Visualización de macrófagos trampas extracelular mediante Microscopía Confocal

Resumen

Las trampas extracelulares macrófago son una entidad nuevamente descrita. Este artículo se centrará en los métodos de microscopía confocal y cómo son visualizados en vitro y en vivo de las muestras de pulmón.

Resumen

Un método primario utilizado para definir la presencia de neutrófilos trampas extracelulares (redes) es la microscopia confocal. Hemos modificado microscopía confocal establecido métodos para visualizar las trampas extracelulares del macrófago (MET). Estas trampas extracelulares se definen por la presencia de cromatina extracelular con coexpresión de otros componentes como gránulo proteasas, las histonas citrulinado y peptidil arginasa deiminase (PAD). La expresión de METs es generalmente medida después de la exposición a un estímulo y en comparación con muestras no estimuladas. Las muestras también se incluyen para el control del fondo y el isotipo. Las células son analizadas utilizando el software de análisis de imagen bien definida. La microscopia confocal puede utilizarse para definir la presencia de METs en vitro y en vivo en el tejido pulmonar.

Introducción

Neutrófilos trampas extracelulares (redes), primero fueron descritos por Brinkmann et al. ¹ que predominantemente se producen en respuesta a la infección (especialmente a las bacterias) y tienen un papel importante en host defense^1,2. También se han descrito para ocurrir en respuesta a enfermedades no infecciosas, incluyendo vasculitis y lupus eritematoso sistémico (les); y a los mitógenos forbol 12-myrisate 13-acetato (PMA)^2,3. Se ha reconocido recientemente que otros tipos celulares pueden también producir trampas extracelulares, incluyendo los macrófagos. Trampas extracelulares del macrófago (MET) todavía no son una entidad bien definida en la literatura^4,5. Recientemente hemos establecido los métodos para detectar la presencia de METs tanto in vitro e in vivo^6,7. En este artículo, se describen la medida de METs usando microscopia confocal.

Características clave de NETosis que la distinguen de otras vías celulares (tales como apoptosis⁸) son la extrusión de la cromatina en relación con: (1) citrullination de histonas (H3Cit)⁹, (2) la expresión de proteasas de gránulo¹⁰ y (3) participación de peptidil arginina deiminase (PAD) 4^11,12. Macrófagos también expresan H3Cit, proteasas de gránulo y almohadilla, y estas características pueden utilizarse para definir la presencia de METs.

METs de pueden tener un papel particularmente importante en el pulmón, como el macrófago es la célula dominante presente en los alvéolos y las vías respiratorias del pulmón y tiene la función inicial en la dirección del cellular la respuesta inmune a la infección/inflamación. Además, mientras que gran parte del pulmón es espacio vacío (por ejemplo, dentro de los alvéolos), los METs son potencialmente capaces de expandirse en el espacio disponible, a diferencia de órganos sólidos.

El método más utilizado para definir la presencia de redes es mediante microscopía confocal. Aún no existe una forma claramente definida para medir METs. La técnica para la medición de redes ha sido adaptada para medir la presencia de METs en el presente Protocolo. Los principales requisitos para este método son el acceso a la microscopia confocal y el software apropiado de imágenes para análisis.

Protocolo

este protocolo sigue experimentos aprobados en: (1) los seres humanos por el Comité de ética de Monash Medical Centre y (2) animales por el Comité de ética de la Universidad de Melbourne.

1. macrófagos de lavado broncoalveolar (BAL)

1. BAL de uso para obtener los macrófagos del pulmón en: (1) humanos sujetos por broncoscopia ⁶ y (2) ratones utilizando aspiración intra traqueal ¹³ .
   Nota: La adquisición de los macrófagos generalmente hace algunos activación de estas células. Los macrófagos se obtienen de pacientes que requieren una broncoscopia para investigar un problema médico y no todos los temas pueden ser adecuados para el análisis de METs (esto deberá ser determinado para cada proyecto individual).
   1. Tomar la solución BAL y el giro de (500 x g por 10 min) para formar una pelotilla, lavar dos veces con medio de cultivo (Roswell Park Memorial Institute medio (RPMI) con suero de ternera fetal de 5% y 1% L-glutamina) a temperatura ambiente y luego diluir las células en 4 mL de cultura medi Um.
   2. Si es necesario, mediante solicitud formal cuenta diferencial; la mayoría de las células (generalmente > 80%) serán los macrófagos ⁶.
      Nota: Esto será generalmente interpretado por un servicio de histología clínica utilizando la apariencia morfológica de las células diferentes tipos ⁶.
   3. Realizar una célula macrófago viable contar con la solución BAL mediante exclusión del azul tripán y un hemocitómetro.
      Nota: Solución BAL se obtiene de los seres humanos y ratones como se menciona en el paso 1.1.
   4. Agregar de 1-4 x 10 ⁵ macrófagos para placas de 24 pocillos en cubreobjetos en 500 μl de medio de cultivo por pozo y dejar toda la noche a 37 ° C, las células se adhieran al cubreobjetos. Para muestras humanas, añadir antibióticos (p. ej., penicilina y estreptomicina, 10 ⁴ U/mL) para prevenir la contaminación bacteriana.

2. Etiquetado/microscopia de la inmunofluorescencia de los macrófagos de BAL

Nota: las células se adhieren sobre cubreobjetos según lo mencionado arriba.

1. Lave las células una vez con tampón fosfato salino (PBS) y el medio de cultivo. Fijar las células en fijador de paraformaldehido periodato/lisina (PLP) de 2% durante 10 minutos
2. Lavar las células brevemente en PBS y luego permeabilizar en 0.2% Tween 20 en PBS durante 20 min
3. Células de bloque con sueros de pollo 10% en 5% albúmina de suero bovino (BSA) diluido en PBS durante 30 minutos
4. Incubar con control primario y el isotipo de anticuerpos por 1 h a temperatura ambiente en concentraciones de 1: 100 (detalles más específicos se enumeran en la Tabla de materiales) a 37 ° C.
   Nota: Las muestras de BAL, un marcador específico de macrófagos generalmente no es necesario.
5. Después de la adición de anticuerpos primarios, lave las células en PBS e incubar más con los correspondientes anticuerpos secundarios durante 40 min a temperatura ambiente.
6. Lavar las secciones en PBS y Monte con medio de montaje basado en DAPI de visualización mediante un microscopio confocal (como se mencionó anteriormente) en laser excitaciones 405, 488, 561 y 647 nm y 40 X, 1,0 NA aceite objetivo.

3. Muestras de tejido pulmonar

Nota: para los estudios en vivo del tejido pulmonar, estudio de las muestras después de la exposición relevante (por ejemplo, según lo descrito por O ' Sullivan et al. ⁷). la exposición que es más relevante para este experimento son microorganismos infecciosos, especialmente bacterias. Cepas de ratón que podrían ser utilizadas para este método son hombre, ratones C57BL/6 y BALB/c, 10-12 semanas de edad y peso 25-30 g.

1. Euthanize ratones, a través de una inyección intraperitoneal de ketamina (400 mg/kg) y xilacina (40 mg/kg). Abrir la cavidad torácica y exponer los pulmones y el corazón usando tijeras y pinzas quirúrgicas.
   1. Infundir PBS caliente usando una aguja de calibre 21 en el ventrículo derecho para lavar la sangre de los vasos por 30 s, luego infundir 10 mL de fijador PLP 2% durante 30 s (en el ventrículo derecho).
   2. Usar caliente PBS (42 ° C) para lavado de la cavidad torácica abierta. Intubar la tráquea con una aguja de calibre 21 y un pedazo de 0,8 mm tubo cortado a la medida e inyectar 800 μl de precalentado (hasta 42 ° C), bajo punto de fusión punto de solución de agarosa al 3%.
   3. Lazo frente a la tráquea con seda trenzada (4.0 USP). Coloque el hilo alrededor de la tráquea, justo debajo del punto de inserción de la cánula y garantizar por medio de un nudo simple. Para que solidifique la agarosa, administrar PBS helado alrededor de los pulmones. Retire los pulmones y el corazón como a una cuadra de la cavidad torácica, usando tijeras y disección Roma. Quite individualmente cada pulmón y luego fijarlos por 16 h en 2% PLP o formalina al 4 ° C.
   4. Almacenar a los especímenes en PBS a 4 ° C hasta el tejido seccionado. Estos métodos de obtención de tejido pulmonar han sido previamente descritos ¹³.
2. Para preparar el tejido pulmonar las muestras utilizan los pasos siguientes.
   1. Fix pulmón tejidos (resecados en el paso 3.1) del tejido en formalina 10% de tampón natural durante 24 h a temperatura ambiente. Transferencia de 75% de etanol y coloque en un procesador de tejidos en un ciclo de 12 h, (2.5 h en 75% EtOH, 3 h en EtOH absoluto, 3,5 h en solvente 3B y 3 h en parafina).
   2. Embed en parafina estándar para crear formalina-fijos, parafina-encajado (FFPE) los bloques que se almacenan a temperatura ambiente.
      Nota: En esta etapa, es generalmente conveniente cortar las secciones del pulmón para portaobjetos estándar.
   3. Cortar las secciones del pulmón FFPE en 4-5 μm de espesor utilizando un micrótomo y Monte en carga, portaobjetos recubiertos como se describió anteriormente o ' Sullivan et al. ⁷
   4. montar diapositivas, poner 3 gotas de medio de montaje de 60 mm x 24 mm cubreobjetos (tamaño 1.5), invertir la diapositiva sobre el cubreobjetos y empuje hacia fuera exceso medio. Herméticamente sellado con esmalte de uñas y almacenar a temperatura ambiente.

4. Preparación/microscopia de muestras de tejido pulmonar

1. a la cera, rehidratar y prepare la muestra de tejido de pulmón FFPE con solución de recuperación de antígeno.
   1. Horno seco el FFPE desliza durante 60 min a 60 ° C. Luego que los portaobjetos en solución de xileno durante 30 min y la transferencia de solución de etanol 70% por 5 min a temperatura ambiente. Enjuague en agua del grifo.
   2. Lugar en envoltura plástica resistente al calor y recuperación de HIER-antígeno en una olla a presión durante 10 minutos en 10 m/mol/L Tris, pH 9.0 de 1 mmol/EDTA. Fresco durante 20 min lavado dos veces en agua corriente durante 5 minutos en un rockero, luego una vez con PBS en rocker.
   3. Bloque con suero de pollo 10% 5% BSA/PBS por 30 min a temperatura ambiente.
2. Manchar el tejido.
   1. Definir METs en macrófagos, añadir anticuerpos primarios (MMP-9, H3Cit y F4/80) en el 1% BSA/PBS durante 16 horas a 4 ° C en la dilución 1/100 (detalles específicos sobre cantidades de anticuerpos aparecen en la Tabla de materiales). Lave dos veces con PBS durante 5 minutos en un eje de balancín de.
   Anticuerpos
   2. lograr detección fluorescente por la incubación con secundario correspondiente en 1% BSA/PBS durante 40 min a temperatura ambiente. Los anticuerpos son: anti-ratón (1) pollo 488 (verde), (2) pollo contra cabra 594 (rojo) y anti-ratón (3) el burro (ahora rojos) 647.
   3. Lavar las secciones en PBS y Monte con DAPI que contiene el medio de montaje para la tinción de la cromatina.
3. Obtener imágenes fluorescentes usando un láser confocal de barrido cabeza conectada a un microscopio invertido. Láseres de
   1. Excite la preparación con 405, 488, 561 y 647 nm. Capturar imágenes de 512 x 512 píxeles de plano solo haciendo clic en la línea secuencial, nivelación de botón (2 promedio de la línea) usando 20 X 0.1 aceite aire NA y NA 40 X 1.0 objetivos.
   2. Obtener por lo menos diez campos de vista por la sección de análisis de datos y para cada resultado (es decir, alta potencia 10 campos de vista (HFOV) para el control, 10 para la muestra estimulada, etc., para cada ratón).
      Nota: Para obtener una muestra representativa de todo el campo, un sistema de matriz puede utilizarse en los que se divide el campo en diferentes secciones y para cada muestra diferente de la misma matriz se utiliza para seleccionar campos de vista (por ejemplo, el campo se puede dividir en 9 secciones, y desde el centro y las 4 esquinas, se toman dos VOAF).

5. Tridimensional (3D) imagen de METs

Nota: METs son estructuras 3-d, tomando z-stack múltiples imágenes, que se reconstituyen, pueden dar valiosa información.

1. Sección las muestras de pulmón de bloques de parafina, a 200 μm con un vibratome a una amplitud de 1,8 mm y velocidad de 0.1-0.5 mm/s.
2. Bloque de tejido pulmonar con 20% de suero correspondiente (10% de suero de ternero fetal y suero de pollo 10%) y luego permeabilizar en PBS suplido y 3,75% Triton-X 100 de 7 h a temperatura ambiente en agitación suave.
3. Mancha las secciones de 16 h a 4 ° C con los anticuerpos primarios pertinentes (MMP-9, H3Cit y F4/80) en volúmenes de 200 μL en tubos de microcentrífuga (concentraciones de anticuerpos aparecen en la Tabla de materiales).
4. Lávese las secciones en PBS 3 veces durante 10 minutos antes de la incubación con los anticuerpos secundarios relevantes a temperatura ambiente durante 1 h.
5. Mancha las secciones del pulmón para DAPI (1:5, 000) en la solución por 20 min, antes de agregar el cubreobjetos al microscopio portaobjetos en PBS.
6. Obtención de imágenes de fluorescencia utilizando un microscopio confocal invertido (40 x 1,3 NA) equipado con 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm y láseres de 635 nm.
7. Grabar 3D z-pilas de 0.54 μm de grosor con el seccionamiento de z óptimo para el objetivo de 40 x 1,3 NA aceite.
   Nota: El software utilizado variará dependiendo del microscopio individual. Un ejemplo de cómo el software se puede utilizar para un microscopio se proporciona en archivo adicional 1.

6. Análisis de imagen

Nota: el análisis de las muestras requiere el uso de software de análisis de imágenes específicas y los ejemplos se enumeran en la Tabla de materiales. Mientras que el análisis de los resultados dependerá del programa específico utilizado, los puntos enumerados a continuación son importantes.

1. Las muestras de análisis de BAL
   1. definir el número de macrófagos, seleccione el canal azul para DAPI y asignar un tamaño mínimo para las células (p. ej., > 18 μm de diámetro). El software relevantes, medir el número de macrófagos por campo.
   2. Cuenta el número de células que tienen las características de un MET por la presencia de cromatina extracelular detectada por DAPI con coexpresión de marcadores (por ejemplo, MMP12, PAD2 y H3Cit).
      Nota: El número de marcadores que pueden ser analizadas depende del número de láseres disponibles, pero idealmente además de DAPI, por lo menos dos otros marcadores deben ser incluidos. Otras menos parámetros específicos para la expresión de MET (p. ej., número de células con un núcleo agrandado y cromatina extracelular) se puede utilizar.
   3. Para comparar la expresión MET BAL muestras (entre el control, humo y humo/DNasa tratado grupos), analizan un mínimo de 100 macrófagos BAL por ejemplo.
   4. Para medir el anticuerpo secundario e isotipo controlar los niveles de fluorescencia; medir un mínimo de 100 células en cada muestra de su fluorescencia. Medir el nivel medio de la fluorescencia de fondo para cada marcador (por ejemplo, H3Cit) utilizando el software estándar de.
   5. Para definir expresión MET, contar las células con el fenotipo típico (e.g., cromatina extracelular con coexpresión de H3Cit y MMP9) y para cada MET, medir el nivel de fluorescencia de marcadores (por ejemplo, H3Cit y MMP9). Excluir las células produciendo METs si su coloración no era sobre el control de fondo e isotipo.
   6. Para muestras humanas de BAL, analizar un mínimo de 100 células por cada muestra el porcentaje de macrófagos que hacen METs. Para las muestras de murinas, como las células son más pequeñas y METs son más difíciles de definir, analizar un mayor número de células por cada muestra (p. ej., 200 macrófagos).
2. Análisis de muestras de tejido pulmonar
   1. para determinar la presencia de METs en tejido pulmonar, utilice el marcador de macrófagos específicos como F4/80.
   2. Definir la presencia de METs en tejido pulmonar por medio de la co-localización de F4/80 en las células que expresan la cromatina extracelular con otros parámetros que se enumeran en la sección 6.1.
   3. Determinar los niveles de fluorescencia en muestras con anticuerpo secundario del fondo y los controles de isotipo. Excluir METs del análisis que sobre el fondo.

Resultados

METs se pueden visualizar de muestras de BAL, en tejido pulmonar y en secciones gruesas de pulmón con imágenes 3D. En la figura 1se muestra un ejemplo de METs visualizado en una muestra de BAL. La morfología de los METs variarán según su etapa de maduración. La primera característica detectable en microscopia es el movimiento del núcleo al borde de la celda. Esto es seguido por cromatina extracelular con otros mediadores Co expresados, como proteasas ...

Discusión

El método descrito en este informe se basa en que para la determinación de la presencia de redes¹⁴. Los macrófagos son el tipo celular dominante en muestras de BAL y este método de colección es especialmente adecuado para el estudio de METs. Si glóbulos rojos están presentes en el BAL, estas células deben lisis mediante el uso de cloruro de amonio. El procedimiento de BAL generalmente activa los macrófagos y por lo tanto se espera que habrá METs presentes en las muestras no estimuladas. ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human samples: Primary antibodies
Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)	Abcam	AB5103	10 ug/ml
Rabbit anti-human MMP12	Novus Biological	NB110-57214	1:100 concentration not quantifiable
Mouse anti-human MMP9	Novus Biological	AB119906	1:200 ascites, no concentration given
Rabbit anti-human PADI2/PAD2	Abcam	AB16478	7 ug/ml
Mouse anti-human PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 ug/ml
Sheep anti-human NE	LifeSpan Bioscience	LS-B4244	25 ug/ml
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse samples: Primary antibodies
Goat anti-mouse MMP9	Abcam	AF909	10 ug/ml
Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)	Abcam	AB5103	10 ug/ml
Rat anti-mouse F4/80	In-house (hybridoma)	In house	20 ug/ml
Sheep anti-human Anti-HNE /NE	Sapphire Bioscience	LS-B4244	25 ug/ml
Mouse anti-human ­­­­PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 ug/ml
Super-frost plus slides	Menzel	S41104A
Dapi-prolong gold	Molecular probes	P36931
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	85111
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	E9434
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary antibodies
Chicken anti-rabbit AF 488/	Life technologies	A-21441
Chicken anti-rabbit AF 594	Life technologies	A-21442
Chicken anti-goat AF 594	Life technologies	a-21468
Chicken anti-mouse AF488	Life technologies	A-21200
Donkey anti-sheep AF 594	Life technologies	A-11018
Chicken anti-mouse AF 647	Life technologies	A-21463
Donkey anti-sheep AF 594	Life technologies	A-11016
Isotype control
Rabbit IgG	In house
Rabbit IgG	In house
Mouse IgG1	BD Bioscience	550878
Rabbit IgG	In house
Mouse IgG2a	BioLegend	400201
Sheep IgG	In house
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software Programs
Imaris	Bitplane
Image J	NIH
To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopes
C1 Confocal scanning microscope	Nikon
FV1200 Confocal scanning microscope	Olympus
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue sources
Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre
Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media
RPMI	Sigma-Aldrich	r8758
Fetal calf serum	Sigma-Aldrich	F0926
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other reagents
Sudan black	Sigma-Aldrich	199664
paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative	Sigma-Aldrich	27387
Xylene	Sigma-Aldrich	214736
Ketamine	Sigma-Aldrich	K2753
Natural formalin	Sigma-Aldrich	42904
Paraffin	Sigma-Aldrich	327204
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576
Solvent 3B	Hi-Chem	2026
Coverslips 12 ml	Sigma-Aldrich	S1815
Coverslips 60 x 24 ml	Sigma-Aldrich	C6875
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
c57 black 6	Monash animal research platform (MARP)
BALB/c	MARP