Visualizando o macrófago armadilhas extracelular usando microscopia Confocal

Resumo

Macrófago extracelulares armadilhas são uma entidade recentemente descrita. Este artigo se concentrará em métodos de microscopia confocal e como eles são visualizadas in vitro e em vivo de amostras do pulmão.

Resumo

Um método primário usado para definir a presença de neutrófilos armadilhas extracelulares (redes) é a microscopia confocal. Modificamos a microscopia confocal estabelecidos métodos para visualizar armadilhas extracellular do macrófago (METs). Estas armadilhas extracelulares são definidas pela presença de cromatina extracelular com expressão co de outros componentes como proteases do grânulo, citrulinado histonas e peptidyl arginase deiminase (PAD). A expressão dos METs geralmente é medida após a exposição a um estímulo e em comparação com amostras não-estimuladas. As amostras também estão incluídas para plano de fundo e do isotipo controle. As células são analisadas usando software de análise de imagem bem definida. Microscopia confocal pode ser usada para definir a presença de metástases tanto in vitro e em vivo no tecido pulmonar.

Introdução

Neutrófilos armadilhas extracelulares (redes), foi primeiramente descrito pelo Brinkmann et al ¹ eles são predominantemente produzidos em resposta à infecção (especialmente para as bactérias) e têm um papel importante na defesa de anfitrião^1,2. Eles também têm sido descritos para ocorrer em resposta a doenças não-infecciosas, incluindo vasculite e Lúpus eritematoso sistémico (SLE); e ao mitógeno phorbol 12-myrisate 13-acetato (PMA)^2,3. Recentemente foi reconhecido que outros tipos de células podem também produzir armadilhas extracelulares, incluindo macrófagos. Armadilhas extracellular do macrófago (METs) ainda não são uma entidade bem definida na literatura^4,5. Nós recentemente estabeleceram métodos para detectar a presença de metástases tanto in vitro e in vivode^6,7. Neste artigo, será descrita a medição dos METs usando microscopia confocal.

Principais características do NETosis que a distinguem de outras vias celulares (como a apoptose⁸) são a extrusão da cromatina em conjunto com: (1) citrullination de histonas (H3Cit)⁹, (2) expressão co de proteases grânulo¹⁰ e (3) participação do peptidyl arginina deiminase (PAD) 4^11,12. Os macrófagos também expressam H3Cit, proteases do grânulo e almofada, e esses recursos podem ser usados para definir a presença de metástases.

Os METs podem ter um papel particularmente importante no pulmão, como o macrófago é a célula dominante presente nos alvéolos e vias aéreas do pulmão e tem papel inicial na direção da resposta imune celular a infecção/inflamação. Além disso, enquanto grande parte do pulmão é espaço vazio (por exemplo, dentro do alvéolo), os METs são potencialmente capazes de expandir-se para o espaço disponível, em contraste com órgãos sólidos.

O método mais utilizado para definir a presença de redes é por microscopia confocal. Não há ainda uma maneira claramente definida para medir METs. A técnica para a medição de redes tem sido adaptada para medir a presença de metástases no presente protocolo. Os requisitos principais para este método são acesso a microscopia confocal e software de imagem apropriado para análise.

Protocolo

este protocolo segue experiências aprovadas em: (1) os seres humanos pelo Comitê de ética de Monash Medical centro e (2) animais pelo Comitê de ética da Universidade de Melbourne.

1. macrófagos do lavado broncoalveolar (BAL)

1. BAL de uso para obter os macrófagos pulmonares em: (1) humanos sujeitos por broncoscopia ⁶ e (2) ratos usando aspiração intratraqueal ¹³ .
   Nota: Aquisição de macrófagos em geral, causa uma ativação dessas células. Os macrófagos são obtidos de pacientes que requerem uma broncoscopia para investigar um problema médico potencial e nem todos os temas podem ser adequados para análise dos METs (isto terá de ser determinado para cada projecto).
   1. Tomar a solução de BAL e spin-down (500 x g durante 10 minutos) para formar um pellet, lave duas vezes com meio de cultura (Roswell Park Memorial Institute médio (RPMI) com 5% de soro fetal bezerro e 1% L-glutamina) à temperatura ambiente e em seguida diluir as células em 4 mL de cultura medi ....
   2. , Se necessário, solicitar um formal contagem diferencial; a maioria das células (geralmente > 80%) será macrófagos ⁶.
      Nota: Isso geralmente será executado por um serviço clínico Histologia usando a aparência morfológica dos tipos diferentes de células ⁶.
   3. Executar uma célula macrófago viável conta com a solução de BAL usando Trypan azul exclusão e um hemocytometer.
      Nota: Solução de BAL é Obtida de seres humanos e ratos como mencionado na etapa 1.1.
   4. Add 1-4 x 10 ⁵ macrófagos para placas boas 24 em lamelas em 500 µ l do meio de cultura por bem e deixar durante a noite a 37 ° C; as células irão aderir as lamelas. Para amostras humanas, adicionar antibióticos (por exemplo, penicilina e estreptomicina, 10 ⁴ U/mL) para evitar a contaminação bacteriana.

2. Rotulagem/microscopia de imunofluorescência de macrófagos BAL

Nota: as células são respeitadas em lamelas, como mencionado acima.

1. Remover o meio de cultura e lavar as células uma vez com solução salina tampão fosfato (PBS). Consertar as células em fixador de paraformaldeído/periodato/lisina (PLP) 2% durante 10 min.
2. Lavar as células brevemente em PBS e em seguida permeabilize em 0,2% Tween 20 em PBS por 20 min.
3. Células de bloco com sera de frango de 10% em 5% albumina de soro bovino (BSA) diluído em PBS durante 30 min.
Anticorpos
4. incubar com primário e do isotipo controle por 1h à temperatura ambiente em concentrações de 1: 100 (detalhes mais específicos estão listados na Tabela de materiais) a 37 ° C.
   Nota: Para as amostras de BAL, um marcador específico de macrófagos normalmente não é necessário.
5. Após a adição de anticorpos primários, lavar as células em PBS e incube ainda mais com os correspondentes anticorpos secundários por 40 min à temperatura ambiente.
6. 1,0 at óleo objetivo, lave as seções em PBS e montagem com meio de montagem baseada em DAPI para visualização usando um microscópio confocal (como mencionado acima), a laser excitações 405, 488, 561 e 647 nm e uma 40 X.

3. Amostras de tecido de pulmão

Nota: estudos em vivo do tecido pulmonar, estudar as amostras após a exposição relevante (por exemplo, como descrito por O ' Sullivan et al ⁷). a exposição que é mais relevante para este experimento são microorganismos infecciosos, particularmente bactérias. Cepas de mouse que podem ser usadas para este método são camundongos C57BL/6 ou BALB/c, 10-12 semanas de idade e peso 25-30 g macho.

1. Euthanize ratos, através de uma injeção intraperitoneal de cetamina (400 mg/kg) e xilazina (40 mg/kg). Abra a cavidade torácica e expor os pulmões e o coração usando a tesoura e pinça cirúrgica.
   1. Infundir PBS quente usando uma agulha de calibre 21 para o ventrículo direito para lavar o sangue dos vasos por 30 s, infundir em seguida 10 mL de fixador PLP 2% por 30 s (para o ventrículo direito).
   2. Use quente PBS (42 ° C) para lavagem da cavidade de peito aberto. Intubação da traqueia com uma agulha de calibre 21 e um pedaço de tubo de 0,8 mm, corte ao tamanho e injetar 800 µ l de previamente aquecido (a 42 ° C), baixo ponto de fusão ponto solução de agarose 3.
   3. Gravata fora da traqueia com seda trançada (USP 4.0). Coloque a linha ao redor da traqueia, logo abaixo do ponto de inserção da cânula e fixá-lo através de um simples nó de laçada. Para solidificar o agarose, administre PBS gelado ao redor dos pulmões. Remova os pulmões e o coração como um bloco da cavidade torácica, usando uma tesoura e dissecção romba. Remover cada pulmão individualmente e então corrigi-los para 16 h em 2% PLP ou formalina a 4 ° C.
   4. Armazenar as amostras em PBS a 4 ° C até o corte de tecido. Esses métodos para a obtenção de tecido pulmonar têm sido descritas anteriormente ¹³.
2. Para preparar o tecido pulmonar amostras usam as seguintes etapas.
   1. Reparo do tecido pulmonar tecidos (ressecados em passo 3.1) em tampão natural formol a 10% por 24 horas à temperatura ambiente. Transferência de 75% de etanol e colocar em um processador de tecido em um ciclo de 12 h, (2.5 h em 75% EtOH, 3h em EtOH absoluto, 3,5 h em solvente 3B e para 3h em parafina).
   2. Embed em parafina padrão para criar formalin-fixas, parafina blocos (FFPE) que são armazenados à temperatura ambiente.
      Nota: Nesta fase, é geralmente conveniente cortar as seções de pulmão para slides padrão.
   3. Cortar as seções de pulmão FFPE na espessura de 4-5 µm usando um micrótomo e montar no cobrado, revestidos slides conforme descritos por s ' et al. Sullivan ⁷
   4. para montar slides, coloque 3 gotas de meio de montagem em lamelas de 60 mm x 24 mm (tamanho 1.5), inverter o slide na lamela e empurrar para fora o excesso de meio. Hermeticamente selar com esmaltes e armazenar à temperatura ambiente.

4. Preparação/microscopia de amostras de tecido de pulmão

1. de cera, hidratar e pré-tratamento da amostra de tecido de pulmão FFPE com solução de recuperação de antígeno.
   1. Forno seco o FFPE desliza por 60 min a 60 ° C. Então coloque as lâminas em solução de xilol por 30 min e transferência para solução de etanol 70% por 5 min à temperatura ambiente. Enxaguar em água da torneira.
   2. Lugar em plástico resistente ao calor e sujeitos a recuperação HIER-antígeno em uma panela de pressão por 10 min em 10 m/mol/L Tris, pH 1 mmol/EDTA 9.0. Legal de 20 min. lavar duas vezes na água da torneira por 5 min em uma cadeira de balanço, em seguida, uma vez com PBS basculante.
   3. Bloco com soro de frango de 10% em 5% BSA/PBS durante 30 min à temperatura ambiente.
2. Manchar o tecido.
   1. Definir METs em macrófagos, acrescente os anticorpos primários (MMP-9, H3Cit e F4/80) em 1% BSA/PBS para 16 h a 4 ° C, a diluição de 1/100 (detalhes específicos sobre quantidades de anticorpos são listados na Tabela de materiais). Lave duas vezes com PBS por 5 min em um balancim.
   Anticorpos
   2. alcançar a deteção fluorescente de incubação com secundário correspondente em 1% BSA/PBS durante 40 min à temperatura ambiente. Os anticorpos são: anti-rato (1) frango (verde) 488, anti-cabra de frango (2) 594 (vermelho) e (3) burro anti-mouse 647 (vermelho distante).
   3. Lavar as seções em PBS e montagem com DAPI-contendo o meio de montagem para coloração de cromatina.
3. Obter imagens fluorescentes, usando um laser confocal de varredura anexada a um microscópio invertido de cabeça. Lasers de nm
   1. Excite a preparação com 405, 488, 561 e 647. Capturar imagens de 512 x 512-pixel único avião clicando sobre a linha sequencial, nivelamento de botão (2 linha média) usando 20 X 0.1 ar at e 40 X 1.0 at óleo objectivos.
   2. Obter pelo menos dez campos de vista por seção de análise e dados para cada resultado (ou seja, 10 de alta potência campos de visão (HFOV) para o controle, 10 para a amostra estimulada, etc., para cada rato).
      Nota: Para obter uma amostra representativa de todo o campo, um sistema de matriz pode ser usado em que o campo é dividido em as seções diferentes e para cada amostra diferente a mesma matriz é usada para selecionar campos de visão (por exemplo, o campo pode ser dividido em 9 seções, e do centro e os 4 cantos, são tomadas duas HFOV).

5. Tridimensional (3D) de imagens de METs

Nota: como METs são estruturas 3-d, tomando z-pilha múltiplas imagens, que são reconstituídas, podem dar informações valiosas.

1. Seção as amostras de pulmão de blocos de parafina, em 200 µm usando um vibratome em uma amplitude de 1,8 mm e velocidade de 0.1-0.5 mm/s.
2. Bloco de tecido pulmonar com 20% do respectivo soro (10% de soro fetal bezerro e frango de 10% de soro) e em seguida permeabilize em PBS completadas e 3,75% Triton-X100 para 7 h à temperatura ambiente sob leve agitação.
3. Mancha as seções para 16 h a 4 ° C, com os anticorpos primários relevantes (MMP-9, H3Cit e F4/80) em 200 volumes µ l em tubos microcentrifuga (concentrações de anticorpos são listadas na Tabela de materiais).
4. Lave as seções em PBS, 3 vezes por 10 minutos antes da incubação com anticorpos secundários relevantes à temperatura ambiente por 1 h.
5. Mancha as seções de pulmão para DAPI (1:5, 000) na solução por 20 min, antes de adicionar as lamínulas para microscópio desliza em PBS.
6. Obter imagens de fluorescência usando um microscópio confocal invertido (40 x 1.3 NA) equipado com 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm e 635 nm de lasers.
7. Gravar o 3-d z-pilhas de 0,54 µm de espessura com z-corte ideal para o objectivo de óleo at 40 x 1.3.
   Nota: O software utilizado pode variar dependendo do microscópio individual. Um exemplo de como o software pode ser usado para um microscópio é fornecido no arquivo suplementar 1.

6. Análise de imagem

Nota: A análise de amostras requer o uso de software de análise de imagem específicos e exemplos estão listados na Tabela de materiais. Enquanto a análise dos resultados dependerá o programa específico utilizado, os pontos listados abaixo são importantes.

1. De amostras de análise de BAL
   1. Define o número de macrófagos, selecionando o canal azul para DAPI e atribuindo um tamanho mínimo para as células (por exemplo, > 18 µm de diâmetro). Usando o software relevante, medir o número total de macrófagos por campo.
   2. Contar o número de células que possuem as características de um MET pela presença de cromatina extracelular detectada pelo DAPI com expressão co de outros marcadores (por exemplo, MMP12, PAD2 e H3Cit).
      Nota: O número de marcadores que podem ser analisados depende do número de lasers disponíveis, mas idealmente além de DAPI, pelo menos, dois outros marcadores devem ser incluídos. Outros menos parâmetros específicos para expressão MET (por exemplo, o número de células com cromatina extracelular e um núcleo alargado) pode ser usado.
   3. Para comparar a expressão MET em BAL amostras (entre o controle, fumo e fumo/DNase Tratado grupos), analisar um mínimo de 100 macrófagos BAL por amostra.
   4. Para medir o anticorpo secundário e isotipo controlar níveis de fluorescência; medir um mínimo de 100 células em cada amostra para sua fluorescência. Medir o nível médio de fluorescência de fundo para cada marcador (por exemplo, H3Cit) usando o software padrão.
   5. Para definir a expressão do MET, contar as células com o fenótipo típico (por exemplo, cromatina extracelular com expressão co de H3Cit e MMP9) e para cada MET, medir o nível de fluorescência dos marcadores (por exemplo, H3Cit e MMP9). Excluir células produzindo METs se sua coloração não foi acima do fundo e do isotipo controle.
   6. Para amostras humanas de BAL, analisar um mínimo de 100 células para cada amostra para o percentual de macrófagos que fazem METs. Para amostras de murino, como as células são menores e METs são mais difíceis de definir, analisar um número maior de células para cada amostra (por exemplo, 200 macrófagos).
2. Análise de amostras de tecido de pulmão
   1. para determinar a presença de metástases no tecido pulmonar, use o marcador para macrófagos específicos tais como F4/80.
   2. Definir a presença de metástases no tecido pulmonar, usando a localização co de F4/80 em células que expressam extracelular cromatina com outros parâmetros, conforme listado na seção 6.1.
   3. Determinar os níveis de fluorescência de fundo em amostras com anticorpo secundário e os controles do isotipo. Excluir o METs de análise que não está acima do plano de fundo.

Resultados

Os METs podem ser visualizados de amostras de BAL, no tecido pulmonar e nas seções mais grossas de pulmão com imagens em 3D. Um exemplo de METs visualizado em uma amostra de BAL é mostrado na Figura 1. A morfologia do METs irá variar de acordo com seu estágio de maturação. A primeira característica detectável na microscopia é o movimento do núcleo à borda da célula. Isto é seguido por cromatina extracelular com outros mediadores co expressas, t...

Discussão

O método descrito nesta revisão é baseado em que usado para definir a presença de redes¹⁴. Os macrófagos são, de longe, o tipo de célula dominante em amostras de BAL... e este método de coleta é particularmente adequado para o estudo dos METs. Se células vermelhas do sangue estiverem presentes no BAL, estas células devem ser lysed usando cloreto de amônio. O procedimento de BAL geralmente irá ativar os macrófagos e, portanto, espera-se que haverá METs presentes em amostras não-esti...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human samples: Primary antibodies
Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)	Abcam	AB5103	10 ug/ml
Rabbit anti-human MMP12	Novus Biological	NB110-57214	1:100 concentration not quantifiable
Mouse anti-human MMP9	Novus Biological	AB119906	1:200 ascites, no concentration given
Rabbit anti-human PADI2/PAD2	Abcam	AB16478	7 ug/ml
Mouse anti-human PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 ug/ml
Sheep anti-human NE	LifeSpan Bioscience	LS-B4244	25 ug/ml
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse samples: Primary antibodies
Goat anti-mouse MMP9	Abcam	AF909	10 ug/ml
Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)	Abcam	AB5103	10 ug/ml
Rat anti-mouse F4/80	In-house (hybridoma)	In house	20 ug/ml
Sheep anti-human Anti-HNE /NE	Sapphire Bioscience	LS-B4244	25 ug/ml
Mouse anti-human ­­­­PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 ug/ml
Super-frost plus slides	Menzel	S41104A
Dapi-prolong gold	Molecular probes	P36931
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	85111
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	E9434
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary antibodies
Chicken anti-rabbit AF 488/	Life technologies	A-21441
Chicken anti-rabbit AF 594	Life technologies	A-21442
Chicken anti-goat AF 594	Life technologies	a-21468
Chicken anti-mouse AF488	Life technologies	A-21200
Donkey anti-sheep AF 594	Life technologies	A-11018
Chicken anti-mouse AF 647	Life technologies	A-21463
Donkey anti-sheep AF 594	Life technologies	A-11016
Isotype control
Rabbit IgG	In house
Rabbit IgG	In house
Mouse IgG1	BD Bioscience	550878
Rabbit IgG	In house
Mouse IgG2a	BioLegend	400201
Sheep IgG	In house
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software Programs
Imaris	Bitplane
Image J	NIH
To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopes
C1 Confocal scanning microscope	Nikon
FV1200 Confocal scanning microscope	Olympus
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue sources
Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre
Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media
RPMI	Sigma-Aldrich	r8758
Fetal calf serum	Sigma-Aldrich	F0926
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other reagents
Sudan black	Sigma-Aldrich	199664
paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative	Sigma-Aldrich	27387
Xylene	Sigma-Aldrich	214736
Ketamine	Sigma-Aldrich	K2753
Natural formalin	Sigma-Aldrich	42904
Paraffin	Sigma-Aldrich	327204
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576
Solvent 3B	Hi-Chem	2026
Coverslips 12 ml	Sigma-Aldrich	S1815
Coverslips 60 x 24 ml	Sigma-Aldrich	C6875
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
c57 black 6	Monash animal research platform (MARP)
BALB/c	MARP