להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

Summary

מלכודות חוץ-תאי מקרופאג הם ישות שתואר לאחרונה. מאמר זה יתמקד מיקרוסקופיה קונפוקלית שיטות, איך הם דמיינו במבחנה , ויוו מדגימות ריאות.

Abstract

שיטה העיקרי המשמש להגדרת הנוכחות של מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות) הוא מיקרוסקופיה קונפוקלית. אנחנו ששינית מבוסס מיקרוסקופיה קונפוקלית שיטות כדי להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג (גרורות). אלה מלכודות חוץ-תאית מוגדרים על ידי הנוכחות של כרומטין חוץ-תאית עם ביטוי משותף של רכיבים אחרים כמו גרגר פרוטאזות, שינויים היסטוניים citrullinated peptidyl arginase deiminase (מקלדת). הביטוי של המטס בדרך כלל נמדד לאחר חשיפה לגירוי, לעומת דגימות לא מגורה. דוגמאות כלולים גם על רקע ושליטה isotype. התאים הם ניתחו באמצעות תוכנת ניתוח התמונה מוגדרים היטב. מיקרוסקופיה קונפוקלית עשוי לשמש כדי להגדיר את הנוכחות של המטס גם במבחנה וגם ויוו ברקמת הריאה.

Introduction

מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות), שתוארו לראשונה על-ידי. Brinkmann et al. ¹ הם מיוצרים בעיקר בתגובה לזיהום (במיוחד לחיידקים) ויש להם תפקיד חשוב ב מארח ההגנה^1,2. הם גם תוארו להתרחש בתגובה מחלות שאינן זיהומיות, כולל דלקת בכלי הדם, זאבת אדמנתית מערכתית (מירה כהן); ו mitogen phorbol 12-myrisate 13-אצטט (PMA)^2,3. זה לאחרונה הוכר כי סוגי תאים אחרים אולי גם לייצר מלכודות חוץ-תאית, כולל מקרופאגים. מלכודות חוץ-תאי מקרופאג (גרורות) עדיין אינם ישות מוגדרים היטב הספרות^4,5. לאחרונה הקמנו שיטות כדי לזהות הנוכחות של המטס גם במבחנה וגם ויוו^6,7. במאמר זה, המדידה של המטס שימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית יתוארו.

תכונות עיקריות של NETosis אשר להבחינו מסלולים סלולר אחרים (כגון אפופטוזיס⁸) הם ההבלטה של כרומטין בשיתוף עם: (1) citrullination של שינויים היסטוניים (H3Cit)⁹, (2) ביטוי משותף של פרוטאזות גרגר¹⁰ , (3) מעורבות של peptidyl deiminase ארגינין (PAD) 4^11,12. מקרופאגים אקספרס גם H3Cit, גרגר פרוטאזות, PAD, ניתן להשתמש בתכונות אלה כדי להגדיר את הנוכחות של המטס.

המטס ייתכן תפקיד חשוב במיוחד בריאה, כפי מקרופאג התא דומיננטי נוכח alveoli ואת דרכי הנשימה של הריאות, יש את התפקיד הראשוני של בימוי התגובה החיסונית הסלולר זיהום/דלקת. בנוסף, בעוד הרבה של הריאות הוא חלל ריק (למשל, בתוך alveoli), הגרורות מסוגלים פוטנציאלי להרחיב השטח הזמין, בניגוד לאיברים מוצקים.

השיטה הנפוצה ביותר מגדירים את הנוכחות של רשתות היא על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. יש עדיין אינה דרך ברורה כדי למדוד את המטס. הטכניקה לשקילת רשתות כבר מותאם כדי למדוד את הנוכחות של המטס ב פרוטוקול זה. הדרישות העיקריות של שיטה זו הם גישה מיקרוסקופיה קונפוקלית ותוכנת הדמיה המתאים לניתוח.

Protocol

פרוטוקול זה בעקבות ניסויים אושרה: (1) בני אדם לפי האתיקה הוועדה של מונש מרכז רפואי וכן בעלי חיים (2) על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת מלבורן.

1. מקרופאגים Bronchoalveolar שטיפה (BAL)

1. BAL שימוש כדי להשיג מקרופאגים ריאות ב: (1) האדם נושאים על ידי ברונכוסקופיה ⁶ ו- (2) עכברים באמצעות שאיפה אינטרה-הנשימה ¹³ .
   הערה: רכישת המקרופאגים גורמת בדרך כלל יש הפעלה של תאים אלה. מקרופאגים מתקבלים מן חולים הזקוקים ברונכוסקופיה לחקור בעיה רפואית פוטנציאלית ועוד נושאים לא כל יכול להיות מתאים לניתוח של המטס (יהיה צורך לקבוע עבור כל פרוייקט בודדים).
   1. קח את פתרון BAL ו ספין למטה (500 x g 10 דקות) לטופס גלולה, לשטוף פעמיים עם תרבות בינוני (רוזוול פארק אנדרטת מכון בינוני (RPMI) עם סרום עגל העוברי 5%, 1%-גלוטמין) בטמפרטורת החדר, ואז לדלל תאים 4 מ של תרבות medi המ.
   2. במידת הצורך, בקשה רשמית ספירה מבדלת; רוב התאים (בדרך כלל > 80%) יהיה מקרופאגים ⁶.
      הערה: זה בדרך כלל יבוצעו על ידי שירות היסטולוגיה קליניים באמצעות המראה מורפולוגיות של סוגי תאים שונים ⁶.
   3. בצע תא מקרופאג קיימא לסמוך על הפתרון BAL באמצעות הדרה Trypan blue ו- hemocytometer.
      הערה: BAL מתקבל פתרון של בני אדם ועכברים כאמור בשלב 1.1.
   4. הוסף 1-4 x 10 מקרופאגים ⁵ כדי. ובכן 24 צלחות על coverslips ב 500 µL של תרבות בינוני לכל טוב ולהשאיר לילה ב 37 מעלות צלזיוס; התאים מקנא coverslips. לדוגמאות אנושי, להוסיף אנטיביוטיקה (למשל, פניצילין, סטרפטומיצין, 10 ⁴ U/mL) כדי למנוע זיהום חיידקי.

2. Immunofluorescence Labeling/מיקרוסקופיה של מקרופאגים BAL

הערה: תאים מתקיימים על coverslips כאמור לעיל-

1. להסיר את המדיום תרבות ולשטוף את התאים פעם עם פוספט buffered סליין (הציבורי). לתקן תאים לשבועיים paraformaldehyde/periodate/ליזין (פיפ) 2% במשך 10 דקות
2. לשטוף את התאים לזמן קצר ב- PBS ולאחר מכן permeabilize ב- 0.2% 20 Tween ב- PBS במשך 20 דקות
3. גוש תאים עם 10% עוף sera ב- 5% שור אלבומין (BSA) מדולל ב- PBS במשך 30 דקות
נוגדנים
4. Incubate עם שליטה ראשי ו isotype לשעה בטמפרטורת החדר בריכוזים בטחונות (פרטים ספציפיים יותר מפורטים בטבלה של חומרים) ב- 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: עבור הדגימות BAL, סמן ספציפי של מקרופאגים נדרש בדרך כלל לא.
5. לאחר התוספת של נוגדנים העיקרי, לשטוף את התאים ב- PBS, דגירה נוסף עם נוגדנים משניים המתאימים למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר.
6. לרחוץ בסעיפים PBS ו הר דאפי מבוססי הרכבה בינונית להמחשת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (כאמור לעיל) לייזר excitations 647 561, 488, 405 ננומטר, 40 X, נה 1.0 שמן המטרה.

3. דגימות רקמה בריאה

הערה: ויוו במחקרי של רקמת הריאה, לומדים את הדוגמאות לאחר חשיפת הרלוונטי (למשל, כפי שתואר על ידי O ' סאליבן. et al. ⁷). החשיפה הרלוונטי ביותר עבור ניסוי זה הם אורגניזמים זיהומיות, בעיקר חיידקים. זנים העכבר יכול לשמש עבור שיטה זו הם עכברים C57BL/6 או BALB/c, בן 10-12 שבועות, משקל 25-30 גרם וזכר.

1. Euthanize עכברים, באמצעות הזרקה בקרום הבטן של קטאמין (400 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (40 מ"ג/ק"ג). פתח את חלל בית החזה, לחשוף את הריאות והלב באמצעות מלקחיים כירורגיים ומספריים.
   1. להשרות PBS חמים באמצעות מחט 21-מד לתוך החדר הימני כדי לשטוף את הדם מכלי הדם ב-30 s, ואז להשרות 10 מ"ל של 2% מקבע פיפ ב-30 (לתוך החדר הימני).
   2. להשתמש חמים PBS (42 ° C) שטיפת בחלל החזה פתוח. לצנרר קנה הנשימה עם מחט 21-מד וחתיכת אבובים 0.8 מ מ חיתוך לפי מידה, להזריק µL 800 של ומחוממת מראש (עד 42 ° C), התכה נמוכה הצבע 3% agarose פתרון.
   3. העניבה off קנה הנשימה במשי קלועה (4.0 USP). מניחים את החוט סביב קנה הנשימה, מתחת נקודת הכניסה של הצינורית, ואבטח אותו באמצעות קשר בוהן פשוט. כדי לחזק את agarose, לנהל PBS קר כקרח סביב הריאות. הסר את הריאות והלב כבלוק בחלל בית-החזה בעזרת מספריים והן עמום. להסיר את כל הריאה בנפרד ולתקן אותם ואז עבור 16 h ב- 2% פיפ או פורמלין ב-4 מעלות צלזיוס
   4. לאחסן את דגימות PBS ב 4 ° C עד רקמות חלוקתה. אלה שיטות לקבלת רקמת הריאה היה שתואר לעיל ¹³.
2. להכין את רקמת הריאה דגימות השתמש בשלבים הבאים.
   1. תיקון רקמת הריאה רקמות (resected בשלב 3.1) בפורמלין באגירה טבעי 10% במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. להעביר 75% אתנול ולשים במעבד רקמות על מחזור של 12 שעות, (2.5 h ב- 75% EtOH, 3 h ב- EtOH מוחלטת, 3.5 h ב- 3B הממס, ובמשך 3 h בפרפין).
   2. הטבע בפרפין סטנדרטי כדי ליצור בלוקים (FFPE) פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע, אשר מאוחסנים בטמפרטורת החדר.
      הערה: בשלב זה, זה בדרך כלל נוח לחתוך הסעיפים ריאות עבור שקופיות רגילה.
   3. לחתוך הסעיפים הריאה FFPE-4-5 מיקרומטר עובי באמצעות מיקרוטום והר טעונה, מצופה שקופיות כאמור מתוארת על ידי O ' סאליבן. et al. ⁷
   4. הר שקופיות, לשים 3 טיפות של הרכבה בינונית על coverslips 60 מ"מ x 24 מ"מ (גודל 1.5), היפוך השקופית על coverslip ולדחוף את עודף בינוני. הרמטית לאטום עם לק ולאחסן בטמפרטורת החדר.

4. הכנה/מיקרוסקופיה של דגימות רקמה בריאה

1. דה-שעווה, נוזלים, pretreat המדגם רקמת הריאה FFPE עם אנטיגן אחזור פתרון.
   1. התנור יבש FFPE שקופיות עבור 60 דקות ב 60 מעלות צלזיוס. אז לשים את השקופיות בפתרון קסילן במשך 30 דקות והעברת לפתרון אתנול 70% למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף במי ברז.
   2. המקום חום הוכחה ניילון נצמד ובכפוף חיר-אנטיגן אחזור בסיר לחץ במשך 10 דקות 10 מ'/מול/ליטר טריס, pH 1 mmol/EDTA 9.0. מגניב עבור 20 דק לשטוף פעמיים במי ברז למשך 5 דקות על כיסא נדנדה, אז פעם אחת עם PBS על הנדנדה.
   3. בלוק עם הנסיוב עוף 10% 5% BSA/PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
2. מכתים את הרקמה.
   1. להגדיר המטס מקרופאגים, להוסיף ראשי נוגדנים (MMP-9, H3Cit ו- F4/80) 1% BSA/PBS עבור h 16 ב 4 ° C-דילול 1/100 (פרטים ספציפיים לגבי כמויות נוגדן מוצגים בטבלה של חומרים). תשטוף פעמיים עם PBS למשך 5 דקות על כיסא נדנדה.
   נוגדנים
   2. להשיג זיהוי פלורסנט על ידי דגירה עם משני המתאים 1% BSA/PBS למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר. נוגדנים הם: (1) עוף אנטי עכבר 488 (ירוק), (2) עוף אנטי-עז 594 (אדום), ועכבר (3) חמור נגד 647 (אדום רחוק).
   3. לרחוץ בסעיפים PBS ו הר המכילות דאפי הרכבה בינונית עבור צביעת כרומטין.
3. להשיג פלורסנט תמונות באמצעות לייזר קונפוקלי סריקת הראש מחובר במיקרוסקופ הפוכה.
   1. להלהיב ההכנה עם 405, 488, 561 647 ננומטר לייזר. ללכוד תמונות פיקסל 512 x 512 מטוס יחיד על ידי לחיצה על הקו-רציפים, בהחלקה לחצן (בממוצע קו 2) באמצעות 20 X 0.1 והאוויר נה נה 40 X 1.0 שמן מטרות.
   2. לקבל לפחות 10 שדות ראייה לכל מקטע עבור ניתוח נתונים עבור כל תוצאה (קרי, 10 ובעוצמת שדות ראייה (HFOV) עבור הפקד, 10 עבור מדגם מגורה, וכדומה, עבור כל עכבר).
      הערה: כדי לקבל במדגם מייצג של כל השדה, מטריצה המערכת יכולים לשמש אשר מחולק השדה לתוך מקטעים שונים עבור כל דגימה שונה המטריקס באותו משמש כדי לבחור שדות ראייה (למשל, השדה יכול להיות מחולק למקטעים 9 ומועברים למרכז, 4 הפינות, שני HFOV).

5. תלת-ממדיים (3-D) הדמיה של המטס

הערה: כפי. המטס מבנים תלת-ממדיים, על ידי לקיחת z מרובים-מחסנית תמונות, אשר הם מחדש, רשאי למסור מידע בעל ערך.

1. סעיף דגימות ריאות מבלוקים פרפין, על שימוש vibratome בבית משרעת שוכן בגובה 1.8 מ"מ ומהירות של 0.1-0.5 מיקרומטר 200 מ"מ/ס
2. לחסום את רקמת הריאה עם 20% של הסרום המתאים (10% עגל עוברית סרום ו- 10% עוף סרום) ולאחר מכן permeabilize PBS שיושלם ו- 3.75% טריטון-X 100 עבור 7 שעות בטמפרטורת החדר תחת עצבנות עדין.
3. כתם הסעיפים עבור h 16 ב 4 ° C עם נוגדנים העיקרי הרלוונטי (MMP-9, H3Cit ו- F4/80) 200 כרכים µL צינורות microcentrifuge (נוגדן ריכוזים מוצגים בטבלה של חומרים).
4. לשטוף את הסעיפים ב- PBS, 3 פעמים במשך 10 דקות לפני המקננת עם נוגדנים משניים הרלוונטיים בטמפרטורת החדר במשך ה 1
5. כתם הסעיפים ריאות עבור דאפי (1:5, 000) בתמיסה למשך 20 דקות, לפני הוספת את שער גולשת המיקרוסקופ שקופיות ב- PBS.
6. להשיג תמונות פלורסצנטיות באמצעות הפוכה קונאפוקלית במיקרוסקופ (40 x 1.3 NA) מצוידים עם 405 ננומטר, 440 ננומטר, 473 nm, 543 ננומטר, 635 ננומטר לייזר.
7. להקליט z-במחסן תלת-ממדי של 0.54 עובי מיקרומטר עם אופטימלית חלוקתה z עבור המטרה שמן 40 x 1.3 נה.
   הערה: התוכנה ששימשה משתנה בהתאם המיקרוסקופ בודדים. דוגמה של איך התוכנה יכול לשמש עבור מיקרוסקופ אחד מסופק 1 הקבצים המשלימים.

6. ניתוח תמונה

הערה: הניתוח של דגימות מחייב שימוש תוכנה ספציפית ניתוח ההדמיה, דוגמאות מפורטים בטבלה של חומרים. בזמן הניתוח של התוצאות תלויות התוכנית ספציפיים השתמשו, הנקודות המפורטות להלן חשובים.

1. ניתוח של בל דגימות
   1. הגדר המספר של מקרופאגים על-ידי בחירת ערוץ הצבע הכחול על דאפי הקצאת בגודל מינימלי עבור התאים (למשל, > 18 מיקרומטר בקוטר). באמצעות התוכנות הרלוונטיות, למדוד את המספר הכולל של מקרופאגים לכל שדה.
   2. לספור את מספר תאי יש את התכונות של המטרופוליטן על ידי הנוכחות של כרומטין חוץ-תאית שזיהה דאפי עם ביטוי משותף של סמנים אחרים (למשל, MMP12, PAD2 ו- H3Cit).
      הערה: מספר סמנים ניתן לנתח תלויה במספר של לייזרים זמינים, אך באופן אידיאלי בנוסף דאפי, לפחות שני סמנים אחרים צריך להיות כלול. השני פחות פרמטרים ספציפיים עבור ביטוי MET (למשל, מספר תאים עם כרומטין חוץ-תאית, של גרעין מוגדלת) יכול לשמש.
   3. כדי להשוות את הביטוי MET ב BAL לנתח דגימות (בין הבקרה, עשן, עשן/DNase התייחסו לקבוצות), מינימום של 100 מקרופאגים BAL לדגימה.
   4. למדוד נוגדנים משניים, isotype לשלוט רמות קרינה פלואורסצנטית; למדוד מינימום של 100 תאים בכל מדגם עבור קרינה פלואורסצנטית שלהם. למדוד את הרמה הממוצעת של רקע זריחה עבור כל סמן (למשל, H3Cit) באמצעות תוכנה סטנדרטית.
   5. להגדיר ביטוי MET, לספור את התאים עם פנוטיפ אופייני (למשל, חוץ-תאית כרומטין עם שותף ביטוי H3Cit MMP9), עבור כל MET, למדוד את רמת קרינה פלואורסצנטית סמנים (למשל, H3Cit, MMP9). לא לכלול תאים בהפקת המטס אם צביעת שלהם לא היה מעל רקע ושליטה isotype.
   6. לדוגמאות BAL אנושי, לנתח מינימום של 100 תאים עבור כל דגימה עבור האחוז של מקרופאגים שהופכים הגרורות. לקבלת דוגמאות מאתר, התאים הם קטנים יותר, המטס קשה להגדיר, לנתח מספר גדול יותר של תאים עבור כל דגימה (למשל, מקרופאגים 200).
2. ניתוח של דגימות רקמה בריאה
   1. כדי לקבוע הנוכחות של המטס ברקמת הריאה, השתמש הסמן מקרופאג ספציפיים כגון F4/80-
   2. להגדיר את הנוכחות של המטס ברקמת הריאה באמצעות שיתוף הלוקליזציה של F4/80 בתאים המבטאים כרומטין חוץ-תאית עם פרמטרים אחרים, כמפורט בסעיף 6.1.
   3. לקבוע את רמות קרינה פלואורסצנטית רקע בדגימות עם נוגדנים משניים, הפקדים isotype. אל תכלול המטס ניתוח שאינם מעל הרקע.

תוצאות

מטס, ניתן לאבחן מדגימות BAL, רקמת הריאה, בסעיפים ריאות עבה יותר עם תמונות תלת-ממדיות. דוגמה של המטס דמיינו במדגם BAL מוצג באיור1. המורפולוגיה של הגרורות ישתנה בהתאם שלהם שלב של התבגרות. התכונה הראשונה לזיהוי על מיקרוסקופ הוא התנועה של הגרעין לקצה של התא. זה מלו...

Discussion

השיטה המתוארת בסקירה זו מבוססת בשימוש עבור הגדרת הנוכחות של רשתות¹⁴. מקרופאגים עד כה סוג התא דומיננטי בדגימות BAL, שיטה זו של אוסף זה מתאים במיוחד ללמוד הגרורות. אם תאי דם אדומים נוכח הכדור, תאים אלה צריך להיות lysed על-ידי שימוש אמוניום כלוריד. ההליך BAL יהיה בדרך כלל להפעיל את המקרו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human samples: Primary antibodies
Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)	Abcam	AB5103	10 ug/ml
Rabbit anti-human MMP12	Novus Biological	NB110-57214	1:100 concentration not quantifiable
Mouse anti-human MMP9	Novus Biological	AB119906	1:200 ascites, no concentration given
Rabbit anti-human PADI2/PAD2	Abcam	AB16478	7 ug/ml
Mouse anti-human PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 ug/ml
Sheep anti-human NE	LifeSpan Bioscience	LS-B4244	25 ug/ml
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse samples: Primary antibodies
Goat anti-mouse MMP9	Abcam	AF909	10 ug/ml
Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)	Abcam	AB5103	10 ug/ml
Rat anti-mouse F4/80	In-house (hybridoma)	In house	20 ug/ml
Sheep anti-human Anti-HNE /NE	Sapphire Bioscience	LS-B4244	25 ug/ml
Mouse anti-human ­­­­PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 ug/ml
Super-frost plus slides	Menzel	S41104A
Dapi-prolong gold	Molecular probes	P36931
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	85111
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	E9434
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary antibodies
Chicken anti-rabbit AF 488/	Life technologies	A-21441
Chicken anti-rabbit AF 594	Life technologies	A-21442
Chicken anti-goat AF 594	Life technologies	a-21468
Chicken anti-mouse AF488	Life technologies	A-21200
Donkey anti-sheep AF 594	Life technologies	A-11018
Chicken anti-mouse AF 647	Life technologies	A-21463
Donkey anti-sheep AF 594	Life technologies	A-11016
Isotype control
Rabbit IgG	In house
Rabbit IgG	In house
Mouse IgG1	BD Bioscience	550878
Rabbit IgG	In house
Mouse IgG2a	BioLegend	400201
Sheep IgG	In house
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software Programs
Imaris	Bitplane
Image J	NIH
To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopes
C1 Confocal scanning microscope	Nikon
FV1200 Confocal scanning microscope	Olympus
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue sources
Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre
Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media
RPMI	Sigma-Aldrich	r8758
Fetal calf serum	Sigma-Aldrich	F0926
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other reagents
Sudan black	Sigma-Aldrich	199664
paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative	Sigma-Aldrich	27387
Xylene	Sigma-Aldrich	214736
Ketamine	Sigma-Aldrich	K2753
Natural formalin	Sigma-Aldrich	42904
Paraffin	Sigma-Aldrich	327204
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576
Solvent 3B	Hi-Chem	2026
Coverslips 12 ml	Sigma-Aldrich	S1815
Coverslips 60 x 24 ml	Sigma-Aldrich	C6875
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
c57 black 6	Monash animal research platform (MARP)
BALB/c	MARP