القصبات للتحقيق في مشكلة طبية محتملة وليست جميع المواضيع قد تكون مناسبة لتحليل ميتس (هذا سوف تحتاج إلى تحديد لكل مشروع على حدة).
   1. تأخذ الحل بال وتدور إلى أسفل (ز 500 x لمدة 10 دقائق) للنموذج بيليه ويغسل مرتين مع الثقافة المتوسطة (روزويل بارك التذكاري المعهد المتوسط (ربمي) مع مصل العجل الجنين 5% و 1% ل الجلوتامين) في درجة حرارة الغرفة، وثم تضعف الخلايا في 4 مل من الثقافة ميدي أم-
   2. إذا لزم الأمر، طلب رسميا العد التفاضلية؛ ومعظم الخلايا (عموما > 80%) سوف تكون الضامة ⁶.
      ملاحظة: هذا سوف عموما أن يؤديها خدمة علم الأنسجة سريرية استخدام مظهر مورفولوجك ل أنواع خلايا مختلفة ⁶-
   3. تنفيذ خلية سنخية قابلة للحياة الاعتماد على الحل بال باستخدام الاستبعاد تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير-
      ملاحظة: الحل بال يتم الحصول عليها من البشر والفئران كما هو مذكور في الخطوة 1، 1-
   4. إضافة 1-4 × 10 ⁵ الضامة إلى لوحات 24-جيدا في كوفيرسليبس في 500 ميليلتر للثقافة المتوسطة كل بئر وإجازة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية؛ وسوف تلتزم الخلايا كوفيرسليبس. بالنسبة للعينات البشرية، إضافة المضادات الحيوية (مثل البنسلين وستربتوميسين، 10 ⁴ U/mL) لمنع التلوث البكتيري.

2. الفلورة التالي/مجهرية من "الضامة بال"

ملاحظة: يتم التقيد بها الخلايا على كوفيرسليبس كما هو مذكور أعلاه.

إزالة متوسط الثقافة

1. وغسل الخلايا مرة واحدة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إصلاح الخلايا في مثبت بارافورمالدهيد/فوق يودات/يسين (حزب العمال التقدمي) 2% للحد الأدنى 10
2. يغسل خلايا بإيجاز في برنامج تلفزيوني، وثم بيرميبيليزي في 0.2% 20 توين في برنامج تلفزيوني عن 20 دقيقة
3. كتلة الخلايا مع سيرا دجاج 10% في 5% البقري ألبومين المصل (BSA) المخفف في برنامج تلفزيوني عن 30 دقيقة
4. إينكوباتي مع مراقبة الابتدائي وايستب الأجسام المضادة ح 1 في درجة حرارة الغرفة بتركيزات 1: 100 (يتم سرد تفاصيل أكثر تحديداً في الجدول للمواد) على 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: للعينات BAL، علامة محددة من الضامة عادة غير مطلوب.
5. بعد إضافة الأجسام المضادة الأولية، تغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني، وكذلك احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
6. يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني وجبل مع المتوسطة المستندة إلى DAPI المتصاعدة للتصور استخدام مجهر [كنفوكل] (كما ذكر أعلاه) في الليزر الجسيمات 405، 488، 561 و 647 نانومتر و 40 س، غ 1.0 النفط الهدف.

3. عينات أنسجة الرئة

ملاحظة: في فيفو الدراسات أنسجة الرئة، دراسة العينات بعد التعرض ذات الصلة (مثلاً، كما هو مبين في س ' سوليفان et al. ⁷)-التعرض الأكثر ملاءمة لهذه التجربة هي الكائنات الدقيقة المعدية، خاصة البكتيريا. سلالات الماوس التي يمكن أن تستخدم لهذا الأسلوب من C57BL/6 أو بالب/ج الفئران، 10-12 أسابيع من العمر، والوزن ز 25-30، وذكر-

1. يوثانيزي الفئران، عن طريق حقنه داخل الكيتامين (400 مغ/كغ) وإكسيلازيني (40 مغ/كغ). فتح تجويف الصدر وفضح الرئتين والقلب باستخدام الملقط الجراحي والمقص.
   1. بث برنامج تلفزيوني الحار باستخدام إبرة عيار 21 في البطين الأيمن لتغسل الدم من هذه السفن لمدة 30 ثانية، ثم ضخ 10 مل من 2% حزب العمال التقدمي مثبت لمدة 30 s (في البطين الأيمن).
   2. استخدام برنامج تلفزيوني الحارة (42 درجة مئوية) للغسل تجويف الصدر مفتوحة. التنبيب القصبة الهوائية بإبرة عيار 21 وقطعة من أنابيب 0.8 ملم قطع بحجم، وحقن 800 ميليلتر من المعالجون مسبقاً (إلى 42 درجة مئوية)، ذوبان منخفضة نقطة 3% [اغروس] الحل.
   3. التعادل قبالة القصبة الهوائية مع الحرير مجدول (4.0 جامعة جنوب المحيط الهادئ). ضع مؤشر ترابط حول القصبة الهوائية، أسفل نقطة الإدراج من القنية، وضمان الحصول عليها عن طريق تراكم عقده بسيطة. أن يصلب [اغروس]، إدارة برنامج تلفزيوني المثلج حول الرئتين. إزالة الرئتين والقلب ككتلة من تجويف الصدر باستخدام مقص وتشريح كليلة. إزالة الرئة كل على حدة ومن ثم إصلاحها لهم ح 16 في 2% حزب العمال التقدمي أو الفورمالين في 4 ° C.
   4. تخزين العينات في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية حتى تقطيع الأنسجة. وكانت هذه الأساليب للحصول على أنسجة الرئة هو موضح سابقا ¹³-
2. لتحضير أنسجة الرئة نماذج استخدام الخطوات التالية.
   1. فيكس الرئة الأنسجة (مستأصل في الخطوة 3، 1) الأنسجة في 10% فورمالين الطبيعية معزولة عن 24 ساعة عند درجة حرارة الغرفة. نقل إلى الإيثانول 75% ووضع في معالج أنسجة على دورة ح 12، (2.5 ح في 75% EtOH، ح 3 في EtOH المطلق، ح 3.5 في 3B المذيبات، وعن ح 3 في البارافين).
   2. Embed في البارافين القياسية لإنشاء ثابت من الفورمالين، وجزءاً لا يتجزأ من البارافين كتل (FFPE) التي يتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة-
      ملاحظة: في هذه المرحلة، عموما مريحة لقطع المقاطع الرئة للشرائح القياسية.
   3. قطع المقاطع الرئة FFPE في 4-5 ميكرون سمك باستخدام مبضع وجبل على المتهمين، المغلفة الشرائح كما تم وصفه سابقا قبل س ' سوليفان et al. ⁷
   4. لتحميل الشرائح ووضع 3 قطرات متوسطة المتصاعدة على 60 مم × 24 مم كوفيرسليبس (الحجم 1.5)، وعكس الشريحة ساترة وطرد المتوسطة الزائدة. مغلقة بأحكام ختم مع طلاء الأظافر وتخزينها في درجة حرارة الغرفة-

4. إعداد/الفحص المجهري "عينات أنسجة الرئة"

1. لإزالة الشمع وترطيب بريتريت عينة أنسجة الرئة FFPE مع مستضد استرجاع الحل. الشرائح فب
   1. الفرن الجاف لمدة 60 دقيقة عند 60 درجة مئوية. ثم وضع الشرائح في الحل زيلين نفط 30 دقيقة ونقل إلى الحل الإيثانول 70% لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الشطف بماء الصنبور.
   2. مكان في غلاف بلاستيكي مقاوم للحرارة، ورهنا باسترجاع مستضد هير في طنجرة الضغط لمدة 10 دقائق في 10 m/mol/L تريس، 1 ملمول/يدتا pH 9.0. باردة ل 20 دقيقة أغسل مرتين في مياه الحنفية لمدة 5 دقائق في الروك، ثم مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني في الروك.
   3. كتلة مع المصل الدجاج 10% في 5% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
2. وصمة عار في الأنسجة.
   1. لتحديد ميتس في الضامة، إضافة الأجسام المضادة الأولية (MMP-9 و H3Cit و F4/80) في 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني عن ح 16 عند 4 درجة مئوية في تمييع 1/100 (يتم سرد تفاصيل محددة عن كميات الضد في الجدول للمواد). أغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في الروك.
   أضداد
   2. تحقيق كشف فلوري بالحضانة مع الثانوية المقابلة في 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الأضداد:: (1) الدجاج المضادة الماوس 488 (الأخضر) والماعز (2) الدجاج لمكافحة 594 (أحمر) والماوس المضادة (3) حمار 647 (الأحمر الآن)-
   3. يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني وجبل مع تصاعد المحتوية على DAPI المتوسطة لتلطيخ الكروماتين.
3. الحصول على الصور الفلورية باستخدام ليزر [كنفوكل] المسح رئيس تعلق مجهر مقلوب.
   1. تثير الإعداد مع 405، 488، 561، و 647 نانومتر الليزر. التقاط صور بكسل-512 × 512 طائرة واحدة بالنقر فوق خط تسلسلي، والاستواء زر (في المتوسط سطر 2) استخدام 20 X 0.1 الهواء NA و NA 40 × 1.0 النفط الأهداف.
   2. الحصول على مالا يقل عن عشرة حقول لعرض كل قسم للتحليل والبيانات لكل نتيجة (أي، 10 عالية الطاقة الحقول لعرض (هفوف) لعنصر التحكم، 10 لحفز عينة، إلخ، لكل الماوس)-
      ملاحظة: للحصول على عينة تمثيلية من الميدان كله، نظام مصفوفة يمكن استخدامها في الحقل الذي يتم تقسيم إلى أقسام مختلفة و لكل عينة مختلفة تستخدم نفس مصفوفة لتحديد الحقول من طريقة العرض (مثلاً، يمكن تقسيم الحقل إلى 9 أقسام، وتتخذ من المركز وزوايا 4، هفوف اثنين)-

5. التصوير ميتس ثلاثية الأبعاد (3-D)

ملاحظة: كما ميتس هياكل ثلاثية الأبعاد، بأخذ z-المكدس متعددة الصور، والتي يتم تشكيلها، قد تعطي معلومات قيمة-

1. المقطع العينات الرئة من كتل البارافين، في 200 ميكرومتر استخدام فيبرتوم في سعة تعيين 1.8 ملم والسرعة من 0.1-0.5 ملم/س.
2. كتلة أنسجة الرئة مع 20 ٪ مصل كل منهما (10% مصل العجل الجنين والمصل الدجاج 10 ٪)، وثم بيرميبيليزي في تكملة برنامج تلفزيوني و 3.75% 100 تريتون العاشر ح 7 في درجة حرارة الغرفة تحت الانفعالات لطيف.
3. وصمة عار المقاطع ح 16 عند 4 درجة مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ذات الصلة (MMP-9 و H3Cit و F4/80) في مجلدات ميليلتر 200 في أنابيب ميكروسينتريفوجي (جسم التركيزات المذكورة في الجدول للمواد)-
4. أغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني، 3 مرات لمدة 10 دقيقة قبل تفرخ مع الأجسام المضادة الثانوية ذات الصلة في درجة حرارة الغرفة حاء – 1
5. وصمة عار أقسام الرئة ل DAPI (1:5، 000) في الحل لمدة 20 دقيقة، قبل إضافة كشوف غطاء للمجهر الشرائح في برنامج تلفزيوني.
6. الحصول على الصور الفلورية استخدام مجهر [كنفوكل] مقلوب ال (40 × 1.3 غ) مجهزة 405 نانومتر، 440 نانومتر، 473 نانومتر، 543 نانومتر، و 635 نانومتر الليزر.
7. سجل ثلاثية الأبعاد z-رزمة من 0.54 ميكرون سمك مع تقطيع ض الأمثل لهدف النفط غ 40 × 1.3.
   ملاحظة: تتنوع البرمجيات المستخدمة تبعاً للمجهر الفردية. مثال عن كيف يمكن استخدام البرنامج مجهر واحد يرد في التكميلية الملف 1-

6. صورة التحليل

ملاحظة: تحليل العينات يتطلب استخدام برمجيات تحليل التصوير محددة وأمثلة مذكورة في الجدول للمواد. في حين يعتمد على برنامج معين يستخدم تحليل النتائج، النقاط المدرجة أدناه هامة-

1. عينات "التحليل بال"
   1. تعريف عدد الضامة باختيار قناة الأزرق ل DAPI وتعيين حجم الحد أدنى للخلايا (مثلاً، > 18 ميكرومتر في القطر). باستخدام البرمجيات ذات الصلة، وقياس مجموع الضامة كل حقل-
   2. حساب عدد الخلايا التي تحتوي على ميزات يلتقي بوجود خارج الخلية الكروماتين الكشف عنها بواسطة DAPI مع التعبير المشترك عن علامات أخرى (مثلاً، MMP12، PAD2 و H3Cit)-
      ملاحظة: يعتمد عدد العلامات التي يمكن تحليلها على العدد من أجهزة الليزر المتوفرة، ولكن من الناحية المثالية بالإضافة إلى DAPI، اثنين على الأقل من علامات أخرى ينبغي إدراجها. أخرى أقل معلمات محددة للتعبير MET (مثلاً، عدد الخلايا التي تحتوي على الكروماتين خارج الخلية، ونواة موسع) يمكن استخدامها-
   3. لمقارنة التعبير MET في بال تحليل عينات (بين التحكم والدخان، والدخان/الدناز معاملة مجموعات)، الحد ني الضامة ال 100 كل عينة.
   4. لقياس الأجسام المضادة الثانوية وايستب التحكم في مستويات الأسفار؛ وقياس الحد ني خلايا 100 في كل عينة لهذه الأسفار. قياس مستوى متوسط من الأسفار الخلفية لكل علامة (مثلاً، H3Cit) باستخدام البرامج القياسية.
   5. إلى تعريف تعبير MET، عد الخلايا مع النمط الظاهري نموذجي (مثلاً، الكروماتين خارج الخلية مع التعبير المشترك H3Cit و MMP9) وكل MET، لقياس مستوى الأسفار علامات (مثلاً، H3Cit و MMP9). استبعاد الخلايا المنتجة ميتس إذا لم يكن على تلطيخ فوق عنصر التحكم في الخلفية وايستب.
   6. تحليل للعينات بال البشرية، كحد أدنى من 100 خلية لكل عينة للنسبة مئوية الضامة التي تجعل ميتس. للحصول على نماذج مورين، تحليل الخلايا أصغر وصعوبة تحديد ميتس، عدد أكبر من الخلايا لكل عينة (مثلاً، الضامة 200)-
2. تحليل عينات أنسجة الرئة
   1. لتحديد وجود ميتس في أنسجة الرئة، استخدم علامة بلعم محددة مثل F4/80-
   2. تحديد وجود ميتس في أنسجة الرئة باستخدام التعريب المشارك F4/80 في الخلايا التي تعبر عن الكروماتين خارج الخلية مع معلمات أخرى كما هو موضح في القسم 6.1.
   3. تحديد مستويات الخلفية الفلورية في عينات مع الأجسام المضادة الثانوية وعناصر التحكم ايستب. استبعاد ميتس من التحليل أن لا تتجاوز الخلفية.

النتائج

وقد تصور ميتس من عينات BAL، في أنسجة الرئة وفي أقسام الرئة أكثر سمكا مع صور ثلاثية الأبعاد. ويرد مثال ميتس تصور في عينة بال في الشكل 1. مورفولوجية ميتس ستختلف وفقا لمرحلة النضج. أول ميزة يمكن كشفها في الفحص المجهري هو حركة نواة إلى الحافة من الخلية. ويعقب هذا ?...

Discussion

ويستند الأسلوب الموصوفة في هذا الاستعراض على أن تستخدم لتحديد وجود شبكات¹⁴. الضامة تعتبر إلى حد بعيد نوع الخلية المهيمنة في عينات بال وهذا الأسلوب من جمع خاصة مناسبة لدراسة ميتس. إذا كانت خلايا الدم الحمراء موجودة في ال، ينبغي تفكيك هذه الخلايا باستخدام كلوريد الأمونيوم. سيتم ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human samples: Primary antibodies
Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)	Abcam	AB5103	10 ug/ml
Rabbit anti-human MMP12	Novus Biological	NB110-57214	1:100 concentration not quantifiable
Mouse anti-human MMP9	Novus Biological	AB119906	1:200 ascites, no concentration given
Rabbit anti-human PADI2/PAD2	Abcam	AB16478	7 ug/ml
Mouse anti-human PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 ug/ml
Sheep anti-human NE	LifeSpan Bioscience	LS-B4244	25 ug/ml
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse samples: Primary antibodies
Goat anti-mouse MMP9	Abcam	AF909	10 ug/ml
Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)	Abcam	AB5103	10 ug/ml
Rat anti-mouse F4/80	In-house (hybridoma)	In house	20 ug/ml
Sheep anti-human Anti-HNE /NE	Sapphire Bioscience	LS-B4244	25 ug/ml
Mouse anti-human ­­­­PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 ug/ml
Super-frost plus slides	Menzel	S41104A
Dapi-prolong gold	Molecular probes	P36931
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	85111
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	E9434
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary antibodies
Chicken anti-rabbit AF 488/	Life technologies	A-21441
Chicken anti-rabbit AF 594	Life technologies	A-21442
Chicken anti-goat AF 594	Life technologies	a-21468
Chicken anti-mouse AF488	Life technologies	A-21200
Donkey anti-sheep AF 594	Life technologies	A-11018
Chicken anti-mouse AF 647	Life technologies	A-21463
Donkey anti-sheep AF 594	Life technologies	A-11016
Isotype control
Rabbit IgG	In house
Rabbit IgG	In house
Mouse IgG1	BD Bioscience	550878
Rabbit IgG	In house
Mouse IgG2a	BioLegend	400201
Sheep IgG	In house
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software Programs
Imaris	Bitplane
Image J	NIH
To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopes
C1 Confocal scanning microscope	Nikon
FV1200 Confocal scanning microscope	Olympus
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue sources
Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre
Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media
RPMI	Sigma-Aldrich	r8758
Fetal calf serum	Sigma-Aldrich	F0926
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other reagents
Sudan black	Sigma-Aldrich	199664
paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative	Sigma-Aldrich	27387
Xylene	Sigma-Aldrich	214736
Ketamine	Sigma-Aldrich	K2753
Natural formalin	Sigma-Aldrich	42904
Paraffin	Sigma-Aldrich	327204
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576
Solvent 3B	Hi-Chem	2026
Coverslips 12 ml	Sigma-Aldrich	S1815
Coverslips 60 x 24 ml	Sigma-Aldrich	C6875
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
c57 black 6	Monash animal research platform (MARP)
BALB/c	MARP