Visualisation des pièges extracellulaires de Macrophage à l’aide de la microscopie confocale

Résumé

Macrophage pièges extracellulaires sont une entité nouvellement décrite. Cet article se concentre sur les méthodes de microscopie confocale et comment elles sont visualisées in vitro et in vivo des échantillons pulmonaires.

Résumé

Une méthode primaire utilisée pour définir la présence de pièges extracellulaires neutrophiles (filets) est la microscopie confocale. Nous avons modifié les méthodes de microscopie confocale établies afin de visualiser les pièges extracellulaires de macrophages (METs). Ces pièges extracellulaires sont définis par la présence de la chromatine extracellulaire avec co-expression d’autres composants tels que les protéases de granule et les histones citrullinés peptidyl arginase déiminase (PAD). L’expression des METs est généralement mesurée après exposition à un stimulus et par rapport aux échantillons non stimulés. Des échantillons sont également inclus pour le contrôle de fond et isotype. Les cellules sont analysées à l’aide de logiciels d’analyse des images bien définies. Microscopie confocale peut être utilisée pour définir la présence de METs in vitro et in vivo dans les tissus pulmonaires.

Introduction

Les pièges extracellulaires neutrophiles (filets), ont été d’abord décrit par Brinkmann et al. ¹ ils sont principalement produits en réponse à l’infection (en particulier aux bactéries) et ont un rôle important dans l’hôte défense^1,2. Ils ont également été décrits pour se produire en réponse aux maladies non infectieuses, y compris vascularite et lupus érythémateux disséminé (LED) ; et aux mitogènes phorbol 12-myrisate 13-acétate (PMA)^2,3. Il a été reconnu récemment que les autres types de cellules peuvent également produire pièges extracellulaires, tels que les macrophages. Pièges extracellulaires de macrophages (METs) ne sont pas encore une entité bien définie dans la littérature^4,5. Nous avons récemment établi des méthodes pour détecter la présence de METs aussi bien in vitro et in vivo,^6,7. Dans cet article, on décrira la mesure des METs à l’aide de la microscopie confocale.

Caractéristiques principales de NETosis qui la distinguent des autres voies cellulaires (par exemple l’apoptose⁸) sont l’extrusion de la chromatine en collaboration avec : (1) la citrullination d’histones (H3Cit)⁹, (2) la co-expression de protéases granule¹⁰ et (3) participation des peptidyl arginine déiminase (PAD) 4^11,12. Macrophages expriment aussi H3Cit, protéases de granule et PAD, et ces caractéristiques peuvent être utilisés pour définir la présence des METs.

METs peuvent avoir un rôle particulièrement important dans le poumon, comme les macrophages sont la cellule dominante présente dans les alvéoles et les voies respiratoires du poumon et a le rôle initial dans la direction de la réponse immunitaire cellulaire à l’infection/inflammation. En outre, même si une grande partie du poumon est vide (par exemple, dans les alvéoles), les METs sont potentiellement en mesure d’étendre dans l’espace disponible, contrairement aux organes solides.

La méthode la plus utilisée pour définir la présence de filets est par microscopie confocale. Il n’a pas encore un moyen clairement défini pour mesurer les METs. La technique de mesure des filets a été adaptée pour mesurer la présence des METs dans le présent protocole. Les principales exigences pour cette méthode sont les accès à la microscopie confocale et logiciels d’imagerie appropriées pour l’analyse.

Protocole

ce protocole suit approuvés dans des expériences : les humains (1) par l’éthique Comité de Monash Centre médical et les animaux (2) par le Comité d’éthique de l’Université de Melbourne.

1. Lavage broncho-alvéolaire (LBA) Macrophages

1. BAL d’usage pour obtenir les macrophages pulmonaires en : (1) homme soumet par bronchoscopie ⁶ et la souris (2) à l’aide d’aspiration trachéale intra ¹³ .
   NOTE : Acquisition des macrophages entraîne généralement une activation de ces cellules. Les macrophages proviennent de patients qui nécessitent une bronchoscopie pour enquêter sur un éventuel problème médical et pas tous les sujets peuvent convenir pour l’analyse des METs (cela devra être déterminé pour chaque projet).
   1. Prendre la solution de BAL et la centrifuger (500 x g pendant 10 min) pour former une boulette, laver deux fois avec le milieu de culture (Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) avec 5 % de sérum de veau foetal et 1 % L-glutamine) à température ambiante et puis diluer dans 4 mL de medi de culture des cellules Umm.
   2. Si nécessaire, demande officielle numération différentielle ; la plupart des cellules (généralement > 80 %) seront des macrophages ⁶.
      NOTE : Ceci sera généralement interprété par un service clinique histologie l’aspect morphologique des types différents de cellules ⁶.
   3. Effectue une cellule viable macrophage compte sur la solution de BAL utilisant le bleu Trypan exclusion et un hémocytomètre.
      NOTE : Solution de BAL est obtenue chez l’homme et de la souris comme indiqué à l’étape 1.1.
   4. Ajouter 1-4 x 10 ⁵ macrophages aux plaques 24 puits sur lamelles couvre-objet en 500 µL de milieu de culture par puits et laisser une nuit à 37 ° C ; les cellules respectera les lamelles couvre-objet. Pour les échantillons humains, ajouter des antibiotiques (par exemple, la pénicilline et la streptomycine, 10 ⁴ U/mL) pour prévenir la contamination bactérienne.

2. Immunofluorescence Labeling/microscopie des Macrophages BAL

Remarque : les cellules sont respectées sur les lamelles comme indiqué plus haut.

1. Enlever le milieu de culture et laver les cellules avec en solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Difficulté des cellules dans le fixateur de paraformaldéhyde/periodate/lysine (PLP) de 2 % pendant 10 min.
2. Laver les cellules brièvement dans du PBS et puis permeabilize à 0,2 % Tween 20 dans du PBS pendant 20 min.
3. Cellules de bloc de sérums de poulet 10 % à 5 % sérum d’albumine bovine (BSA) dilué dans du PBS pendant 30 min.
Anticorps
4. incuber avec contrôle primaire et isotype pendant 1 h à température ambiante à des concentrations de 1/100 (plus de détails spécifiques sont répertoriés dans la Table des matières) à 37 ° C.
   Remarque : Pour les échantillons de BAL, un marqueur spécifique des macrophages est habituellement pas nécessaire.
5. Après l’ajout d’anticorps primaires, laver les cellules dans du PBS et incuber encore avec l’anticorps secondaires correspondants pendant 40 min à température ambiante.
6. Laver les sections dans PBS et monter avec milieu de montage à base DAPI de visualisation en utilisant un microscope confocal (comme mentionné ci-dessus) au laser les excitations 405, 488, 561 et 647 nm et un 40 X, 1,0 NA huile objectif.

3. Des échantillons de tissus pulmonaires

Remarque : pour les études in vivo des tissus pulmonaires, étudier les échantillons après l’exposition pertinente (par exemple, tel que décrit par O ' Sullivan et al. ⁷). l’exposition qui est le plus pertinente pour cette expérience sont les micro-organismes infectieux, en particulier les bactéries. Les souches de souris qui pourraient être utilisés pour cette méthode sont les souris C57BL/6 ou BALB/c, 10-12 semaines, poids 25 à 30 g et mâle.

1. Euthanasier souris, via une injection intrapéritonéale de kétamine (400 mg/kg) et de xylazine (40 mg/kg). Ouvrir la cavité thoracique et exposer les poumons et le cœur à l’aide de ciseaux et pinces chirurgicales.
   1. En infusion chaude PBS à l’aide d’une aiguille de calibre 21 dans le ventricule droit de laver le sang des vaisseaux pour 30 s, puis laisser infuser 10 mL de fixateur PLP 2 % pendant 30 s (dans le ventricule droit).
   2. Utilisez chaud PBS (42 ° C) pour lavage de la cavité thoracique ouverte. Intubation de la trachée avec une aiguille de calibre 21 et un bout de tube de 0,8 mm coupé à la taille et à injecter 800 µL de préchauffé (à 42 ° C), à bas point de fusion point solution à 3 % d’agarose.
   3. Tie au large de la trachée avec de la soie tressée (USP 4.0). Placez le fil autour de la trachée, juste en dessous du point d’insertion de la canule et fixez-le via un nœud simple. Pour solidifier l’agarose, administrer des PBS glacée autour des poumons. Retirer les poumons et le cœur comme une pâté de maisons de la cavité thoracique à l’aide de ciseaux et dissection non tranchante. Retirez chaque poumon individuellement et puis corrigez-les pendant 16 h 2 % PLP ou formol à 4 ° C.
   4. Stocker les échantillons dans du PBS à 4 ° C jusqu’au tissu de sectionnement. Ces méthodes d’obtention des tissus pulmonaires ont été décrites précédemment ¹³.
2. Pour préparer le tissu pulmonaire échantillons utilisent les étapes suivantes.
   1. Tissus de tissus (réséqués à l’étape 3.1) fix pulmonaires dans 10 % de formol tamponné naturelles pendant 24 h à température ambiante. Transfert à 75 % d’éthanol et mettre dans un robot de tissu sur un cycle de 12 h, (2,5 h à 75 % EtOH, 3 h en EtOH absolue, 3,5 h à solvant 3 b et pendant 3 h à la paraffine).
   2. Embed en paraffine standard pour créer des blocs (FFIP) fixés au formol, paraffine, qui sont stockés à température ambiante.
      Remarque : À ce stade, il est généralement commode couper les sections de poumon pour lames standards.
   3. Couper les sections de poumon FFIP à 4-5 µm d’épaisseur à l’aide d’un microtome et monter sur facturé, enduits diapositives comme décrits par O ' Sullivan et al. ⁷
   4. montage de diapositives, mettre 3 gouttes de milieu de montage sur les lamelles de 60 x 24 mm (taille 1.5), inverser la diapositive sur la lamelle couvre-objet et faire sortir l’excès du milieu. Hermétiquement sceller avec du vernis à ongles et conserver à température ambiante.

4. Préparation/microscopie des échantillons de tissu de poumon

1. à la cire, réhydrater et prétraitement de l’échantillon de tissu de poumon FFIP avec la solution de l’antigène.
   1. Anhydre le FFIP glisse pendant 60 min à 60 ° C. Mettez ensuite les lames dans une solution de xylène pour 30 min et le transfert de solution d’éthanol 70 % pendant 5 min à température ambiante. Rincer à l’eau du robinet.
   2. Place dans une pellicule plastique résistant à la chaleur et sous réserve de la recherche d’HIER-antigène dans un autocuiseur pendant 10 min à 10 m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9,0. Cool pendant 20 min. Laver deux fois dans l’eau du robinet pendant 5 min sur un rocker, puis une fois avec du PBS sur base berçante.
   3. Bloc avec du sérum de poulet de 10 % à 5 % BSA/PBS pendant 30 min à température ambiante.
2. Tacher le tissu.
   1. Pour définir les METs dans les macrophages, ajouter des anticorps primaires (MMP-9, H3Cit et F4/80) à 1 % BSA/PBS pendant 16 h à 4 ° C à la dilution de 1/100 (des détails précis sur les quantités d’anticorps sont répertoriés dans la Table des matières). Laver deux fois avec du PBS pendant 5 min sur une base berçante.
   Anticorps
   2. Achieve détection par fluorescence par incubation avec secondaires correspondant à 1 % BSA/PBS pendant 40 min à température ambiante. Les anticorps sont : anti-souris poulet (1) 488 (vert), anti-chèvre poulet (2) 594 (rouge) et (3) âne anti-souris 647 (rouge sombre).
   3. Laver les sections dans du PBS et monter avec DAPI-contenant du milieu de montage pour la coloration de la chromatine.
3. Obtenir les images fluorescentes utilisant un laser confocal à balayage tête attachée à un microscope inversé. Lasers nm
   1. Excite la préparation avec la 405, 488, 561 et 647. Capturer des images de 512 x 512 pixels seul plan en cliquant sur la ligne séquentielle, nivellement button (2 ligne moyenne) à l’aide de 20 X 0,1 air de NA et NA 40 X 1.0 huile objectifs.
   2. Obtenir au moins dix champs de vue par la section d’analyse et de données pour chacun des résultats (c.-à-d. 10 haute puissance champs de vision (HFOV) pour le contrôle, 10 pour l’échantillon stimulée, etc., pour chaque souris).
      Remarque : Pour obtenir un échantillon représentatif de l’ensemble du domaine, un système de matrice peut être utilisé dans laquelle le domaine est divisé en différentes sections et pour chaque échantillon différent la même matrice est utilisée pour sélectionner des champs de vue (par exemple, le champ peut être divisé en 9 sections et sur le centre et les 4 coins, deux VOHF sont prélevés).

5. En trois dimensions (3d) imagerie de METs

Remarque : METs étant 3D structures, en prenant plusieurs z-pile des images, qui sont reconstituées, peuvent donner des informations précieuses.

1. Section les spécimens de poumon de blocs de paraffine, à 200 µm en utilisant un vibratome à une amplitude fixée à 1,8 mm et la vitesse de 0,1 à 0,5 mm/s.
2. Bloc de tissu pulmonaire avec 20 % du sérum respectif (10 % de sérum de veau foetal et le sérum de poulet 10 %) et ensuite permeabilize dans du PBS complétée et 3,75 % Triton X 100 de 7 h à température ambiante sous agitation modérée.
3. Tacher les sections pendant 16 h à 4 ° C avec les anticorps primaires pertinentes (MMP-9, H3Cit et F4/80) dans 200 µL de volume dans des tubes de microcentrifuge (concentrations d’anticorps sont répertoriées dans la Table des matières).
4. Laver les sections dans du PBS, 3 fois pendant 10 min avant l’incubation avec l’anticorps secondaires pertinents à température ambiante pendant 1 h.
5. Tacher les sections de poumon pour DAPI (1:5 000) dans la solution pendant 20 min, avant d’ajouter les lamelles au microscope slides dans du PBS.
6. Obtenir des images de fluorescence à l’aide d’un microscope confocal inversé (40 x 1.3 NA) équipé de 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm et 635 nm lasers.
7. Enregistrer 3D z-piles de 0,54 µm d’épaisseur avec z-découpe optimale pour l’objectif 40 x 1,3 à huile NA.
   Remarque : Le logiciel utilisé variera selon le microscope individuel. Un exemple de comment le logiciel peut être utilisé pour un microscope est fourni en supplémentaire 1 fichier.

6. Analyse d’image

Remarque : l’analyse des échantillons nécessite l’utilisation d’un logiciel d’analyse d’imagerie spécifique et exemples sont répertoriés dans la Table des matières. Alors que le programme spécifique utilisé dépendra de l’analyse des résultats, les points énumérés ci-dessous sont importants.

1. Analyse des BAL échantillons
   1. définir le nombre de macrophages en sélectionnant la couche bleue pour DAPI et en assignant une taille minimale pour les cellules (par exemple, > 18 µm de diamètre). Grâce au logiciel pertinent, mesurer le nombre de macrophages par domaine.
   2. Compter le nombre de cellules qui présentent les caractéristiques d’une EMU par la présence de chromatine extracellulaire détectée par DAPI avec co-expression d’autres marqueurs (par exemple, MMP12, PAD2 et H3Cit).
      Remarque : Le nombre de marqueurs qui peuvent être analysées dépend du nombre de lasers disponibles, mais idéalement en plus DAPI, au moins deux autres marqueurs doivent être inclus. Les autres produits moins les paramètres spécifiques à l’expression de la MET (p. ex., nombre de cellules avec la chromatine extracellulaire et un noyau élargi) peut être utilisé.
   3. Pour comparer l’expression MET en BAL échantillons (entre le contrôle, fumée et groupes de fumée/DNase traité), analysent un minimum de 100 macrophages BAL par exemple.
   4. Pour mesurer les anticorps secondaire et isotype contrôler les niveaux de fluorescence ; mesurer un minimum de 100 cellules dans chaque échantillon pour leur fluorescence. Mesurer le niveau moyen de la fluorescence de fond pour chaque marqueur (par exemple, H3Cit) à l’aide de logiciels standard.
   5. Pour définir l’expression MET, compter les cellules avec le phénotype typique (p. ex., chromatine extracellulaire avec la co-expression de H3Cit et MMP9) et pour chaque MET, mesurer le degré de fluorescence des marqueurs (par exemple, H3Cit et MMP9). Exclure les cellules produisant les METs si leur coloration n’était pas au-dessus du contrôle arrière-plan et isotype.
   6. Pour des échantillons humains de BAL, analyser un minimum de 100 cellules pour chaque échantillon pour le pourcentage des macrophages qui rendent les METs. Pour les échantillons murines, comme les cellules sont plus petites et les METs sont plus difficiles à définir, analyser un grand nombre de cellules pour chaque échantillon (par exemple, 200 macrophages).
2. L’analyse des échantillons de tissus pulmonaires
   1. pour déterminer la présence de METs dans les tissus pulmonaires, utilisez le marqueur spécifique de macrophages par exemple F4/80.
   2. Définir la présence des METs dans les tissus pulmonaires à l’aide de la co-localisation de F4/80 dans les cellules qui expriment la chromatine extracellulaire avec d’autres paramètres figurant à l’article 6.1.
   3. Déterminer les niveaux de fluorescence de fond dans les échantillons avec l’anticorps secondaire et les contrôles de l’isotype. Exclure les METs d’analyse qui ne sont pas au-dessus de fond.

Résultats

METs peuvent visualiser à partir d’échantillons de BAL, dans les tissus pulmonaires et dans les sections de poumon plus épaisses avec des images 3D. Un exemple de METs visualisées dans un échantillon de BAL est illustré à la Figure 1. La morphologie des METs variera selon leur stade de maturation. La première caractéristique décelable au microscope est le mouvement du noyau jusqu’au bord de la cellule. Elle est suivie d’une chromatine extracel...

Discussion

La méthode décrite dans la présente analyse est fondée sur celle utilisée pour définir la présence de filets¹⁴. Les macrophages sont de loin le type de cellule dominante dans les échantillons de BAL et cette méthode de collecte est particulièrement adaptée pour l’étude des METs. Si les globules rouges sont présents dans le BAL, ces cellules doivent être lysées par à l’aide de chlorure d’ammonium. La procédure de BAL généralement pour activer les macrophages et par conséqu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human samples: Primary antibodies
Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)	Abcam	AB5103	10 ug/ml
Rabbit anti-human MMP12	Novus Biological	NB110-57214	1:100 concentration not quantifiable
Mouse anti-human MMP9	Novus Biological	AB119906	1:200 ascites, no concentration given
Rabbit anti-human PADI2/PAD2	Abcam	AB16478	7 ug/ml
Mouse anti-human PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 ug/ml
Sheep anti-human NE	LifeSpan Bioscience	LS-B4244	25 ug/ml
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse samples: Primary antibodies
Goat anti-mouse MMP9	Abcam	AF909	10 ug/ml
Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)	Abcam	AB5103	10 ug/ml
Rat anti-mouse F4/80	In-house (hybridoma)	In house	20 ug/ml
Sheep anti-human Anti-HNE /NE	Sapphire Bioscience	LS-B4244	25 ug/ml
Mouse anti-human ­­­­PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 ug/ml
Super-frost plus slides	Menzel	S41104A
Dapi-prolong gold	Molecular probes	P36931
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	85111
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	E9434
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary antibodies
Chicken anti-rabbit AF 488/	Life technologies	A-21441
Chicken anti-rabbit AF 594	Life technologies	A-21442
Chicken anti-goat AF 594	Life technologies	a-21468
Chicken anti-mouse AF488	Life technologies	A-21200
Donkey anti-sheep AF 594	Life technologies	A-11018
Chicken anti-mouse AF 647	Life technologies	A-21463
Donkey anti-sheep AF 594	Life technologies	A-11016
Isotype control
Rabbit IgG	In house
Rabbit IgG	In house
Mouse IgG1	BD Bioscience	550878
Rabbit IgG	In house
Mouse IgG2a	BioLegend	400201
Sheep IgG	In house
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software Programs
Imaris	Bitplane
Image J	NIH
To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopes
C1 Confocal scanning microscope	Nikon
FV1200 Confocal scanning microscope	Olympus
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue sources
Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre
Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media
RPMI	Sigma-Aldrich	r8758
Fetal calf serum	Sigma-Aldrich	F0926
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other reagents
Sudan black	Sigma-Aldrich	199664
paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative	Sigma-Aldrich	27387
Xylene	Sigma-Aldrich	214736
Ketamine	Sigma-Aldrich	K2753
Natural formalin	Sigma-Aldrich	42904
Paraffin	Sigma-Aldrich	327204
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576
Solvent 3B	Hi-Chem	2026
Coverslips 12 ml	Sigma-Aldrich	S1815
Coverslips 60 x 24 ml	Sigma-Aldrich	C6875
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
c57 black 6	Monash animal research platform (MARP)
BALB/c	MARP